赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）是一类由丝状真菌次级代谢产生的霉菌毒素[1]，普遍存在于农作物和加工食品中，对人类健康构成严重威胁[2]。1993年国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）在评估人类致癌风险时专门评估了OTA的致癌性[3]，并将其定为2B类致癌物，即可能引起人类癌症的物质。许多研究表明，OTA对多种动物具有肾毒性、肝毒性、神经毒性、致畸性和免疫毒性等多种毒性作用[4]。GB 2761—2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》中对于谷物及其制品中OTA的限量为 5 μg/kg。
OTA性质稳定，食品的加工储存过程难以对其产生影响，即使是高温烹饪也不能完全破坏OTA的结构。因此，OTA一旦污染食品就难以清除。目前，许多国家的水果、可可、香料、咖啡等食品中都发现了OTA的存在[5-6]，而谷物被认为是OTA污染最多的食品[7]，这些被污染的食品原材料会通过运输和加工逐渐污染食品工业，进而被人类摄入；甚至有报告显示，在人类母乳中也发现了OTA[8]。综上所述，检测食品中OTA含量对人类饮食健康意义重大。
目前主要采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[9-10]和液相色谱-质谱联用法[11-12]进行OTA的检测。尽管这些方法具有稳定且灵敏的特点，但也存在着前处理过程复杂，成本高，需要专业人员的劣势。OTA作为一种毒性大、难以准确检测、检测流程复杂、检测成本高的生物毒素，长久以来缺乏良好的检测方法，因此，亟需建立一种快速、灵敏、特异性强、成本低的检测方法。
金纳米粒子（gold nanoparticles，AuNPs）由于具备良好生物相容性、易于与生物分子共轭以及更好的电化学和光学转导等特点，已成为免疫测定信号放大策略中最有价值的纳米材料之一[13]。AuNPs合成方法简单，尺寸和形貌可控，可以通过金硫键与巯基结合或通过强烈的静电吸附作用，对蛋白质、核酸进行偶联，并且不会破坏其生物活性，具有较大的比表面积，当作为荧光信号的偶联载体时，可间接增大荧光信号，进而提高检测灵敏度。同时，利用寡核苷酸链进行信号放大也一直是研究热点，通过其与生物化学传感技术相结合，构建了各种高灵敏性的检测方法，实现了对农药、兽药、环境污染物、肿瘤标志物等的超灵敏检测。当寡核苷酸链被氨基、巯基等偶联处理后，就可以和一些生物活性物质、纳米材料等通过化学键进行偶联，也可以筛选出特定的核酸片段，作为这个特定目标物的适配体。
Baryeh等[14]使用基于AuNPs的横向流动条带生物传感器和便携式条带阅读器开发了一种定量免疫色谱分析方法，用于快速且灵敏地测定人血浆中的碳水化合物抗原 19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）。该测定方法的检测限为5 U/mL，线性范围为5 U/mL～100 U/mL。该方法成功评估了胰腺癌患者血浆样品中的CA 19-9浓度，结果与酶联免疫吸附试验获得的结果一致。Mei等[15]建立了一种基于实时定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的方法，该方法不需要提取DNA就可以高效检测血液中循环肿瘤细胞，最低能够检测5mL血液样本中的单个肿瘤细胞，临床肿瘤血样检出率为92.3%。Li等[16]建立了一种基于滚环扩增比色法测定金黄色葡萄球菌的方法，该方法检测金黄色葡萄球菌的靶序列时检测限为1.2 pmol/L，检测金黄色葡萄球菌基因组DNA时，检测限为7.4 μg/L。DNA分子本身也可以被荧光素等偶联，作为荧光信号输出。综上，利用胶体金和核酸信号放大作用进行检测，具有灵敏度高、稳定性好、成本低、操作简便等特点，适合用于食品中有害物质的微量、痕量检测。
本研究通过发挥寡核苷酸链和胶体金所具备的荧光信号放大能力，建立快速检测谷物中OTA的方法，以期为食品快速检测提供理论基础和研究方向。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
