肉类食品中含有丰富的蛋白质、维生素、矿物质等人体必需的营养元素，是我国居民常见食物的重要组成部分。肉及肉制品掺假是指向肉制品中掺入或替换形态相似、价格廉价的非同种肉类[1]。这些掺假直接影响了人们的身体健康和消费信心，对整个食品行业的信誉造成了不良影响。针对肉类掺假的检测，目前常用鉴别分析的技术主要有光谱检测[2-3]、蛋白质检测[4-5]和核酸检测[6-8]。由于DNA分子具有高度的稳定性，同时在物种鉴定中也具有巨大的优势，核酸检测已成为肉类掺假检测的主流技术[9-10]。肉类掺假的核酸检测方法包括常规聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）[11-12]、实时荧光定量 PCR[13]、数字 PCR[14]及DNA条形码[15-16]等。目前各种动物源性成分检测标准几乎全部使用实时荧光PCR方法，例如GB/T 38164—2019《常见畜禽动物源性成分检测方法》规定了23种动物的实时荧光PCR检测方法[17]，能对常见畜禽动物源性成分进行检测，但是实时荧光PCR方法检测时间长，仪器昂贵，且探针需要荧光基团修饰，检测成本增加，限制了其在肉类样本快速筛查中的应用。
G-四链体是一种富含鸟嘌呤的序列，由4对以胡斯坦碱基配对方式（hoogsteen pairing）配对形成的共面鸟嘌呤堆叠而成，并且与通过钾离子、钠离子等阳离子的配位结合来稳定自身结构[18-19]。近年来有很多基于G-四链体显色和显荧光的报道[20-23]，其中Mohanty等[24]发现硫磺素T能与G-四链体结合并且发出较强的荧光，且它与双链或单链DNA结合时荧光背景低。随后 22Ag、45Ag、27Kras、32Kras等一系列能与硫磺素T结合显荧光的G-四链体被报道[25]，并作为探针被使用到核酸、金属离子、小分子的检测领域[26-29]，但目前鲜见关于PCR后可视化检测的研究。
本文利用G-四链体与硫磺素T结合能发出荧光的特性，开发了PCR可视化检测方法，并针对猪细胞色素B基因设计特异性引物，应用到猪源性可视化检测中。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鲜肉类样品（猪肉、牛肉、羊肉、兔肉、鸡肉、鸭肉）：市售。样品采集后清洗并储存于-20℃冰箱。
3种含肉食品样品名称分别为鸡汁鲜肉包、麻辣牛肉包、三鲜猪肉饺（蒸饺），含肉类型分别为猪肉、牛肉、猪肉。
3173 DNA Polymerase、PCR缓冲液试剂：新海基因检测有限公司；硫磺素T：北京伊诺凯科技有限公司；动物组织基因组DNA提取试剂盒：成都福际生物技术有限公司；RapidFinderTMPork ID试剂盒：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；引物、探针、dNTP、Tris：生工生物工程（上海）有限公司；DNA聚合酶（EasyTaq DNA Polymerase）、EasyTaq缓冲液、Trans 2K Plus DNA Marker、6×loading dye：北京全式金生物技术有限公司；琼脂糖粉：西班牙biowest公司。
1.2 仪器与设备
TC-96/G/H（b）B基因扩增仪：杭州博日科技股份有限公司；BD-BRV1蓝光实时观测仪：无锡博弗瑞德生物科技有限公司；BSA224S电子分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；DYY-4C凝胶电泳系统：北京六一生物技术有限公司，BCD-2115DC Haier冰箱：海尔集团；Typhoon FLA 7000 IP激光扫描成像仪：美国GE Healthcare 公司；NanoDrop Lite、Fresco-21 微量台式冷冻离心机：美国Thermo Scientific公司；Votex-5漩涡振荡器：海门其林贝尔仪器制造有限公司；DH300干式恒温仪：杭州瑞诚仪器有限公司；CFX96实时荧光定量PCR仪：美国BIO-RAD公司。
1.3 方法
1.3.1 试验原理
