甜菊糖苷俗称甜菊糖、甜菊苷，是从菊科草本植物甜叶菊中提取出高甜度、低热量天然甜味剂，它的热值仅为蔗糖的1/300，被称为“第三代健康糖源”[1-3]。甜菊糖苷具有降血压[4-5]、降血糖[6]、促进胰岛素分泌[7]、防龋齿、抗肿瘤[8]、改善学习和记忆障碍、增溶特性等生理功能[9]。近些年由于果汁饮料、碳酸饮料等饮料产品中含有大量糖，存在不利于身体健康的风险而被广泛关注。许多饮料公司开始研发以甜菊糖苷作为甜味剂的产品，通过使用甜菊糖苷来代替部分糖从而达到低热量的效果，因此甜菊糖苷被广泛应用于饮料行业[10]。
甜菊糖苷测定方法有流动注射化学发光法、分光光度法、毛细管电泳法、近红外法和液质联用法、高效液相色谱法、薄层色谱法、气相色谱法。化学分析法和分光光度法由于受基质中多组分干扰，误差较大；气相色谱法、薄层色谱法、毛细管电泳法均存在前处理方法繁琐、效率低等缺点[11-12]。甜菊糖苷主要含9种不同甜味成分，甜菊苷、甜叶菊醇双糖苷、莱鲍迪苷A、B、C、D、F、甜茶苷和杜克苷等[13]。GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[14]中要求，甜菊糖苷的添加量以甜菊醇当量计。也就是用这9种糖苷的每一种糖苷所等同的甜菊醇的当量，来量化甜菊糖苷的含量。进出口行业标准有SN/T 3854—2014《出口食品中天然甜味剂甜菊糖苷、甜菊双糖苷、甘草酸、甘草次酸的测定高效液相色谱法》[15]、GB 8270—2014《食品安全国家标准食品添加剂甜菊糖苷》[16]，都是分别检测甜菊糖苷中的各种组分计算求和以得到甜菊糖苷的含量。但甜菊糖苷所含组分较多，且许多组分的标准样品很难找到，以甜菊糖苷的9种主要成分来检测其含量，使得检测准确度大大下降，且检测分离难度大，试验成本显著提高。
甜菊醇为甜菊糖苷的苷元，甜菊糖苷的主要成分可以在一定条件下转化成甜菊醇[17]。目前国内外甜菊醇的制备方法主要有酶催化水解法[18]、微生物发酵法[19]、酸水解法[20]、高碘酸钠氧化法[21]等。高碘酸钠氧化法需要消耗大量试剂，并且副产物较多，甜菊醇产率低[22]。微生物发酵法对实验室条件要求较高，需要对菌种进行筛选培养，试验周期长并且微生物难以与产物分离，暂不适于检测工作中使用。张宗英等[23]研究发现在低浓度酸催化剂条件下，甜菊糖苷可发生水解，产物中甜菊醇含量相对较高，产率达到83.6%。万会达等[24]发现路易斯酸可水解甜菊糖苷制备高纯度甜菊醇，并可避免产生水解副产物——异甜菊醇。路易斯酸又称亲电子试剂，指任何可以接受外来电子对的分子或者离子，也可理解为具有空轨道[25]的物质。常见的路易斯酸分 4 类金属离子（例如 Fe3+、Cu2+、Al3+等）、含有价壳层未充满原子的化合物（如AlCl3等）、具有极性双键的分子、含有价壳层可扩展原子的化合物。
本方法挑选了3种常见的路易斯酸（氯化铁、氯化铝、氯化亚铜），筛选出催化甜菊糖苷为甜菊醇效果最好的催化剂，后续进行单因素优化和正交试验确定最优试验过程，实现通过检测甜菊醇的量来计算原有物质中甜菊糖苷的含量。为食品的安全生产和质量保障提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
甜菊醇（98.5%）：美国ChromaDex公司；氯化铁、氯化铝、氯化亚铜（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；乙腈、乙醇（均为色谱纯）：德国默克生物科技（中国）有限公司；饮料：市售。
1.2 仪器与设备
高效液相色谱仪（Agilent 1260）：安捷伦科技（中国）有限公司；数控超声波清洗仪（KQ-800DB型）：昆山舒美超声仪器有限公司；电子天平（BSA224S-CW型）：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；电热鼓风干燥箱（101-3AB型）：上海旌派仪器有限公司；迷你混合仪（MIX-25P型）：北京精测电子科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 样品前处理
称取10 g样品，置于50 mL离心管中，加入适量路易斯酸催化剂，振荡混匀，在热鼓风干燥箱中反应3.5 h后取出，冷却至室温，超声20 min后用乙醇定容，取上清液过膜，待上机检测。
1.3.2 色谱条件