N-羟基丁二酰亚胺（N-hydroxy succinimide，NHS）、1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺[1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC]、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、氯金酸、柠檬酸三钠、3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB）、三（2-羧乙基）膦[tris（2-carboxyethyl）phosphine，TCEP]、聚乙二醇（polyethylene glycol 20000，PEG 20000）、Tris-EDTA（TE）、1，4-二巯基苏糖醇（dithiothreitol，DTT）：美国 Sigma-Aldrich 公司；甲醇（分析纯）、四氢呋喃（分析纯）、磷酸缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）：国药集团化学试剂有限公司；N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）：天津市化学试剂一厂；脱脂乳粉：美国BD公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；OTA多克隆抗体：山东绿都生物科技有限公司；6-羧基荧光素修饰的寡核苷酸链（6-carboxyfluorescein-single stranded DNA-sulfhydryl group，6-FAM-ssDNA-SH）：上海生工生物工程公司；玉米、大米和燕麦：市售。
1.2 仪器与设备
超纯水系统（QSPTOC）：美国Millipore公司；酶标仪（Varioskan LUX）：美国Thermo公司；紫外分光光度计（Cary 50-Bio）：美国Varian公司；透射电子显微镜（HT7700）：日本HITACHI公司；低温恒温培养箱（LTI-700）：上海 Eyela公司；磁力搅拌器（ZNCL-TS 500 mL）：巩义市予华仪器有限公司；离心机（5804R）：德国 Eppendorf公司；洗板机（MTS 2/4 digital）：美国Bio-Rad公司；超声波清洗仪（KQ-500B）：昆山市超声仪器有限公司。
1.3 检测OTA含量的原理
本试验以竞争性酶联免疫吸附（competitive enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）为基础，建立了基于寡核苷酸链信号放大的OTA荧光免疫检测方法。将寡核苷酸链偶联在胶体金上，可以淬灭寡核苷酸链上修饰的FAM基团荧光信号，当荧光探针上偶联的抗体与标准品或者酶标板上的包被原发生特异性结合后，荧光探针被固定在了酶标板上，加入DTT解离后，寡核苷酸链被DTT解离下来，FAM荧光基团与胶体金距离变远，荧光信号恢复并被酶标仪检测到。反应体系中的OTA含量越高与荧光强度成反比。
1.4 方法
1.4.1 OTA包被原的制备和抗体有效性验证
使用活化酯法偶联赭曲霉毒素A（OTA）和卵清蛋白（OVA），用BCA试剂盒测定抗体和包被原的浓度，采用间接竞争ELISA验证OTA抗体的有效性，计算抑制率并使用Origin 9.0软件绘制标准曲线，计算IC50值和IC15值。
1.4.2 胶体金纳米材料的合成
使用柠檬酸钠还原法制备胶体金纳米材料（AuNPs），然后使用紫外分光光度计和透射电镜分析鉴定合成的AuNPs的紫外吸收光谱和粒径分布，根据以下公式计算AuNPs的浓度[17]。
式中：ε为消光系数；k=3.321 1；D为AuNPs直径，nm；a=10.805 0；A 为吸光值；b 为液层厚度，cm；c为AuNPs溶液浓度，nmol/L。
1.4.3 寡核苷酸链的设计
寡核苷酸链（ssDNA）的长度和碱基的种类会直接影响荧光探针检测的结果，ssDNA的长度越短，其空间位阻就越小，连接在AuNPs表面的数量就越多，因此短链的ssDNA与AuNPs的连接率高[18-20]。此外，ssDNA中的T碱基与AuNPs的表面吸引力在4种碱基中最小，不会占用AuNPs表面过多的位点，因此T碱基含量高的ssDNA与AuNPs的连接率高[21]。综上，本研究设计一种3'端修饰6-羧基荧光素（6-FAM），5'端修饰巯基序列为TTTTT的6-FAM-ssDNA-SH，由于其在使用过程中可能会产生稳定的二硫键，从而降低了其与AuNPs形成Au-S键的效率，为将稳定的二硫键还原成单巯基，通过加入还原剂TCEP进行还原。
1.4.4 寡核苷酸链偶联方法的选择