在PCR体系中加入正反特异性引物（引物1和引物2）、G-四链体序列和硫磺素T。其中引物1和引物2的3′端核酸片段（红色和绿色区域）分别能作为正反引物与目标DNA模板杂交，5′端核酸片段（黄色区域）能与G-四链体（蓝色区域）完全互补。在常温下，G-四链体序列与引物的5′端序列通过DNA碱基互补作用形成双链，能使G-四链体处于封闭状态，不能与硫磺素T结合产生荧光（图1A）。PCR循环时，94℃高温变性时待测DNA双链打开，65℃退火和72℃延伸时引物1和2结合到待测DNA链上，在DNA聚合酶的作用下开始延伸（图1B）。随后，引物1和引物2又能分别与B步骤中生成的模板杂交并延伸，新生成的模板两端都加了一段G-四链体和G-四链体封闭序列（图1C）。由于PCR体系中所用的DNA聚合酶缺乏5′-3′外切酶活性，因此当引物延伸到黄色区域时，能产生新的G-四链体序列，而原本与其结合的G-四链体序列（蓝色区域）就会脱落下来。在接下来的PCR循环中，引物1和引物2能与步骤C中产生的长模板杂交并延伸，不断释放引物上原本结合的G-四链体序列（图1D）。PCR结束后，由于反应中含有K+，因此释放的G-四链体序列在室温下能自我折叠成G-四链体，与PCR体系中已加入的硫磺素T结合能产生荧光，将PCR管直接置于波长为440 nm～485 nm的蓝光实时观测仪下，肉眼能观测到荧光（图1E）。而在没有目标DNA模板存在的情况下，由于PCR反应不会发生，G-四链体序列不能释放，从而也不会产生荧光。
图1 基于G-四链体与硫磺素T的PCR可视化检测示意图
Fig.1 The scheme of PCR based G-quadruplex and Thioflavin T
1.3.2 引物设计
选用美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库猪线粒体基因组中细胞色素B的保守序列作为目标序列设计正反特异性引物；在正向引物和反向引物5′端增加一段与G-四链体互补的序列，作为可视化PCR引物，分别命名为引物1和引物2；选用的G-四链体序列为27Kras。引物和DNA序列如表1所示。
表1 引物和DNA序列
Table 1 Primer and DNA sequences
名称 序列PCR 正向引物 5′-GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA-3′PCR 反向引物 5′-GACCTCCCAGCCCCATCAAACATCTCATCATGATGAAA-3′引物 1 5′-CCCCTCTTCCCTCTTCCCACACCGCCCGCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA-3′引物 2 5′-CCCCTCTTCCCTCTTCCCACACCGCCCCCTCAAACATCTCATCATGATGAAA-3′G-四链体（27Kras） 5′-GGGCGGTGTGGGAAGAGGGAAGAGGGG-NH2-3′
1.3.3 样品制备
鲜肉及含肉食品样品分别用分析天平称取200mg，用双蒸水清洗干净，捣碎，使用动物组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱法）按照使用说明书进行提取纯化。最后得到100 μL DNA溶液，测定浓度和纯度，用作PCR模板。
1.3.4 普通PCR及电泳成像
总反应体系为 20 μL：Easy Taq DNA Polymerase 0.5 μL，10×PCR Buffer 4 μL，dNTP（10 mmol/L）0.4 μL，PCR 正向引物 （10 μmol/L）1.6 μL，PCR 反向引物（10 μmol/L）1.6 μL，模板 DNA 0.5 μL，加水补足 20 μL。
反应程序：94℃1min 预变性；94℃10s，65℃30s，72℃ 30 s，30个循环；72℃ 1 min。
制备2%琼脂糖凝胶，放入电泳槽中，加入足够的三羟甲基氨基甲烷乙酸盐-乙二胺四乙酸（tris acetateethylene diamine tetraacetic acid，TAE）缓冲液，取 5 μL PCR 产物混合 1 μL 6×DNA Loading Buffer，加入上样孔中。取5 μl DNA Marker加入另一上样孔中。设置适当的电流和电压进行电泳10 min。拿出放入凝胶扫描成像仪进行检测。1.3.5 可行性分析
1.3.5.1 G-四链体与硫磺素T的荧光考察
总反应体系为 20 μL：5×Best PCR Buffer 4 μL，G-四链体 27Kras（10 μmol/L）分别取 0、1、2、3 μL，硫磺素 T（100 μmol/L）3 μL，加水补足 20 μL。另取一管只加缓冲液和水，不加G-四链体27Kras和硫磺素T作为空白对照。
混匀瞬时离心后，置于PCR仪中，反应程序：94℃1 min 预变性；94℃ 10 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72℃1 min。PCR结束后，PCR管降温至室温，置于波长为440 nm～485 nm的蓝光实时观测仪下肉眼观测荧光。
1.3.5.2 引物1和引物2封闭G-四链体背景考察