色谱柱为 ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm）；流动相为乙腈∶水=70∶30（体积比）；流速 1 mL/min；紫外检测器波长213 nm；进样量10 μL；柱温30℃。
1.3.3 标准溶液曲线的配制
准确称取甜菊醇标准物质于10 mL容量瓶中，用50%乙醇配制成1 000 μg/mL的标准物质贮备液，再用 50%乙醇分别制成 5.0、10.0、12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL的标准物质工作溶液，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做标准曲线，线性回归方程为Y=3.7045X-4.133 8（R2=0.999）。
1.3.4 饮料中甜菊糖苷的酸水解
取空白饮料加入 5.0 μg/mL～100.0 μg/mL 甜菊糖苷溶液10 mL于50 mL具塞玻璃试管中，加入3 mmol/g路易斯酸催化剂，振荡混匀，在电热鼓风干燥箱中反应3.5 h后取出，冷却至室温，超声20 min后用乙醇定容，取上清液过膜，待上机检测，用峰面积-浓度标准曲线法定量计算产物中甜菊醇的含量，甜菊糖苷转化率计算公式如下。
式中：C1为按甜菊醇标准曲线得到的样品中甜菊醇浓度，μg/mL；V 为定容体积，mL；f为稀释倍数；0.395为甜菊醇转化甜菊糖苷的系数；m为样品中加入的甜菊糖苷含量，g。
1.3.5 单因素试验
本试验选用了常见的3种路易斯酸（氯化铁、氯化铝、氯化亚铜）进行对比试验，在相同处理条件下，选择甜菊糖苷转化率最高的路易斯酸作为催化剂，而后对可能影响水解效果的因素：甜菊糖苷浓度、催化剂含量、提取温度、提取时间进行单因素试验，考察以上各因素不同水平对甜菊糖苷转化率影响情况。
1.3.6 正交试验
在单因素试验基础上，以甜菊糖苷转化率为指标，选取催化剂含量（A）、甜菊糖苷浓度（B）、提取温度（C）、提取时间（D）4个影响因素进行L9（34）正交试验，优化提取参数，确定影响水解效果的主要因素，进行五因素四水平正交试验水平，从而确定路易斯酸催化甜菊糖苷为甜菊醇的最佳试验条件。正交试验设计表见表1。
表1 正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal test
水平 A催化剂含量/（mmol/g）D提取时间/h 1 3.0 2.5 B甜菊糖苷浓度/（mg/mL）250 2 3.5 3.0 3 4.0 3.5 275 300 4 4.5 4.0 325 C提取温度/℃80 90 100 110
1.3.7 回收率测定
根据GB 2760—2021《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》规定，甜菊糖苷在饮料中的最大使用限量值为200 mg/kg，样本分别选择5、10、100 mg/kg 3个添加浓度进行回收率试验，每个添加浓度进行6次平行测定。按照1.3.1制备样品，
1.4 数据处理
采用Origin9.1和SPSS22.0对各试验数据进行处理与分析，每个试验重复3次取平均值。
2 结果与分析
2.1 甜菊醇高效液相色谱条件的优化
对甜菊醇在流动相乙腈-水（体积比）为70∶30条件下的试验情况进行考察，结果如图1所示。
图1 甜菊醇标准品的色谱图
Fig.1 Chromatogram of steviol standard sample
由图1可知，随着有机相中乙腈比例的增大，保留时间逐渐减小，由15 min减少至8 min以内，且在8 min之前出峰，能达到良好分离效果，分析时间降低。
2.2 酸水解条件的优化
2.2.1 催化剂筛选
样品水解温度100℃，提取时间2 h，催化剂含量为3.0 mmol/g，甜菊糖苷浓度300 mg/mL，测定使用不同催化剂时甜菊糖苷的转化率，结果见表2。
表2 不同路易斯酸催化甜菊糖苷为甜菊醇的转化率
Table 2 Conversion rates of stevioside to steviol under the catalysis of different Lewis acids
催化剂种类 甜菊醇浓度/（μg/mL） 转化率/%氯化铁 117.23 60.56氯化铝 21.88 14.69氯化亚铜 未检出 未检出
