酱香型白酒独具酱香风味，具有风味持久、空杯留香的独特之处[1]。富含高淀粉的高粱经过高温蒸煮、拌曲、高温堆积富集了大量发酵所需微生物后进入窖池发酵，经过蒸馏得到醇香的酱香型白酒。粮为酒本，曲为酒骨，大曲是酱酒的风格和风情的重要来源[2-3]。酱香大曲主要以纯小麦为原料，经过高温培养、粉碎、踩曲等过程而制成，过程中富集了大量可以促进发酵的微生物，发挥糖化和酒化作用，是酱酒酿造过程中微生物的重要来源之一[4-6]。这些微生物及其产物可作用于原料中的有机酸、蛋白质等物质，产生酱香、窖底香、醇甜香等风味特征[7-8]。
放线菌在酱香型白酒酿造过程中相对含量占比较大，茅台技术中心微生物室曾对茅台酒厂周边生态环境中的微生物进行了全面筛选分析，共得到微生物147种，其中：细菌53种、酵母11种、霉菌49种、放线菌34种，放线菌占比约1/4，是普遍存在于酿酒环境中的主要核心微生物之一，在白酒酿造过程中可以丰富白酒中的风味成分，使其具有白酒风味特征作用[9]。随着酱香型白酒关注度不断提高，酱香型高温大曲中高温放线菌的研究也逐渐增加，研究重点主要是集中在贵州、四川等南方产区，开展来源于大曲、酒醅、窖泥、窖池等样品中的微生物的筛选、代谢及应用。李豆南等[10]从高温大曲中筛选得到一株高温放线菌，发现其可代谢产生较高含量的吡嗪类物质，为酱香型白酒的风味作出较大贡献；有研究[11]也发现一些嗜热放线菌以产酯类、萜烯类和吡嗪类物质为主；还有一些关于放线菌产酶情况的研究[12]；且放线菌某些独特代谢产物带有土霉异味，白酒中的土霉异味大多来源于放线菌[13]，对白酒风味的影响不可忽视。相较于南方产区的酱香型白酒风味特征，山东、辽宁等北方产区生产的酱香型白酒的风味有所不同[14]，究其根本原因在于南北方地区酱香型白酒酿造过程中环境微生物的差异，酿造过程、不同原料、酿造环境均可导致微生物代谢产生酱香型白酒风味物质的不同。因此，通过传统筛选方法从北方白酒产区的高温大曲中筛选放线菌株，并对其生理生化特性及固态发酵产风味特性进行检测分析，为北方地区酱香型白酒酒体风味提高和高温放线菌研究提供重要的参考价值。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
原料筛选利用酒醅与生产用大曲，所用大曲来自北京华都食品酿酒有限责任公司车间酿造用高温大曲，分别随机采取曲房内不同位置大曲后粉碎混匀，放于自封袋中保存；取堆积第5天顶部酒醅混匀，放于自封袋中，于4℃冰箱中保存备用。
1.1.2 试剂
可溶性淀粉（分析纯）：山东德彦化工有限公司；硝酸钾、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、氯化钠、氢氧化钠、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、硫酸铵、碳酸钙（均为分析纯）：福晨（天津）化学试剂有限公司；四水氯化锰、琼脂粉、七水硫酸锌（均为分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；L-天门冬氨酸（BR）、D-果糖、蔗糖、木糖、葡萄糖、D-棉子糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-海藻糖、L-鼠李糖（均为分析纯）：北京百瑞极生物科技有限公司；麦芽糖（分析纯）：北京拜尔迪生物技术有限公司；甘油（分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；石蕊牛乳培养基：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。
1.1.3 培养基
高氏一号培养基（GS）（g/L）：可溶性淀粉 20.0 g、KNO31.0 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、琼脂 20.0 g，pH7.2～7.4。
国际链霉菌计划（international streptomyces projects，ISP）2 培养基（g/L）：酵母膏 4 g、麦芽汁 10.0 g、葡萄糖 4.0 g、琼脂 20.0 g、蒸馏水 1 000 mL，pH7.0～7.2。
ISP3培养基（g/L）：燕麦粉20.0 g、微量元素溶液（FeSO4·7H2O 0.01 g、MnCl2·4H2O 0.1 g、ZnSO4·7H2O 0.1 g、蒸馏水 1 000 mL）1 mL、琼脂 20.0 g、蒸馏水1 000 mL、pH7.2。