总反应体系为 20 μL：5×Best PCR Buffer 4 μL，27Kras（10 μmol/L）3 μL，硫磺素 T（100 μmol/L）3μL，引物 1（10 μmol/L）和引物 2（10 μmol/L）各 0、0.4、0.8、1.6 μL，加水补足 20 μL。另取一管只加缓冲液、硫磺素T和水，不加G-四链体27Kras和引物作为空白对照。
混匀瞬时离心后，置于PCR仪中，反应程序：94℃1 min预变性；94 ℃ 10 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72℃1 min。PCR结束后，PCR管降温至室温，置于波长为440 nm～485 nm的蓝光实时观测仪下肉眼观测荧光。
1.3.6 可视化PCR检测
总反应体系为 20μL：3173 DNA Polymerase 0.5 μL，5×Best PCR Buffer 4 μL，dNTP（10 mmol/L）0.4 μL，引物 1（10 μmol/L）1.6 μL，引物 2（10 μmol/L）1.6 μL，27Kras（10 μmol/L）3 μL，硫磺素 T（100 μmol/L）3 μL，模板 DNA 0.5 μL，加水补足 20 μL。
反应程序：94℃1min预变性；94℃10s，65℃30s，72℃ 30 s，35个循环；72℃ 1 min。
将PCR反应后的PCR管降温至室温，直接置于波长为440 nm～485 nm的蓝光实时观测仪下肉眼观测荧光。
1.4 数据分析
本试验采用Typhoon FLA 7000 IP激光扫描成像仪对PCR产物进行凝胶电泳后的胶进行观察并分析以验证引物的特异性。采用BD-BRV1蓝光实时观测仪对可视化PCR试验结果进行肉眼观察，通过荧光强弱进行分析。采用CFX96实时荧光定量PCR仪进行国家标准猪源性实时荧光PCR法试验，并采用自带分析软件对结果进行扩增曲线的分析。
2 结果与分析
2.1 DNA提取结果
鲜肉样品提取后，通过超微量紫外可见分光光度计测定浓度，均在70 ng/μL左右，OD260/OD280均约为1.8，纯度良好。含肉食品样品提取后，鸡汁鲜肉包、麻辣牛肉包、三鲜猪肉饺中提取到的DNA浓度分别为34、41、11 ng/μL，DNA 纯度均良好。
2.2 引物特异性验证
以不同肉源DNA为模板进行普通PCR扩增，将DNA产物进行琼脂糖凝胶电泳，验证引物特异性，结果如图2所示。
图2 不同肉源普通PCR琼脂糖凝胶电泳图
Fig.2 Agarose gel electrophoresis of normal PCR for diverse meat
图2显示仅以猪肉DNA为模板时出现扩增条带。将PCR产物测序，测序峰单一，测序结果在基于局部序列比对算法的搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）中均只比对出猪的基因序列，且100%相似。可见该引物仅仅对猪肉DNA产生特异性扩增，特异性良好。
2.3 可行性分析
2.3.1 G-四链体与硫磺素T的荧光考察
本文中硫磺素T的浓度参考可视化检测相关文献中[27]的浓度，终浓度为15 μmol/L。由于本方法最终需要应用到PCR中，因此需要考察在PCR缓冲液中，G-四链体27Kras与硫磺素T在经过PCR程序多轮升降温后，最终的显荧光效果。使用终浓度为0～1.5 μmol/L的G-四链体27Kras与15 μmol/L硫磺素T结合，经过PCR程序，降至室温后观测荧光，如图3所示。
图3 不同浓度G-四链体与硫磺素T产生荧光
Fig.3 Fluorescence from gradient G-quadruplex and thioflavin T
结果发现 0.5 μmol/L～1.5 μmol/L 的 G-四链体27Kras都能与硫磺素T结合产生荧光，其中1.5 μmol/L效果较好。
2.3.2 G-四链体背景考察
本方法可行的前提是引物1和引物2能将G-四链体序列封闭住，在没有目标DNA模板时，不产生背景荧光；并且经过PCR程序多次升降温后，依然能保持不产生背景信号。因此本试验将不同浓度引物1和引物2与G-四链体27Kras及硫磺素T混合，经过PCR程序，降温后观测引物对G-四链体的封闭效果。结果见图4。
图4 G-四链体与引物的荧光背景
Fig.4 Background fluorescence of G-quadruplex and primers
图4 结果显示：0.4、0.8、1.6 μmol/L 的引物能封闭G-四链体27Kras，其中1.6 μmol/L效果较好。
2.4 可视化PCR特异性试验