AuNPs偶联ssDNA的方法主要有低酸法、盐老化法和冷冻法。低酸法要求反应体系的pH值为3.0左右，而免疫反应中的抗原和抗体为蛋白质，长时间在低酸环境下容易变性失活，故采用盐老化法和冷冻法偶联ssDNA，选取偶联效率高的方法进行后续试验。
1.4.5 制备寡核苷酸链过程的优化
以静电吸附作用进行负载形成的复合物，在高盐溶液或含有DTT的缓冲溶液中容易出现解吸附现象，降低偶联物稳定性[22]。高分子量的PEG可以使AuNPs在高盐的环境下保持稳定，采用高盐滴定法确定PEG的添加量简便快速，不需要复杂的前处理[23]。将反应体系中PEG 20000终浓度设置为 0%、0.50%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%、2.00%，使用高盐滴定法确定PEG添加浓度。
抗体与抗原进行特异性结合是免疫反应的关键，ssDNA-FAM是荧光信号表征的关键，偶联时间将影响偶联效率，因此将添加抗体量设置为 2、4、8、16 μL，将 ssDNA-FAM 与 AuNPs的摩尔比设置为 100∶1、200∶1、300∶1、400∶1、500∶1、600∶1、700∶1，将冷冻法偶联时间设置为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，逐步进行优化。
1.4.6 方法的检测过程
移取适量的包被液，加入适量的OTA包被抗原，吹打混匀，每孔100 μL加入黑色酶标板中，37℃恒温孵育3 h，甩板洗涤，配制0.5%脱脂乳粉封闭液，每孔加入200 μL封闭液，37℃恒温孵育1 h，甩板洗涤。将96孔分为效价组、抑制组和空白组：效价组每孔加入50 μL荧光探针稀释液和50 μL PBS；抑制组每孔分别加入50 μL荧光探针稀释液和50 μL OTA标准溶液或待测溶液；空白组加入100 μL PBS，37℃恒温竞争反应1 h，甩板洗涤，每孔加入一定浓度的100 μL DTT溶液，37℃恒温反应1 h，酶标仪设置激发波长494 nm，发射波长519 nm，测定荧光值（fluorescenceintensity，FL），根据以下公式计算抑制率。
式中：FL效价为效价组的荧光值；FL抑制为抑制组的荧光值；FL空白为空白组的荧光值。
1.4.7 检测过程的优化
由于OTA在PBS中的溶解性较差，故需要在缓冲溶液中加入一定量的甲醇促进溶解。选择IC50值最低且荧光强度较高的甲醇浓度作为缓冲液浓度。
包被原的浓度与荧光探针的稀释倍数将直接影响检测方法的灵敏性，因此需要优化OTA抗原包被量与荧光探针的稀释倍数。在酶标板上分别包被0.1、0.5、1.0 μg的OTA包被抗原，将荧光探针分别稀释2倍、4倍和8倍，测定不同组合得到的荧光强度，选取IC50和IC15值最低的浓度组合，作为检测方法的工作浓度。
DTT是一种强还原剂，在与ssDNA反应发生配体交换的过程中，高浓度、长时间的DTT反应会对荧光标记物造成影响，所以需要优化DTT溶液的工作浓度和解离时间。分别配制浓度为 0、5、10、15、20、25 mmol/L的DTT溶液，参与反应，测定荧光值，选择荧光强度最高的DTT浓度作为检测方法的浓度；将DTT解离时间分别设定为 30、60、90、120 min，测定荧光值，选择荧光值最大且用时最短的时间作为检测方法的解离时间。
1.4.8 建立方法的标准曲线
分别配制浓度为 100.0、16.67、2.778、0.463、0.078、0.013 μg/L的OTA标准品溶液，参与反应，测定荧光值，建立标准曲线，以IC15值对应的OTA标准品的浓度作为方法的检测限。
1.4.9 方法的特异性评价
为评估基于寡核苷酸链信号放大的OTA荧光免疫检测方法特异性识别OTA的能力，选取OTA以及玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、呕吐毒素（deoxynivalenol，DON）、T-2 毒素、伏马毒素 B1（fumonisin B1，FB1）、黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）5种常见真菌毒素进行反应，计算IC50值，统计交叉反应率。
1.4.10 检测谷物中OTA含量
