农药残留一直是影响农产品安全的重要因素，其中有机磷农药被大量用于农业生产中。由于农户在实际生产中超量、超范围使用农药，导致农产品农药残留超标。氧乐果属于有机磷农药的一种，在我国农业生产中使用很广泛，有强杀虫作用[1]。经研究报道，氧乐果有比较长的残留期，而且会给环境和人体带来危害[2]。因此，检测氧乐果残留对农产品质量安全的控制具有重要意义。
常见检测氧乐果农药的传统方法有气相色谱法[3]、气相色谱与质谱联用法[4]、高效液相色谱法等[5]；这些传统的检测方法的优点是精确度高、重现性较好、检测范围广；缺点是仪器设备比较昂贵、样品处理复杂、需要非常专业的人员才可操作、检测耗时长等[6-9]。表面增强拉曼散射（surface enhanced Raman scattering，SERS）技术与传统的氧乐果检测方法相比，具有无损、快速、制样简单、成本低廉、灵敏度高等优点[10]。
目前，SERS技术在有机磷农药残留检测方面的应用吸引了许多专家学者的关注[11-14]。Wu等[15]利用金纳米棒结合SERS技术建立了农药快速检测平台，用于检测被甲基对硫磷污染的湖水、苹果、橘子以及树叶，在湖水中的检出限为1 μmol/L，在水果和植物叶片表面的检出限为 110 ng/cm2～440 ng/cm2。Xu 等[16]利用表面活性剂合成了爆米花状的金纳米颗粒，作为便携式拉曼光谱仪检测毒死蜱的SERS活性底物。爆米花状的金纳米尖端之间形成“热点”，有效地增强体系的SERS信号，该体系用于检测水果样品中微量毒死蜱残留，检出限达到1 μmol/L。Yaseen等[17]建立了一种基于涂银金纳米颗粒（Au@Ag NPs）的SERS方法，验证了Au@Ag NPs的拉曼增强作用强于单个Ag和AuNPs，并能快速检测桃中的多种有机磷农药（三唑磷和甲基对硫磷）。桃中三唑磷和甲基对硫磷的检出限为0.001 mg/kg，回收率达到93.36%～123.6%。可见SERS技术用于检测农药残留技术已有成熟的研究基础。
SERS与酶结合用于检测农药残留也有报道。蓝昊宁[18]利用羧基活化的水凝胶能吸附生物大分子的特点，在水凝胶上功能化修饰了乙酰胆碱酯酶，开发了基于乙酰胆碱酯酶的SERS检测对氧磷的方法。乙酰胆碱酯酶水解硫代乙酰胆碱生成具有拉曼信号的硫代胆碱，而对氧磷可以抑制酶的活性，减少硫代胆碱的生成，相应的拉曼信号也同比减弱，据此建立了对氧磷农药的定量检测分析方法，其检测限达到1 ng/mL。El Alami等[19]提出了一种使用SERS技术和化学计量学结合的新方法，可以定性和定量检测有机磷农药。该方法用于对氧磷的检测，其检测限为4.0×10-9μmol/L。酶的使用使得农药的检出限远低于通过直接SERS分析获得的检出限。目前关于SERS与酶催化反应相结合检测氧乐果的研究较少，本文利用酶催化反应产物对SERS基底团聚的影响来建立一种简单、灵敏、快速检测痕量氧乐果的方法，为实现氧乐果农药残留的快速定性和定量提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料和仪器
拉曼光谱仪（DXR smart）：美国 Thermo公司；荧光分光光度计（F-7000）：日本日立公司；场发射扫描电子显微镜（S-4800）：日立高新技术公司；电热恒温水浴锅（HH-S2）：金坛市大地自化仪器厂；超声波清洗仪（SK5200B）：上海科导超声仪器有限公司；漩涡仪（XW-80A）：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；高速冷冻离心机（5804R）：德国艾本德股份公司。
乙酰胆碱酯酶、碘化乙酰硫代胆碱：上海源叶生物科技有限公司；氯金酸、四氧化三铁：国药集团化学试剂有限公司；柠檬酸三钠：广东汕头西陇化工厂；氧乐果、联苯菊酯、吡虫啉、哒螨灵、啶虫咪（均为标准溶液）：坛墨质检科技股份有限公司；维多利亚蓝B：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；四石墨化碳黑：上海罗恩试剂有限公司；磷酸、无水硫酸镁：广东光华科技股份有限公司；干绿茶叶：广西克鲁尼茶叶生物科技有限公司（产自福建）。以上化学试剂均为分析纯。