由表2可知，氯化铁催化甜菊糖苷为甜菊醇的转化率远高于其余2种，氯化亚铜几乎无法催化甜菊糖苷水解得到甜菊醇。
2.2.2 催化剂含量的确定
样品水解温度100℃，提取时间2 h，甜菊糖苷浓度为300 mg/mL，测定不同氯化铁含量下甜菊醇的转化率，结果见图2。
图2 催化剂含量对水解效果的影响
Fig.2 Effect of catalyst content on hydrolysis
适当增加催化剂含量，会增加甜菊糖苷及其水解中间产物与催化剂的碰撞机会，从而加快水解效率，由图2可知，随着催化剂添加量的增加，甜菊糖苷的转化率逐渐提高，当催化剂达到3.0 mmol/g时，甜菊醇转化率最高，后续随着催化剂含量的继续增加，转化率逐渐下降，可能原因是催化剂加入量太大，无法完全溶解于溶液中。
2.2.3 甜菊糖苷浓度的确定
样品水解温度100℃，提取时间2 h，催化剂含量为3.0 mmol/g，测定不同甜菊糖苷浓度时甜菊醇的转化率，结果见图3。
图3 甜菊糖苷浓度对水解效果的影响
Fig.3 Effect of stevioside concentration on hydrolysis
底物的初始浓度会影响甜菊糖苷的水解速率和转化率，随着甜菊糖苷浓度的不断增加，溶液颜色逐渐从淡黄色加深至黑色。由图3可知，初始甜菊糖苷浓度较低时，甜菊糖苷的转化率较低，随着甜菊糖苷浓度的不断提高，转化率也不断提高，但在高浓度范围时，若继续增加甜菊糖苷浓度，溶液变得黏稠，在甜菊糖苷浓度达到350 mg/mL时，甜菊糖苷已无法完全溶解，同时在水解反应完成之后会出现结块状的沉淀，用乙醇定容时也将大大增加沉淀的溶解时间。考虑到试剂的使用量和试验效率，甜菊糖苷浓度为300 mg/mL时较为合适。
2.2.4 提取温度的确定
样品提取时间2 h，催化剂含量为3.0 mmol/g，甜菊糖苷浓度300 mg/mL，测定不同提取温度时甜菊糖苷的转化率，结果如图4。
图4 提取温度对水解效果的影响
Fig.4 Effect of extraction temperature on hydrolysis
由图4可知，在80℃～100℃内，随着提取温度的提高，甜菊糖苷的转化率不断提高，在100℃时转化率达到顶峰，但温度超过100℃后，随着温度的升高，甜菊糖苷转化率反而逐渐下降，可能原因是温度高于100℃后部分氯化铁出现碳化失去催化效果，导致催化效率下降，考虑到甜菊糖苷的转化效率，确定最优的提取温度为100℃。
2.2.5 提取时间的确定
样品水解温度100℃，催化剂含量为3.0 mmol/g，甜菊糖苷浓度300 mg/mL，测定不同提取时间下甜菊糖苷的转化率，结果见图5。
图5 提取时间对水解效果的影响
Fig.5 Effect of extraction time on hydrolysis
由图5可知，水解反应的时间对甜菊糖苷的转化率有一定影响，在提取时间3.0 h甜菊糖苷转化率最高，随着提取时间的延长，甜菊糖苷的转化率稍有下降。因此，提取时间为3.0 h最适宜。
2.2.6 正交试验结果分析
氯化铁催化甜菊糖苷为甜菊醇试验条件正交试验结果见表3，方差分析见表4。
表3 正交试验极差分析
Table 3 Range analysis of orthogonal test
序号 A催化剂含量B甜菊糖苷浓度C提取温度D提取时间 空白 转化率/%1 1 1 1 1 1 6.61 2 1 2 2 2 2 21.84 3 1 3 3 3 3 93.87 4 1 4 4 4 4 59.96 5 2 1 2 3 4 30.92 6 2 2 1 4 3 16.61 7 2 3 4 1 2 51.28 8 2 4 3 2 1 75.41 9 3 1 3 4 2 63.65 10 3 2 1 3 1 17.33 11 3 3 4 2 4 53.09 12 3 4 2 1 3 28.37 13 4 1 4 2 3 31.64 14 4 2 3 1 4 83.23 15 4 3 2 4 1 49.81 16 4 4 1 3 2 22.93 K1 182.28 132.83 63.48 155.49 119.16 K2 164.24 125.01 110.94 171.98 159.70 K3 162.43 228.05 292.16 165.05 170.49 K4 153.60 176.67 195.97 170.04 213.20 k1 45.57 33.21 15.87 38.87 29.79 k2 41.06 31.25 27.74 43.00 39.93 k3 40.61 57.01 73.04 41.26 42.62 k4 38.40 44.17 48.99 42.51 53.30极差 7.17 25.76 57.17 4.12 23.51