使用市售玉米、大米和燕麦，作为实际样品参与检测。实际样品处理需要有效提取样品中的目标物，并避免其余基质的干扰。处理步骤参照Zhou等[24]的方法并改进：分别称取5 g谷物样品并粉碎，加入20 mL 70%甲醇-PBS缓冲液，涡旋混合10 min，静置5 min，10 000 r/min离心15 min，移取提取液并过滤，用PBS稀释8倍后，按照1.4.6的步骤进行检测。由于GB 2761—2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》中要求谷物中赭曲霉最大残留限量为5.0 μg/kg，因此本试验设置3个添加水平，即1、5、10 μg/kg，每个水平设置3个重复。按GB 5009.96—2016《食品安全国家标准食品中赭曲霉毒素A的测定》中的步骤对上述样品进行前处理，标准品添加水平和重复数量与上述一致，使用超高效液相色谱串联质谱进行验证对比。
2 结果与讨论
2.1 OTA抗体和包被原的验证
使用BCA试剂盒测定抗体和包被原浓度，测得OTA抗体和包被原的浓度分别为为1.81 mg/mL和2.13 mg/mL。OTA抗体的标准曲线如图1所示。
图1 OTA抗体的标准曲线
Fig.1 Standard curve of OTA antibody
经过计算，间接竞争ELISA的IC50值为0.452μg/L，IC15值为0.049 μg/L，说明OTA抗体可以特异性结合包被原，可以用于后续试验。
2.2 胶体金纳米材料的表征
AuNPs质量的高低将直接影响检测方法的灵敏性，只有粒径均一，分散均匀的AuNPs才能保证检测方法的准确性，结果如图2所示。
图2 AuNPs的紫外光谱图、透射电镜图及粒径分布
Fig.2 UV spectra and transmission electron microscope images and particle size distribution of AuNPs
（a）紫外光谱图；（b）电镜图和粒径分布。
由图2（a）可知，所合成的AuNPs的最大吸收波长在520 nm处，符合胶体金的基本特征，证明可以用于后续试验。由图2（b）可知，AuNPs的分散性良好、大小均一并且形状规则，没有出现不可逆聚集、不成型、大小不一等常见问题，证明可以用于后续试验。使用Nano measure软件对其进行粒径分析，AuNPs的粒径分布主要集中在13nm～17nm，平均粒径为15.26nm，计算得出AuNPs的浓度为2.041 2 nmol/L，AuNPs粒径大小和浓度均处于正常范围内，证明可以用于后续试验。
2.3 寡核苷酸链偶联方法的选择
使用两种偶联ssDNA的方法，结果如图3所示。
图3 偶联寡核苷酸链方法的选择
Fig.3 Selection of methods for coupling oligonucleotide chains
由图3可知，未加入DTT时，二者荧光探针的荧光值都很低，加入DTT通过配体交换将ssDNA链解离下来后，冷冻法的荧光恢复值高于盐老化法，这是由于盐老化法的偶联效率低所造成的。此外，相较于需要24 h进行偶联的盐老化法，冷冻法还具有节省时间的优势。因此，选择冷冻法作为AuNPs偶联ssDNA的方法。
2.4 制备寡核苷酸链过程的优化
对添加不同量PEG20000的AuNPs溶液进行NaCl滴定试验，得到的紫外扫描如图4所示。
图4 添加不同浓度PEG 20000时AuNPs的紫外光谱图
Fig.4 UV spectra of AuNPs with different concentrations of PEG 20000
由图4可知，在PEG 20000的浓度从0.50%到1.25%的过程中，AuNPs的最大吸收波长随着PEG 20000浓度的增加而逐渐减小；在PEG 20000的浓度为1.25%及以上时，AuNPs的最大吸收波长不再改变，说明在PEG 20000浓度低的情况下，NaCl引起了AuNPs的聚集，而当PEG 20000浓度足够时，NaCl不会对AuNPs造成影响。此外，在制备荧光探针的过程中发现，不添加PEG 20000和添加1.25%PEG 20000制备的寡核苷酸荧光探针相比，前者更容易形成不可逆聚集，溶解性差，制得的荧光探针颜色浅；而后者的溶解性更好，颜色更深。
两种探针与抗原反应后的荧光值如图5所示。
图5 添加与不添加PEG制备的荧光探针的荧光强度
Fig.5 Fluorescence intensity of fluorescent probes prepared with and without PEG
由图5可知，添加了1.25%PEG制备的探针荧光值更高，表明AuNPs的连接效率更高，由于不可逆聚集造成的损失更少。
抗体的添加量优化结果如图6所示。
图6 制备荧光探针OTA抗体添加量的优化