ISP4培养基（g/L）：可溶性淀粉10.0g、K2HPO41.0g、MgSO4·7H2O 1.0 g、NaCl 1.0 g、（NH4）2SO42.0 g、CaCO3 2.0 g、FeSO4·7H2O 0.001 g、MnCl2·4H2O 0.001 g、琼脂20.0 g、蒸馏水 1 000 mL，pH7.0～7.2。
ISP5培养基（g/L）：L-天门冬氨酸1.0g、甘油10.0g、K2HPO41.0 g、微量元素溶液（同ISP3培养基）1 mL、琼脂 20.0 g、蒸馏水 1 000 mL，pH7.0～7.2。
GTY 培养基（g/L）：葡萄糖 1.0 g、胰蛋白胨 0.5 g、酵母粉 2.0 g、CaCO31.0 g、琼脂 20.0 g、蒸馏水 1 000 mL，pH自然。
明胶水解试验培养基（g/L）：NaCl 5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、明胶 120.0 g、牛肉膏 3.0 g，蒸馏水 1 000 mL，pH7.2～7.4，121 ℃灭菌 30 min。
石蕊牛乳试验培养基：10.167 g石蕊牛乳培养基，加入100 mL水，加热溶解，121℃下灭菌15 min。
硝酸盐利用培养基：KNO31.0 g、牛肉膏3.0 g、蛋白胨 10.0 g、NaCl 5.0 g、琼脂 20.0 g、蒸馏水 1 000 mL，pH7.0～7.6
纤维素分解培养基：蛋白胨5.0 g、NaCl 5.0 g、纤维素粉 8.0 g、琼脂 20.0 g、蒸馏水 1 000 mL，pH7.0～7.2。
硫化氢试验培养基（g/L）：NaCl 5.0 g、胰蛋白胨25.0 g、明胶 120.0 g、牛肉膏 7.5 g、pH7.0，115 ℃灭菌20 min，加 5 mL 10%FeSO4·7H2O（0.22 μm 滤膜过滤除菌）。
碳源同化培养基（g/L）：牛肉膏5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、NaCl 3.0 g、Na2HPO42.0 g，112 ℃灭菌 30 min。
固态发酵培养基（麦麸）：50 g麸皮放于250 mL锥形瓶中，加入50 mL水后，121℃灭菌20 min。
Luria-Bertani培养基（LB）：胰蛋白胨 10.0g、酵母提取物 5.0 g、NaCl 10.0 g、琼脂 20.0 g、蒸馏水 1 000 mL。
1.2 仪器与设备
TGL-16B高速台式离心机:上海安亭科学仪器厂；SPX-250生化培养箱:中仪国科（北京）科技有限公司；THZ-98AB恒温振荡培养箱:上海一恒科学仪器有限公司；YXQ-LS-50SⅡ立式压力蒸汽灭菌器:上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；KLCZ-1360A超净工作台：北京亚泰科隆仪器技术有限公司；YP202N电子天平：上海菁海仪器有限公司；721可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；2720聚合酶链式反应仪（polymerase chain reaction，PCR）：美国应用生物系统公司。
1.3 试验方法
1.3.1 样品处理
1）常温保存的大曲。
2）干热处理：取50 g常温保存的大曲于烧杯中，将其置于100℃烘箱中干燥2 h。
3）富集菌株处理：取20 g大曲、20 g酒醅于烧杯中，加入4 g CaCO3，加入无菌水2 mL摇匀，置于28℃下富集培养，分别在3 d和7 d时取10 g样品进行梯度稀释。
4）抑制剂的添加：在3种基础筛选培养基（LB培养基、ISP2培养基、GS培养基）中加入浓度为50 mg/mL的萘啶酮酸和20 mg/mL的两性霉素以抑制细菌和霉菌的生长。
1.3.2 分离筛选
分别取不同预处理方式的样品10 g放于带有玻璃珠的250 mL锥形瓶中，加入90 mL无菌生理盐水，于50℃下180 r/min振荡30 min。取1 mL的上清液梯度稀释，稀释浓度为 10-1～10-6，选取 10-4～10-63 个浓度进行平板涂布，每个梯度吸取0.2 mL菌悬液涂布于固体平板培养基上。培养基选择ISP2、高氏一号以及GTY 3种基础培养基。
1.3.3 菌株的鉴定