表4 正交试验方差分析
Table 4 Analysis of variance of orthogonal test
注：* 表示影响显著，P＜0.05。
误差来源 偏差平方和自由度 均方 F值 P 显著性催化剂含量 108.467 3 36.156 1.304 0.416甜菊糖苷浓度 413.336 3 137.779 4.968 0.110提取温度 6 896.550 3 2 298.850 82.892 0.002 *提取时间 449.776 3 149.925 5.406 0.100误差 83.199 3 27.733总计 14 521.399 16
根据极差值可见，氯化铁水解甜菊糖苷为甜菊醇影响因素主次顺序为提取温度＞甜菊糖苷浓度＞催化剂含量＞提取时间，分析得出水解甜菊糖苷最佳试验条件为提取温度100℃，甜菊糖苷浓度300 mg/mL，提取时间3.0 h，催化剂含量3.0 mmol/g。由表4的方差分析结果可知，提取温度的P＜0.01，具有极显著性影响。
2.2.7 验证试验
根据正交试验结果，最佳条件下得到水解甜菊糖苷转化率为93.66%。试验结果与试验组3相差不大，出于节约时间成本，选择A1B3C3D2，即水解温度100℃，甜菊糖苷浓度300 mg/mL，提取时间3.0 h，催化剂含量3.0 mmol/g。
2.3 检出限
以信噪比等于3为标准，测得甜菊醇的检出限为1.0 μg/mL。
2.4 方法精密度、回收率
高效液相色谱外标法测定加标量，结果见表5。
表5 加标回收率试验结果
Table 5 Test results of spiked recovery
样本 添加水平/（mg/kg） 回收率/%平均回收率/%相对标准偏差/%1 2 3 4 5 6绿茶饮料 5 80.7 80.1 82.9 88.6 84.3 82.7 83.2 3.67 10 82.9 84.7 83.8 88.9 86.9 82.2 84.9 3.00 100 91.5 92.6 93.2 90.5 93.3 92.6 92.3 1.17梨汁饮料 5 81.3 82.8 81.5 85.0 81.3 80.7 82.1 1.93 10 80.9 82.7 81.7 82.9 83.1 83.6 82.5 1.21 100 89.5 90.6 92.3 95.5 90.3 91.6 91.6 2.33碳酸饮料 5 81.6 80.8 80.8 86.2 80.5 81.2 81.9 2.65 10 81.2 80.3 82.9 84.2 85.3 81.2 82.5 2.37 100 92.6 90.2 91.9 92.3 91.5 93.6 92.0 1.24
由表5可知甜菊醇的平均回收率为81.9%～92.3%，相对标准偏差为1.17%～3.67%，均在检测允许的范围内，酸水解方法重复性良好。
3 结论
本试验采用酸水解提取，高效液相色谱法检测的方式，分别进行单因素试验，并在此基础上进行正交试验，通过正交分析得到各因素的影响主次顺序，其中提取温度最为主要，其次为甜菊糖苷浓度、催化剂含量、提取时间。最终确定化学法水解甜菊糖苷为甜菊醇的最佳条件：选用路易斯酸氯化铁，水解甜菊糖苷浓度300 mg/mL，温度100℃，提取时间3.0 h，催化剂添加量3.0 mmol/g，在此条件下测得甜菊糖苷转化率可达到93.87%。相比传统方式，本研究建立了一种HPLC检测饮料中甜菊糖苷的酸水解前处理方法，通过此法将甜菊糖苷水解为甜菊醇，并以测得的甜菊醇含量，换算出甜菊糖苷的含量。此方法简便快速高效，利于大批量检测。
[1]黄伟志.甜菊糖苷的功能及其在食品工业中的应用[J].江苏调味副食品,2021,(4):5-9,13.HUANG Weizhi.On the function of Stevia glycoside and its application in food[J].Jiangsu Condiment and Subsidiary Food,2021,(4):5-9,13.