分别取猪、牛、羊、兔、鸡、鸭6种不同动物的肉，通过试剂盒提取组织基因组DNA，进行可视化PCR试验，结果如图5所示。
图5 不同肉源可视化PCR特异性试验
Fig.5 Specificity of visual PCR for diverse meat
设计的可视化特异性引物仅在以猪肉DNA为模板的反应体系中产生荧光，以其他肉类DNA为模板的反应体系荧光为阴性，与空白对照一致。证明了该引物有良好的特异性，能有效且可靠地反映出体系中猪肉DNA的存在。
2.5 可视化PCR检出限试验
通过对不同浓度（1.000、0.500、0.250、0.100、0.050、0.025、0.010 ng/μL） 猪肉 DNA 模板的可视化PCR，结果如图6所示。
图6 可视化PCR检出限试验
Fig.6 Detection limit for visual PCR
由图6可知，不同猪肉DNA浓度下可视化PCR产物的荧光强度不同，猪肉DNA浓度越低，则荧光强度越低，在猪肉DNA浓度仅为0.010 ng/μL时也有荧光信号差，该试验得到可视化PCR对猪肉DNA的检出限是 0.010 ng/μL。
2.6 灵敏度试验
将猪肉DNA模板与牛肉DNA模板以不同比例混合制成猪肉DNA占比不同的混合样品，进行灵敏度测试，结果如图7所示。
图7 混合DNA样品灵敏度试验
Fig.7 Sensitivity of mix DNA samples
由图7可见仅含1%的猪肉DNA的混合样品也能检测出荧光，与纯牛肉DNA模板有肉眼可见的荧光信号差。证明了该方法能够灵敏地在混合样品中检出低量的猪肉源DNA序列。
2.7 3种含肉食品样品鉴别
以3种含肉食品样品提取的DNA为模板，进行可视化PCR，检测结果如图8所示。
图8 3种含肉食品样品可视化PCR鉴别
Fig.8 Visual PCR identification of commercial food samples containing meat
3种含肉食品样品均显荧光，说明均检测出猪源性DNA。其中鸡汁鲜肉包和麻辣牛肉包为纯肉馅，提取的DNA浓度更高，荧光较强；三鲜猪肉饺中混有蔬菜等配菜，所以提取出来的DNA浓度更低，可视化PCR得到的荧光强度也更低。
用国家标准GB/T 38164—2019《常见畜禽动物源性成分检测方法》中猪源性实时荧光PCR方法对以上结果进行了验证，结果如图9所示。
图9 3种含肉食品样品实时荧光PCR鉴别
Fig.9 Real-time fluorescent PCR identification of food samples containing meat
结果发现3种样品均出现了扩增曲线，说明了本文中的可视化PCR方法适用于真实样品的检测，可以鉴别常见的猪肉充当牛肉的掺假行为。
3 讨论与结论
针对肉类掺假常见的检测方法中，实时荧光PCR方法是目前肉类掺假核酸检测应用最广的方法，有灵敏度高、特异性强、适用范围广的优点，但依赖于昂贵的荧光实时PCR仪和荧光基团修饰的探针；与实时荧光PCR法相比，可视化核酸检测方法仪器依赖度低、试剂廉价，而且检测结果更加直观，但目前已有的可视化核酸检测方法大多需要在反应后，开盖加入荧光染料或显色试剂，才能发生该荧光或颜色的变化，从而进行可视化检测，由于需要开盖，这种方法极易发生PCR产物污染，对条件简陋的基层食品检验机构的检测准确度带来挑战。
本文以G-四链体和硫磺素T为报告体系，建立了PCR可视化检测方法，并应用到猪源性可视化检测中。该方法仅需要普通基因扩增仪和蓝光灯这类简单仪器，在PCR后直接肉眼观测荧光而判读结果，无需开盖，避免了PCR产物污染问题的发生。通过对市售的牛、羊、兔、鸡、鸭肉对比，所建立的猪源性可视化检测方法特异性良好，针对猪肉DNA的检测限达到0.01 ng/μL，灵敏度高，可在混合肉DNA样品中检出1%的猪肉，并且成功地在含肉食品样品中检测出了猪源性DNA，实现了食品样本的检测，且反应在50 min内完成。相较常用的实时荧光PCR既缩短了时间，又不需要使用更昂贵的荧光PCR仪，且无需荧光基团修饰的探针，降低了检测成本；反应无需开盖操作，不依赖于标准的PCR实验室，能够通过肉眼直接观测到定性检测结果，适合在简单的条件下进行快速定性检测，是配合便携式PCR仪和手持蓝光灯，即可实现现场快速定性检测，便于市场监管部门对市售肉制品甚至餐饮行业的猪肉掺假行为进行快速临检抽查。
检测方法的特异性主要依赖于特异性的引物，所以也可开发设计其他肉类，甚至其他生物样品的DNA可视化快速定性检测。该方法的建立对于鼠肉、马肉、鸭肉等掺假其他肉类，以及植物类食品中的掺假，甚至食品中微生物检出等领域都有一定的借鉴意义。
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