1.3.3.1 菌株形态学观察
将活化后的菌株在固体平板培养基上进行划线，在液体培养基中扩培，固体平板培养基于50℃下静置培养48 h，液体培养基于50℃下180 r/min振荡48 h后，观察其在固体平板培养基和液体培养基中的生长情况。
1.3.3.2 菌株生理生化鉴定
对筛选得到的放线菌进行明胶液化试验、牛奶凝固与胨化试验、硝酸盐还原试验、纤维素水解试验、硫化氢试验、碳源同化试验[15]，并参照《伯杰士细菌鉴定手册》[16]进行结果观察。
1.3.3.3 菌株分子生物学鉴定
将活化后的菌株接种于LB中，在50℃的条件下以180 r/min的转速培养48 h。采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取初筛获得的高产淀粉酶菌株的基因组 DNA，采用通用引物 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′） 和 1492R （5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）扩增16S rDNA序列，PCR反应体系：LA PCR Buffer 2.5 μL、引物各 0.5 μL、脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）2 μL、LAtaq酶 0.2 μL、DNA 0.5 μL，用 ddH2O 11 μL。PCR 扩增程序：94℃预变性10 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共29次循环，最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检验。
1.3.3.4 序列测定及系统发育树的构建
PCR扩增产物送至北京奥科生物技术有限责任公司测序，测序结果在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上进行BLAST同源性比对，使用MEGA 7.0生物学软件对近似序列进行比对分析，利用Neighbor-Joining方法构建系统发育树。
1.3.4 菌株的耐受性测定试验
1.3.4.1 种子液的制备
取在甘油管中保存的菌液0.2 mL于50 mL的ISP2液体培养基中，于30℃下180 r/min振荡培养24 h。
1.3.4.2 菌株耐受性试验
将3株高温放线菌种子液按照5%接种量接种至50 mL 的不同 pH 值（1～13）、不同温度（30、35、40、45、50、55、60℃）、不同盐浓度（0%～21%）和不同乙醇浓度（0%～21%）的液态培养基培养24 h，测定OD600下的吸光值；将3株高温放线菌种子液按照5%接种量接种至不同水分含量固态培养基中发酵5 d，采用平板计数法测定不同水分含量培养基中高温放线菌的数量。
1.3.5 菌株的发酵风味特性分析
在灭菌后的发酵培养基中按每瓶按体积质量比10%（10 mL/100 g）加入种子液（用分光光度计测定种子液的OD值，OD600=0.5），为模拟实际窖池发酵情况，按25℃-30℃-35℃-40℃-50℃进行升温发酵，每一温度条件下发酵48 h，每48 h取10 g样品测定风味物质并闻香，另取10 g进行梯度稀释涂布，验证菌株存在于整个发酵过程中。
1.3.5.1 样品前处理
称取2 g酒醅于顶空气相小瓶中，加入5 mL饱和食盐水，加入8 μL内标物质（浓度为1 g/L的4-辛醇），加封口膜密封，80℃水浴超声10 min。将萃取头插入气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）联用仪进样口，老化 30 min。将老化后的萃取头插入顶空瓶中吸附30 min，移入气相色谱的高温汽化室中解吸5 min，进行GC-MS分析。
1.3.5.2 气相色谱-质谱条件
气相色谱条件：毛细管色谱柱为DB-WAX（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；不分流进样，进样口温度 250℃；程序升温40℃，保留3 min，以2℃/min的速率升至100℃，保留5min；再以2℃/min升至150℃，稳定3min；最后以10℃/min升至280℃，稳定6 min。进样口温度250℃；传输线温度280℃；载气（高纯氦99.999%）流速1 mL/min。