1.2 金纳米溶胶的制备
取120 mL超纯水放入250 mL锥形瓶中，依次加入7 mL 1%的柠檬酸三钠、1 mL 1%的氯金酸，将混合溶液摇匀立即放入水浴锅中，100℃加热30 min，反应完成后再立即放入30℃水中冷却30 min，得到0.78 μg/mL金纳米溶胶。冷却后的金纳米溶胶放入4℃冰箱中备用。
1.3 氧乐果SERS检测光谱采集
取浓度分别为 3.5、103.5、203.5、303.5、403.5 ng/L的氧乐果标准溶液150 μL，与100 μL 0.05 mg/mL的乙酰胆碱酯酶混合置于37℃水浴锅中活化15 min，活化结束后立即加入20 μL 0.25×10-3mol/L的碘化乙酰硫代胆碱，摇匀并放置于37℃水浴锅中反应15 min，反应后室温静置10min。然后取20μL上述反应液加入到500 μL 0.78 μg/mL 的金纳米溶胶中，静置 15 min，观察金纳米溶胶的颜色变化，最后滴加50 μL 1×10-5mol/L的VBB溶液，再用超纯水定容到2 mL，立即采集1 614 cm-1处的拉曼峰值信号强度（I）；不加氧乐果溶液作为空白，测定空白的拉曼峰值信号强度（I0），计算ΔI=I-I0。绘制氧乐果工作曲线。数据采集时，拉曼光谱仪的参数设置为激光波长633 nm，激光功率4.0 mW，采集时间10 s。
1.4 氧乐果检测体系共振瑞利散射（resonant rayleigh scattering，RRS）光谱采集
反应体系的试验步骤同1.3，最后滴加50 μL 1×10-5mol/L的VBB溶液，再用超纯水定容到2 mL，立即采集RRS光谱。
1.5 扫描电镜样品制备
分别取3.5、403.5 ng/L的氧乐果标准溶液150 μL，与100 μL 0.05 mg/mL的乙酰胆碱酯酶混合置于37℃水浴锅中活化15 min。活化结束后立即加入20 μL 0.25×10-3mol/L的碘化乙酰硫代胆碱摇匀并放置于水浴锅中37℃反应15 min，反应后室温静置10 min。然后取 20 μL 上述反应液加入到 500 μL 0.78 μg/mL 的金纳米溶胶中，静置15 min，最后滴加50 μL 1×10-5mol/L的VBB溶液，用超纯水定容到2 mL；不加前述反应液用超纯水稀释金纳米溶胶至2 mL做空白对照。制备完成进行电镜扫描。
1.6 干扰试验
按照氧乐果检测平台SERS光谱采集试验方法，在氧乐果浓度为203.5 ng/mL的检测体系中分别添加20.35 μg/L Mg2+、Na+、Cu2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、K+、NH4+、CO32-、SO42-、Cl-、HCO3-、联苯菊酯、吡虫啉、哒螨灵、啶虫脒，所有添加的干扰物质浓度均为氧乐果浓度的100倍。采集SERS数据，判断是否影响检测体系。
1.7 影响因素优化
在酶活化水浴温度和酶催化反应水浴温度都为37℃并且所取反应液体积固定为20 μL的条件下，分别对检测体系中酶活化时间（0、5、10、15、20、25、30 min）、酶催化反应时间（0、5、10、15、20、25 min）、催化反应静置时间（0、4、7、10、13、16 min），以及金纳米溶胶加入反应液后的静置时间（0，5、10、15、20、25min）、乙酰胆碱酯酶浓度（0、1、2、3、4、5、6 μg/mL）、碘化乙酰硫代胆碱浓度（0、1、2、3、4、5、6、7 μmol/L）、金纳米溶胶浓度（0、0.105、0.135、0.165、0.195、0.225、0.255μg/mL）、VBB 浓度（0、0.05、0.25、0.45、0.65、0.85 μmol/L）进行优化。采集1 614 cm-1处的拉曼峰值信号强度（I）。以不加氧乐果溶液作为空白，测定空白的拉曼峰值信号强度（I0），计算 ΔI=I-I0。