Fig.6 Optimization of OTA antibodies addition in the preparation of fluorescent probes
图6中折线图为制得探针后，直接加DTT反应的荧光值，随着抗体浓度的升高，荧光值逐渐降低，这是由于越来越多的抗体占据了AuNPs表面的位点，导致ssDNA连接率下降，最终造成荧光值降低；图中柱状图为探针在微孔板中与包被原进行免疫反应后的荧光值，随着抗体添加量的增加，荧光值先升高后降低，并在8 μL时荧光值取得最大，这是由于当抗体添加量低时，偶联少量抗体的荧光探针对抗原的识别能力差，导致荧光值低；而当抗体添加量高时，抗体则会占据AuNPs表面过多的位点，使得ssDNA的连接率低，导致荧光值低。因此选取8 μL的抗体添加量制备探针。
制备荧光探针ssDNA和AuNPs的摩尔比优化结果如图7所示。
图7 制备荧光探针ssDNA和AuNPs摩尔比的优化
Fig.7 Optimization of ssDNA and AuNPs mole ratio in the preparation of fluorescent probes
由图7可知，当向反应体系中加入的ssDNA增加时，荧光值先升高后降低，并在ssDNA和AuNPs摩尔比为400∶1时达到最大，因此选择ssDNA和AuNPs的最佳摩尔比为 400∶1。
AuNPs偶联ssDNA的冷冻时间优化结果如图8所示。
图8 冷冻偶联时间的优化
Fig.8 Optimization of freezing coupling time
由图8可知，当冷冻时间小于2 h时，随着冷冻时间的延长，荧光强度随之增强，当冷冻时间大于2.0 h后，荧光强度增加不明显。这是由于AuNPs上的表面位点已趋于饱和，无法连接更多ssDNA-FAM，因此确定偶联的冷冻时间为2.0 h。
分别制得AuNPs、AuNPs-抗体和荧光探针后，使用紫外分光光度计分别对其进行紫外光谱扫描，结果如图9所示。
图9 偶联前后AuNPs的紫外光谱图
Fig.9 The UV spectra of AuNPs before and after coupling
从图9可知，随着AuNPs表面偶联的物质越多，最大吸收波长从开始的518 nm红移到了524 nm，并最终红移到了528 nm，这表明OTA抗体和ssDNA被成功偶联到了AuNPs表面。
2.5 检测过程的优化
使用不同甲醇浓度的PBS溶液作为OTA标准品的稀释缓冲液，参与反应，检测结果如图10所示。
图10 PBS缓冲溶液中的甲醇浓度的优化
Fig.10 Optimization of methanol concentration in PBS buffer solution
由图10可知，当甲醇浓度不断增加时，荧光强度逐渐降低，IC50值在甲醇浓度为10%时最低，这是因为高浓度甲醇会影响荧光基团的强度，而当甲醇浓度过低时，又会影响到检测方法的灵敏性，因此将甲醇浓度为10%的PBS作为OTA标准品的稀释液。
免疫分析方法中包被量与探针稀释倍数会对方法灵敏性产生重要影响，棋盘优化结果如表1所示。
表1 荧光探针和包被抗原工作浓度的优化
Table 1 Optimization of working concentration of fluorescent probe and coated antigen
包被原/（μg/孔）探针稀释倍数IC50/（μg/L）IC15/（μg/L）0.1 2 0.913±0.382 0.032±0.015 4 0.681±0.337 0.018±0.008 8 0.981±0.426 0.019±0.008 0.5 2 0.591±0.174 0.013±0.006 4 0.285±0.135 0.005±0.002 8 0.592±0.285 0.015±0.007 1 2 1.098±0.386 0.135±0.061 4 0.734±0.332 0.016±0.007 8 1.096±0.375 0.124±0.075
选择IC50和IC15均为最小时所对应的工作浓度，即包被抗原包被量为每孔0.5 μg，荧光探针的稀释倍数为4倍，将其作为检测方法的最佳工作浓度。
DTT浓度优化结果如图11所示。
图11 DTT浓度的优化
Fig.11 Optimization of DTT concentration
由图11可知，随着DTT浓度的增加，探针的荧光强度先升高后降低，在DTT浓度为10 mmol/L时达到最大，这是因为当DTT浓度低时，荧光探针上的寡核苷酸链解离不完全，导致荧光值低；而当DTT浓度过高时，其强还原力会对荧光标记物产生影响，进而造成荧光值低，因此选取DTT的浓度为10 mmol/L作为解离液的工作浓度。