质谱条件：电子轰击离子源（electronimpactionsource，EI），电子能量70 eV；全扫描 m/z35amu～400amu；离子源（电轰击电离EI）温度250℃；接口温度250℃。
1.4 数据处理
试验数据采用Excel-2010处理，绘图使用Origin 9.0，显著性差异分析使用 SPSS20.0（Duncan 法，p＜0.05）。
2 结果与分析
2.1 分离菌株的鉴定
2.1.1 形态学鉴定
在高温大曲中，经过第一种预处理方式后，经形态学初步筛选后分离得到3株菌株，分别编号为F-40、F-41、F-42号，其中F-40和F-42号菌株筛选温度为50℃，F-41号菌株筛选温度为30℃。对菌株进行在固体培养基单菌落形态学的鉴定，鉴定结果见表1。
表1 固体培养基形态鉴定
Table 1 The morphological identification of solid medium of 3 stains
编号 培养基 大小/mm 形态 边缘 颜色 隆起 光泽 气味 表面 透明度F-40 ISP2 3 圆形 整齐 白色 垫状 无 土腥味 干燥 不透明F-41 ISP2 3 圆形 波状 浅白 扁平 无 无 干燥 不透明ISP3 2 点或圆形 波状 乳白 扁平 无 无 干燥 不透明ISP4 1 点 整齐 乳白 扁平 无 无 干燥 半透明ISP5 1～2 圆形 啮蚀状 白色 扁平 无 无 干燥 透明GS 2～3 圆形 啮蚀状 乳白 扁平 无 无 干燥 不透明F-42 ISP2 6～7 圆形 啮蚀状淡黄色 扁平 有 泥臭味 黏稠 半透明ISP5 1 点 整齐 淡黄色扁平 有 泥臭味黏稠 半透明
3株菌在液体培养基（ISP2）中形态观察如下：F-40号菌株培养基液体透明，有土腥味，无色素产生，菌株主要呈球体生长，前期生长在培养基底部，后期逐渐在液面生长成菌膜，菌膜呈皱状生长；F-41号菌株液体混浊，无异味，无色素产生，在培养基中呈粉状沉淀生长，无菌膜生成；F-42号菌株液体混浊，有泥臭味，无色素产生，在培养基中主要呈粉状沉淀生长，无菌膜生成。
图1表示的是3株放线菌在电子显微镜油镜（1 000×）下的形态特征。
图1 3株菌株电子显微镜形态特征
Fig.1 The morphological characteristics of 3 strains
由图1可知，F-40号菌株（图a）的菌丝缠绕互相连接，且有很多分支存在，菌丝密集；F-41号菌株（图b）形态呈圆形或椭圆形，多为单个独立存在；F-42号菌株（图c）形态呈杆状，长短不一。
2.1.2 生理生化鉴定
3株菌株鉴定的生理生化结果见表2。
表2 生理生化鉴定结果
Table 2 The physiological and biochemical identification of 3 stains
注：+表示阳性反应，-表示阴性反应。
菌株编号 果糖 蔗糖 木糖 葡萄糖 棉子糖 甘露糖 麦芽糖 半乳糖 海藻糖 鼠李糖 牛乳凝固 明胶液化 纤维素分解 硫化氢分解F-40 + - + + - + - + - - - + - -F-41 + - + + - - + - + - - + - -F-42 + + + + - + + + + - + + - +
由表2看出，F-40号菌株可利用果糖、木糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖，明胶液化强，不能分解纤维素，不能使牛乳凝固，不产生硫化氢；F-41号菌株可利用果糖、木糖、葡萄糖、麦芽糖和海藻糖，能使明胶液化，不能使牛乳凝固，不能分解纤维素，不能产生硫化氢；F-42号菌株可利用果糖、蔗糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖和海藻糖，能使牛乳凝固，可使明胶液化，可产生硫化氢气体，不能分解纤维素。
2.1.3 分子生物学鉴定
图2是3株放线菌构建的系统发育树。
图2 3株高温放线菌系统发育树
Fig.2 The phylogenetic tree of three stains
（a）F-40；（b）F-41；（c）F-42。