1.8 干绿茶叶样品制备与检测
称取5g茶叶样品，研磨成粉末，放入50mL离心管中，加入25 mL丙酮，漩涡1 min，超声辅助提取2 min，然后放入离心机以4 200 r/min离心5 min，取悬浮液1 mL定容至20 mL用于配制203.5 ng/L氧乐果标准样液；量取6 mL 203.5 ng/L氧乐果标准样液于10 mL离心管中，称取0.3 g四氧化三铁、0.15 g石墨化碳黑、600 mg无水硫酸镁加入到6 mL标准样液中，混合振荡1 min，以4 500 r/min转速离心5 min，去除基质中叶绿素、矿物质、茶多酚、碳水化合物等物质对检测的干扰[20-21]，取上清液按照氧乐果检测SERS光谱采集试验方法，平行5次对绿茶样品进行加标回收试验。
2 结果与分析
2.1 氧乐果SERS光谱
体系添加不同浓度的氧乐果后SERS信号变化见图1。
图1 氧乐果SERS光谱图
Fig.1 SERS spectrum of omethoate
由图1可知，随着氧乐果浓度的增加，体系的SERS强度逐渐升高，说明氧乐果浓度越高，对乙酰胆碱酯酶的抑制作用越强，使得催化作用减弱，硫代胆碱的生成减少，对金纳米溶胶的强聚集作用也相应减弱，体系SERS强度升高。同时，随着氧乐果浓度升高，金纳米溶胶的颜色呈梯度变化，颜色由灰色变为紫色再变成紫红色。
2.2 氧乐果检测体系RRS光谱
体系添加不同浓度的氧乐果后RRS信号变化见图2。
图2 氧乐果检测体系RRS光谱图
Fig.2 RRS spectra of the detection system of omethoate
a～f分别表示氧乐果浓度为 0、3.5、103.5、203.5、303.5、403.5 ng/L。
由图2可以看出，随着氧乐果浓度越来越高，金纳米溶胶强聚集的程度越低，RRS吸收光谱图中峰高增大，并且吸收峰逐渐呈现规律性蓝移。这就说明，金纳米溶胶强聚集程度随着氧乐果浓度的增大而减小，散射吸收峰的蓝移也说明金纳米出现了规律性的聚集现象。散射强度随着氧乐果浓度的增大而增大，与图1中SERS信号增强的现象一致。
2.3 扫描电镜
使用扫描电镜对金纳米溶胶颗粒的分布和表面形态进行观察，结果见图3～图6。
图3 氧乐果浓度为0 ng/L电镜图
Fig.3 Electron microscopy image of 0 ng/L omethoate
图4 氧乐果浓度为3.5 ng/L电镜图
Fig.4 Electron microscopy image of 3.5 ng/L omethoate
图5 氧乐果浓度为403.5 ng/L电镜图
Fig.5 Electron microscopy image of 403.5 ng/L omethoate
图6 空白对照电镜图
Fig.6 Electron microscopy image of blank control
如图3所示，在氧乐果检测体系中，溶液中没有添加氧乐果时，乙酰胆碱酯酶的催化作用不受抑制，生成硫代胆碱量最多，金纳米在硫代胆碱作用下高度聚集；如图4所示，当添加氧乐果浓度为3.5 ng/L时，低浓度的氧乐果抑制乙酰胆碱酯酶催化作用较小，胆碱生成量较多，金纳米粒子聚集程度较图3稍低；如图5所示，当溶液中氧乐果浓度为403.5 ng/L时，高浓度的氧乐果抑制乙酰胆碱酯酶催化作用，胆碱生成量较少，金纳米粒子分布相对较为分散；图6为空白对照组，没有添加乙酰胆碱酯酶和碘化乙酰硫代胆碱，金纳米粒子分散分布，没有聚集的现象。结果表明，氧乐果可以间接调控金纳米溶胶的聚集程度，并以此建立检测氧乐果的检测平台。
2.4 氧乐果SERS检测条件优化
对影响氧乐果检测体系的条件进行优化，结果如图7所示。
图7 氧乐果SERS检测条件优化