DTT反应时间优化结果如图12所示。
图12 DTT溶液解离时间的优化
Fig.12 Optimization of DTT solution dissociation time
由图12可知，随着DTT的反应时间延长，探针的荧光强度先升高后保持稳定，在60 min时不再升高，这是由于探针上的寡核苷酸链已被解离完全，使得荧光强度不再升高，因此选用60 min作为解离过程的反应时间。
2.6 建立方法标准曲线
通过上述优化过程，确定探针的制备条件：抗体添加量为 14.4 μg，ssDNA 与 AuNPs的摩尔比为 400∶1，在-20℃冰箱中冷冻2 h进行偶联，制得荧光探针。方法的最佳工作条件：包被量为每孔0.5 μg，信号探针稀释4倍，样品稀释液中甲醇浓度为10%。基于以上优化结果，分别测定OTA浓度不同时所对应的荧光强度值，建立标准曲线，如图13所示。
图13 方法的标准曲线
Fig.13 Standard curve of method
经计算，方法的IC50值为0.28 μg/L，检测限 IC15值为0.004 4 μg/L，相较于间接竞争ELISA的检测限（0.049 μg/L）降低了 91%。
2.7 方法的特异性评价
选用OTA和5种常见的真菌毒素进行特异性分析，结果如表2所示。
表2 特异性分析结果
Table 2 Results of specificity analysis
真菌毒素IC50/（μg/L） 交叉反应率/%OTA 0.284 56 100 DON ＞1 000 ＜0.01 T-2 ＞1 000 ＜0.01 ZEN ＞1 000 ＜0.01 AFB1 ＞1 000 ＜0.01 FB1 ＞1 000 ＜0.01
从表2可以看出无交叉反应，证明方法的检测特异性良好。
2.8 实际样品检测与验证
按照1.4.10的步骤对玉米、大米和燕麦进行前处理后进行检测，并使用超高效液相色谱串联质谱法验证并对比，结果如表3所示。
表3 谷物样品中OTA含量的测定（n=3）
Table 3 Detection of OTA content in grain sample（n=3）
样品超高效液相色谱串联质谱法测定值/（μg/kg）添加浓度/（μg/kg）基于寡核苷酸链信号放大快速检测谷物中OTA方法变异系数/%玉米 1 0.94 93.8 0.81 80.9 8.70 5 4.88 97.6 5.21 104.3 8.56 10 10.15 101.5 9.73 97.3 7.81大米 1 0.91 91.2 0.84 83.9 9.39 5 4.77 95.4 4.90 97.9 8.45 10 9.46 94.6 10.53 105.3 7.50燕麦 1 0.94 94.3 0.92 91.5 9.53 5 5.12 102.3 4.30 86 9.02 10 9.94 99.4 9.64 96.4 7.82回收率/%变异系数/%9.22 8.73 8.05 9.56 9.28 6.39 9.23 8.46 6.14测定值/（μg/kg）回收率/%
由表3可知，本方法中OTA的添加回收率为91.2%～102.3%，变异系数小于10%；超高效液相色谱串联质谱仪的添加回收率为80.9%～105.3%，变异系数小于10%，两种方法的检测结果与添加量呈现一致性，证明该方法可以用于实际样品中OTA的定量检测。
3 结论
本研究通过柠檬酸钠还原法制得了粒径均一、形状规则的AuNPs，利用AuNPs比表面积大、生物相容性好的特点，首先通过静电吸附将OTA抗体偶联到AuNPs上，然后通过共价结合将ssDNA-FAM偶联到AuNPs上，制得了寡核苷酸链荧光探针，结合间接竞争ELISA提高检测灵敏度，使用冷冻法偶联ssDNA-FAM效率更高，加入PEG 20000提高了探针的稳定性。通过优化，该方法的检测限为0.004 4 μg/L，特异性良好，使用该方法对玉米、大米、燕麦3种谷物样品中的OTA含量进行检测，OTA的添加回收率为91.2%～102.3%，变异系数小于10%，检测结果与超高效液相色谱串联质谱仪检测结果接近，证明该方法能够用于检测谷物样品中OTA的含量。相比于传统仪器检测，该方法可以降低成本，简化流程，提高效率，拓宽了基于寡核苷酸链信号放大作用检测食品中有害物质的应用范围，为快速检测食品中有害物提供了参考依据。
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