由图2可知，F-40号和F-41号菌株均与链霉属的菌株呈现相关性，其中F-40号菌株与对比菌株Streptomyces albus 112490.1最为相似；F-41号菌株与对比菌株Streptomyces olivaceus 041202.1最为相似；F-42号菌株与对比菌株Saccharopolyspora endophytica 132591.1最为相似。3株菌株序列与对比序列同源性均达到了100%，综合形态学观察及生理生化鉴定结果，最终确定F-40号菌株为白色链霉菌（Streptomyces albus），F-41号菌株为橄榄链霉菌（Streptomyces olivaceus），F-42号菌株为植物内生糖多孢菌（Saccharopolyspora endophytica）。
2.2 菌株耐受性分析
2.2.1 不同温度对菌株生长情况的影响
图3是不同温度对3株菌生长情况的影响。
图3 3株菌对温度的耐受性
Fig.3 The tolerance of three strains to different temperatures
在酱酒酿造过程中，酒醅经过高温堆积后进行发酵，这要求菌株能适应酒醅温度的变化。由图3可看出，F-40号菌株吸光值随温度的升高而逐渐降低，最适生长温度为30℃，F-41号菌株的最适生长温度为50℃，F-42号菌株的最适生长温度为40℃。图中可看出F-41和F-42号两株菌均可在40℃～60℃的高温下生长。白成松等[17]从茅台大曲中也分离得到一株高温放线菌，耐受温度亦可达60℃，这表明其可适应酱酒酿造过程中的高温环境。
2.2.2 不同pH值对菌株生长情况的影响
图4是不同pH值对3株菌生长情况的影响。
图4 3株菌对pH值的耐受性
Fig.4 The tolerance of three strains to pH
pH值的变化可影响菌株的代谢情况，在酱酒酿造过程中产酸菌株代谢产生的有机酸等物质会使酒醅的酸度发生改变，这就要求微生物要适应酒醅中酸度的变化，由图4可看出，F-40号菌株可在pH值为6～12生长，最适生长pH值为8，F-41和F-42号两株菌可在pH值为4～12生长，F-41号菌株最适生长pH值为7，F-42号菌株最适生长pH值为6。可见3株菌均有较宽的pH值生长范围，能应对在酱酒酿造过程中pH值的变化。
2.2.3 不同乙醇浓度对菌株生长情况的影响
图5是不同乙醇浓度对3株菌生长情况的影响。
图5 3株菌对乙醇浓度的耐受性
Fig.5 The tolerance of three strains to alcohol concentration
由图5可看出，3株菌的吸光值均随乙醇浓度的升高而降低。乙醇浓度在0%～6%的范围内，3株菌的吸光值迅速下降，表明乙醇对菌株的生长产生抑制作用；乙醇浓度在6%～21%的范围内，3株菌的吸光值接近为0，表明菌株在此乙醇浓度范围内基本不生长，这是由于乙醇含量的增加可抑制菌株正常的细胞生长代谢。虽然3株菌耐乙醇能力相对酵母菌株[18-19]较弱，但与细菌耐乙醇能力[20-21]基本一致，推测其可能在发酵前中期过程进行生长代谢，为其它细菌及酵母的生长提供营养物质。
2.2.4 不同NaCl浓度对菌株生长情况的影响
图6是不同NaCl浓度对3株菌生长情况的影响。
图6 3株菌对NaCl浓度的耐受性
Fig.6 The tolerance of three strains to NaCl concentration
由图6可看出，3株菌的吸光值均随NaCl浓度的升高而降低。F-40号菌株在NaCl浓度为0%～9%时生长，F-41和F-42号菌株在NaCl浓度为0%～6%时生长。NaCl会对菌株的细胞内水分活度、渗透压产生影响，从而对菌株的生长代谢产生影响，菌株可耐受一定浓度的NaCl有助于适应酱酒酿造的复杂环境。
2.2.5 不同水分含量对菌株生长情况的影响
图7是不同水分含量对3株菌生长情况的影响。
图7 3株菌对水分含量的耐受性
Fig.7 The tolerance of three strains to water content
水分含量影响微生物的生存代谢，一定的水分含量可促进微生物的生长。由图7可看出，在麦麸水分含量为60%时，F-40和F-41号菌株菌落数最高（分别为 1.03×106CFU/g和 1.28×107CFU/g）；在麦麸水分含量为40%时，F-42号菌株菌落数最高为3.63×106CFU/g，且3株菌在最适水分含量下的菌落数与其它水分含量下的菌落数有明显差异。
2.3 菌株产风味物质分析
利用顶空固相微萃取结合GC-MS联用技术对3株菌的梯度升温发酵样品进行风味代谢物质的测定，测定结果如图8。