[2]杨洋,李启明,高航,等.甜菊糖苷功能特性与应用现状[J].食品工业,2018,39(11):270-272.YANG Yang,LI Qiming,GAO Hang,et al.Functional properties and application status of stevioside[J].The Food Industry,2018,39(11):270-272.
[3]朱小聪.甜菊糖苷的功能特性及其在饮料工业中的应用[J].现代食品,2021(6):50-54.ZHU Xiaocong.The functional properties of steviol glycosides and their applications in the beverage industry[J].Modern Food,2021(6):50-54.
[4]韩仁娇,蓝航莲,王彩云,等.天然甜味剂——甜菊糖苷及其在食品中的应用[J].食品与发酵工业,2021,47(21):312-319.HAN Renjiao,LAN Hanglian,WANG Caiyun,et al.Advances on natural sweetener stevioside and its application in food[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(21):312-319.
[5]ROTIMI S O,ROTIMI O A,ADELANI I B,et al.Stevioside modulates oxidative damage in the liver and kidney of high fat/low streptozocin diabetic rats[J].Heliyon,2018,4(5):e00640.
[6]CHAVUSHYAN V A,SIMONYAN K V,SIMONYAN R M,et al.Effects of stevia on synaptic plasticity and NADPH oxidase level of CNS in conditions of metabolic disorders caused by fructose[J].BMC Complementary and Alternative Medicine,2017,17(1):540.
[7]CHATSUDTHIPONG V,MUANPRASAT C.Stevioside and related compounds:Therapeutic benefits beyond sweetness[J].Pharmacology&Therapeutics,2009,121(1):41-54.
[8]NOITEM R,YUAJIT C,SOODVILAI S,et al.Steviol slows renal cyst growth by reducing AQP2 expression and promoting AQP2 degradation[J].Biomedicine&Pharmacotherapy,2018,101:754-762.
[9]禹晓,杨媚,翟娅菲,等.甜菊糖苷在我国保健食品中的应用现状分析及思考[J].食品研究与开发,2018,39(7):215-220.YU Xiao,YANG Mei,ZHAI Yafei,et al.Analysis and reflection on the application status of stevioside in Chinese health food[J].Food Research and Development,2018,39(7):215-220.
[10]DEVLAMYNCK T,TE POELE E M,QUATAERT K,et al.Transα-glucosylation of stevioside by the mutant glucansucrase enzyme Gtf180-ΔN-Q1140E improves its taste profile[J].Food Chemistry,2019,272:653-662.
[11]张苹苹,王立勋,吉桂珍,等.高效液相色谱法同时测定甜叶菊中9种甜菊糖苷类化合物[J].中国食品添加剂,2020,31(6):105-111.ZHANG Pingping,WANG Lixun,JI Guizhen,et al.Simultaneous determination of nine steviosides in stevia by high performance liquid chromatography[J].China Food Additives,2020,31(6):105-111.
[12]周文清.高效液相色谱法检测运动饮料中甜菊糖苷[J].食品研究与开发,2017,38(1):161-164.ZHOU Wenqing.Analysis steviol glycosides in sports drink by high performance liquid chromatography[J].Food Research and Development,2017,38(1):161-164.