Fig.7 Optimization of SERS detection conditions for omethoate
由图7可知，当试验中所用水浴温度都固定为37℃，所取反应液体积固定为20 μL，酶活化时间为15 min，酶催化反应时间为15 min，反应后静置10 min，金纳米溶胶滴加反应液后静置时间为15 min，检测体系中乙酰胆碱酯酶、碘化乙酰硫代胆碱、金纳米溶胶、VBB 的浓度分别为 5 μg/mL、5 μmol/L、0.195 μg/mL、0.25 μmol/L条件下，体系ΔI达到最大值。故选取以上条件为最佳检测条件。
2.5 工作曲线
以氧乐果浓度（ng/L）对ΔI绘制工作曲线，结果见图8。
图8 氧乐果检测工作曲线
Fig.8 Working curve of omethoate detection
由图8可知，氧乐果在3.5 ng/L～403.5 ng/L浓度范围内与ΔI呈线性关系，其回归线性方程为y=5.618x+42.003，相关系数 R2=0.995 8，检出限为 1.90×10-4ng/L。
2.6 干扰试验
考察了常见离子、共施农药在氧乐果浓度为203.5 ng/L时，对检测体系干扰情况，结果见表1。
表1 干扰物质影响Table 1 Effect of interfering substances
共存物质相对误差/%Mg2+ 20.35 2.82 CO32- 20.35 0.67 Na+ 20.35 -2.66 SO42- 20.35 2.61 Cu2+ 20.35 2.47 Cl- 20.35 2.45 Zn2+ 20.35 1.72 HCO3- 20.35 -1.80 Ca2+ 20.35 2.61 联苯菊酯 20.35 2.10 Ba2+ 20.35 0.90 吡虫啉 20.35 -3.45 K+ 20.35 -0.84 哒螨灵 20.35 1.70 NH4+ 20.35 1.44 啶虫脒 20.35 3.40浓度/（μg/L）相对误差/%共存物质浓度/（μg/L）
从表1中可以看出，在相对误差不超过±10%范围内，20.35 μg/L Mg2+、Na+、Cu2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、K+、NH4+、CO32-、SO42-、Cl-、HCO3-不干扰测定。20.35 μg/L 联苯菊酯、吡虫啉、哒螨灵、啶虫脒不干扰测定；从而说明该方法具有较好的选择性。
2.7 干绿茶叶样品分析
对干绿茶叶样品分析结果见表2。
表2 干绿茶叶样品分析结果
Table 2 Detection results of dry green tea samples
氧乐果测定值/（ng/L）相对标准偏差/%0 203.5 201.51 99.02 1.17氧乐果加入量/（ng/L）平行5次测定的平均值/（ng/L）回收率/%
如表2所示，根据试验方法对干绿茶叶进行5次平行加标回收试验，回收率可达到99.02%，相对标准偏差为1.17%。
3 结论
试验利用表面增强拉曼散射结合酶催化反应构建了氧乐果的快速检测方法。经过对影响条件优化，当水浴温度为37℃，反应液体积固定为20 μL，酶活化时间为15 min，催化反应时间为15 min，催化反应结束后静置10 min，接着滴加金纳米溶液反应液后静置时间为15min的条件下，氧乐果成功抑制乙酰胆碱酯酶和碘化乙酰硫代胆碱的催化反应，间接控制硫代胆碱的生成。金纳米溶胶聚集程度在氧乐果浓度3.5 ng/L～403.5 ng/L浓度范围内呈正相关关系，以VBB为SERS的探针分子，根据VBB的SERS信号变化建立了氧乐果浓度范围在3.5 ng/L～403.5 ng/L痕量检测方法。该方法用于加标检测干绿茶叶中的痕量氧乐果，回收率为99.02%，相对标准偏差为1.17%，检出限为1.90×10-4ng/L。
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