从图8可看出，3株菌主要代谢产生醇类及醛酮类物质，两类物质在所有风味代谢物质中占有较大丰度。与罗小叶等[8]的研究有所不同的是，在酱香型大曲中筛选得到的3株放线菌可代谢产生较多的酯类物质，这可能是因为菌株的不同和酱酒酿造地区的差异，导致代谢产物含量不一样。
图8 3株菌的挥发性成分分析
Fig.8 The analysis of volatile components of three strains
（a）F-40；（b）F-41；（c）F-42。
在发酵中期阶段（35℃），F-40号菌株产生的风味代谢物质主要以醇类、醛酮类、萜烯类和酚类物质为主，其中醇类物质占比48.69%，醛酮类物质占比24.43%，萜烯类物质占比7.54%，酚类物质占比5.90%，随着发酵温度的升高，F-40号菌株产生的酯类物质含量逐渐升高，由最初的0%升高到9.18%，这可能是因为随着温度的升高，酯类的生成反应加快；F-41号菌株产生的风味物质中，主要以醇类、醛酮类、酸类和酚类物质为主，其中醇类物质占比51.34%、醛酮类物质占比31.40%、酸类物质占比4.01%、酚类物质占比5.88%，且随发酵温度的升高，F-41号菌株产生的酸类物质含量逐渐降低，由最初的7.98%降低到0%；F-42号菌株产生的风味物质中，主要以醇类、醛酮类和酚类物质为主，其中醇类物质占比47.88%，醛酮类物质占比38.90%，酚类物质占比3.92%。王小平[22]在酱香风味功能菌株的筛选中得到3株地衣芽孢杆菌，通过测定风味代谢物质发现产生了较多酮类物质和酚类物质，并且酱香风味突出，在本研究结果中也发现较多的醛酮类物质，为酱香风味的形成作出一定贡献。
发酵温度35℃条件下3株菌的挥发性物质分析见表3。
表3 35℃条件下3株菌的挥发性物质分析
Table 3 The analysis of volatile substances of three strains at 35℃μg/g
类型 物质名称 F-40 F-41 F-42醇类 乙醇 0.132±0.042 0.151±0.025 0.106±0.015糠醇 0.025±0.002 0.043±0.012 0.041±0.006正己醇 0.031±0.006 0.058±0.012 0.124±0.030 1-辛烯-3-醇 0.015±0.004 0.058±0.012 0.067±0.005顺-3-壬烯醇 0.016±0.002 0.021±0.003 0.030±0.002 1-戊醇 - 0.030±0.009 0.060±0.012 1-辛醇 0.007±0.000 - 0.024±0.000苯乙醇 0.020±0.002 - 0.007±0.001反式-2-癸烯醇 - 0.003±0.000 0.003±0.000（5-乙基环戊-1-烯基）甲醇0.012±0.001 - 0.027±0.009
续表3 35℃条件下3株菌的挥发性物质分析
Continue table 3 The analysis of volatile substances of three strains at 35℃μg/g
类型 物质名称 F-40 F-41 F-42醇类 4-乙基环己醇 - 0.005±0.000 -庚醇 - 0.013±0.000 -苯甲醇 0.009±0.001 - -3-辛醇 0.004±0.001 - -beta-桉叶醇 0.012±0.002 - -二甲基硅炔二醇 0.014±0.000 - -反式-9-十六烯-1-醇 - 0.002±0.000 -烯丙基正戊基甲醇 - - 0.007±0.001小计 0.297 0.384 0.496醛酮类 2-庚酮 0.029±0.008 0.033±0.007 0.046±0.006 2-辛酮 0.021±0.004 0.018±0.003 0.022±0.001 3-乙基环戊酮 0.012±0.001 0.016±0.003 0.016±0.000甲基庚烯酮 0.005±0.000 0.103±0.027 0.003±0.000苯甲醛 0.004±0.000 0.003±0.001 0.081±0.012 3-羟基-2-丁酮 - - 0.012±0.001 5-乙基环戊烯-1-碳醛 - 0.028±0.000 0.062±0.007二氢-5-戊基-2（3H）-呋喃酮0.061±0.009 - 0.112±0.010己醛 - - 0.020±0.011糠醛 - - 0.022±0.002 2-甲基-4-庚酮 0.007±0.003 - -正戊基2-呋喃酮 