[13]陶忠义,王玉叶,谢澳,等.糠醛渣制备活性炭及其在提纯甜菊糖苷中的应用[J].广东化工,2021,48(9):85-86,91.TAO Zhongyi,WANG Yuye,XIE Ao,et al.Preparation of activated carbon from furfural residue and its application in purification of stevioside[J].Guangdong Chemical Industry,2021,48(9):85-86,91.
[14]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准食品添加剂使用标准:GB 2760—2014[S].北京:中国标准出版社,2015.National Health and Family Planning Commission of the People's Republic of China.National food safety standard Standards for the use of food additive:GB 2760—2014[S].Beijing:Standards Press of China,2015.
[15]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.出口食品中天然甜味剂甜菊糖苷、甜菊双糖苷、甘草酸、甘草次酸的测定高效液相色谱法:SN/T 3854—2014[S].北京:中国标准出版社,2014.General Administration of Quality Supervision,Inspection and Quarantine of the People's Republic of China.Determination of stevioside,rebaudioside A,glycyrrhizic acid and glycyrrhetinic acid in foods for export—HPLC method:SN/T 3854—2014[S].Beijing:Standards Press of China,2014.
[16]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准食品添加剂甜菊糖苷:GB 8270—2014[S].北京:中国标准出版社,2015.National Health and Family Planning Commission of the People's Republic of China.National food safety standard Food additives-Stevioside:GB 8270—2014[S].Beijing:Standards Press of China,2015.
[17]胡艳秋,石浩.甜菊醇及其衍生物的研究进展[J].浙江化工,2011,42(1):10-14.HU Yanqiu,SHI Hao.Research progress of steviol and its derivatives[J].Zhejiang Chemical Industry,2011,42(1):10-14.
[18]夏咏梅,方云,万会达.用β-葡萄糖苷酶催化水解甜菊苷制备甜菊醇的方法:CN102827891A[P].2014-01-22.XIA Yongmei,FANG Yun,WAN Huida.Method for preparing steviol by carrying out catalytic hydrolysis on stevioside by beta-glucosidase:CN102827891A[P].2014-01-22.
[19]TERAI T,REN H F,MORI G,et al.Mutagenicity of steviol and its oxidative derivatives in Salmonella typhimurium TM677[J].Chemical&Pharmaceutical Bulletin,2002,50(7):1007-1010.
[20]张宗英.斯替夫苷的酸催化水解及甜菊糖苷的抗氧化性[D].无锡:江南大学,2014.ZHANG Zongying.Hydrolyzing stevioside with acid catalyst and antioxidant activity of steviol glycosides[D].Wuxi:Jiangnan University,2014.
[21]NGUYEN T T H,KIM S B,KIM N M,et al.Production of steviol from steviol glucosides using β-glycosidase from Sulfolobus solfataricus[J].Enzyme and Microbial Technology,2016,93-94:157-165.
[22]张大永,吴晓明,汤湧.15-羰基甜菊醇衍生物和盐、制备方法及用途:CN101768075A[P].2012-05-23.ZHANG Dayong,WU Xiaoming,TANG Yong.15-carbonyl steviol derivative and salt as well as preparation method and application:CN101768075A[P].2012-05-23.
[23]张宗英,胡学一,夏咏梅.盐酸或氨基磺酸催化水解斯替夫苷制备甜菊醇[J].精细化工,2014,31(4):539-544.ZHANG Zongying,HU Xueyi,XIA Yongmei.Preparation of steviol through the hydrolysis of stevioside catalyzed by hydrochloric acid or sulfamic acid[J].Fine Chemicals,2014,31(4):539-544.
[24]万会达,夏咏梅,方云,等.一种制备甜菊醇的方法:CN104478706A[P].2015-04-01.WAN Huida,XIA Yongmei,FANG Yun,et al.Method for preparing steviol:CN104478706A[P].2015-04-01.
[25]隆金桥,陈华妮,黎远成.路易斯酸催化剂的研究进展[J].广东化工,2011,38(4):12,26.LONG Jinqiao,CHEN Huani,LI Yuancheng.Research progress of Lewis acid catalyst[J].Guangdong Chemical Industry,2011,38(4):12,26.