0.010±0.003 - -反-2-辛烯醛 - - 0.007±0.000 4-甲基-3-环己烯-1-碳醛- 0.029±0.000 -1-（2-甲基-1-环戊烯-1-基）-乙酮- 0.005±0.002 -小计 0.149 0.235 0.403酯类 十六酸乙酯 0.009±0.002 - 0.004±0.001反油酸乙酯 0.004±0.002 - -苯乙酸甲酯 0.004±0.000 - -十六酸甲酯 - 0.003±0.000 -1-羟基环己烷丙酸γ-内酯- 0.006±0.001 -小计 0.017 0.009 0.004酸类 己酸 - 0.028±0.017 0.015±0.000（2-甲基苯基）甲酯-乙酸- 0.002±0.000 -5-乙基-甲酯-1-环戊烯-1-羧酸0.009±0.002 - -小计 0.009 0.030 0.015萜烯类 白菖烯 0.012±0.000 - -8，9-脱氢新异长叶烯 0.023±0.000 - -1，2，3，4，5，6，7，8-八氢-1，4，9，9-四甲基-（1S，4R，7R）-4，7-甲基亚唑烯0.011±0.000 - -1-壬烯 - - 0.018±0.000小计 0.046 0.000 0.018
续表3 35℃条件下3株菌的挥发性物质分析
Continue table 3 The analysis of volatile substances of three strains at 35℃μg/g
注：-表示未检出
类型 物质名称 F-40 F-41 F-42酚类 愈创木酚 0.011±0.006 0.018±0.005 0.015±0.002对乙烯基愈疮木酚 0.025±0.005 0.026±0.002 0.004±0.001小计 0.036 0.044 0.019其他类 2-戊基吡啶 0.003±0.000 0.004±0.001 0.004±0.001 2-正戊基呋喃 0.030±0.009 0.029±0.010 0.050±0.017 1，2-苯并异噻唑 - 0.006±0.000 0.005±0.001 2-甲基戊酸酐 - 0.007±0.000 -1，4-二甲基金刚烷 0.005±0.001 - -反-萘烷醇 0.018±0.000 - -小计 0.092 0.090 0.059总量 0.610 0.748 1.036
在模拟发酵过程中发现F-40号菌株有土霉味异味的出现，研究分析后发现F-40号菌株代谢产生的反-萘烷醇是土霉味的主要来源之一，并且有研究[23-24]表示，酱酒酿造过程中的土霉味主要来自放线菌，主要是因为高温放线菌可产生土臭素或萘烷醇类物质，从而导致土霉味的生成，张建敏[11]筛选得到的白色链霉菌亚种（Streptomyces albus subsp.）产生土臭素，亦产生土霉味异味。在模拟发酵过程中发现F-41号菌株并无异味，而是有清香味的出现，分析发现是由于甲基庚烯酮的含量（13.77%）较高，甲基庚烯酮可产生柠檬草般的香气[25]，且F-41号菌株可代谢产生1-戊醇、庚醇等小分子醇类物质，也可代谢产生1-羟基环己烷丙酸γ-内酯，这些物质均可表现出特殊香气物质[26]。在模拟发酵过程中发现F-42号菌株有臭味的出现，可能是因为菌株在不同的发酵温度下都产生了不饱和醛类物质，如1-甲基-3-环己烯-1-碳醛、5-乙基环戊烯-1-碳醛等，这些物质可导致臭味或刺激味道的生成；除此之外，在F-42号菌株的代谢产物中还发现了3-羟基-2-丁酮，此物质是酱酒基酒中的一类特征风味物质[27-29]，可产生奶香味，有助于后续酱酒的风味形成。研究结果还发现，3株菌都可代谢产生2-庚酮，2-庚酮也是一种酱酒中特征性酮类物质[30-32]，可产生梨的香气，有助于酱酒的风味调节和酱香风味的形成。
3 结论
本研究在酱香型高温大曲中筛选得到3株高温放线菌，并对菌株的耐受性和固态发酵挥发性成分作进一步探究。结果表明，3株菌在模拟固态发酵过程中主要产生醇类及醛酮类物质和少量酯类、酸类及萜烯类物质；其中F-40号菌株可产生反-萘烷醇，促使发酵样品的土霉异味的生成，F-41号菌株可产生小分子醇类物质及内酯，赋予了发酵样品特殊的香气，F-42号菌株可产生不饱和醛类物质，导致发酵样品中产生臭味。本研究为酱香型白酒发酵过程中的微生物筛选利用和特性分析提供了参考。
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