利用微生物发酵药食同源植物，可以通过微生物的分解作用，将原料代谢转化为更容易被吸收的产物，从而增加其药用价值或者产生某种新的功效[1-2]。现在的一些功能性产品就是通过乳酸菌、酵母菌等有益微生物发酵蔬菜、水果或中药材，利用微生物的生长和代谢所产生的[3-4]，这些产品含有丰富的初级代谢产物和次生代谢产物等营养成分，拥有良好的抗衰老、抗氧化、降血脂、保肝护肝等功能活性[5-8]，是目前功能性发酵食品行业的研究热点和产品开发重点。
马齿苋（Portulaca oleracea L.）为马齿苋科一年生肉质草本植物，是一种药食同源植物[9-11]。现代医学研究证实，马齿苋具有清热解毒、抗菌、抗氧化、抗衰老、降血压、镇痛、消炎等作用[12-15]。陈皮（Citri Reticulatae Pericarpium）是经干燥并陈放后的芸香科植物橘及其栽培变种的成熟果皮。据《本草纲目》记载，陈皮，入脾、肺经，可以治疗恶心呕吐、反胃、咳嗽、便秘以及妇女乳腺癌等疾病[16-19]。马齿苋和陈皮均含有丰富的活性成分，如多酚、黄酮类化合物、多糖、膳食纤维等。其中黄酮类化合物是主要的活性物质，具有抗肿瘤、抗氧化、抑菌、抗炎、降低胆固醇、防治心血管疾病等作用[20-22]。
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）是乳酸菌的一种，常用于乳制品、肉类、谷类和蔬菜等食品的发酵。有研究表明，植物乳杆菌对肠道健康、代谢紊乱和大脑健康具有有益作用。植物乳杆菌耐酸和耐胆盐的能力有助于其通过胃和上消化道，黏附在肠上皮细胞、抑制病原体[23-24]。另外，植物乳杆菌发酵能够促进植物基生物活性物质的释放，或将食物中的初级底物转化为功能性更强的物质，从而提高其生物活性，增强营养特性[25-26]。因此，通过植物乳杆菌发酵改善食品品质、提高生物活性是目前一个有效的加工技术，具有广阔的发展前景。
本研究通过植物乳杆菌发酵马齿苋和陈皮，以发酵液中总黄酮含量为指标对发酵工艺进行优化，并测定发酵过程中体外抗氧化活性的变化，以期为马齿苋和陈皮的资源开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
马齿苋、陈皮：市售；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）：湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室保藏菌株；芦丁（HPLC≥98%）：上海源叶生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（纯度 96%）：上海麦克林生化科技有限公司；蛋白胨：上海盛思生化科技有限公司；酵母浸粉、牛肉浸膏：北京双旋微生物培养基制品厂；琼脂粉：北京奥博星生物科技有限责任公司；氯化钠、葡萄糖、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、水杨酸、过氧化氢、氯化铁、铁氰化钾、三氯乙酸、无水乙醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
单人净化工作台（SW-CJ-1D）：苏州净化设备有限公司；电子分析天平（AR1140）：奥豪斯国际贸易（上海）有限公司；恒温培养振荡器（ZWY-2102）：上海智城分析仪器制造有限公司；立式压力蒸汽灭菌器（LS-75HD）：江阴滨江医疗设备有限公司；台式离心机（TGL-16C）：上海安亭科学仪器厂；集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S）：予华仪器有限责任公司；酶标仪（SYNERGY2）：基因生物技术国际贸易（上海）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 原料预处理
将马齿苋、陈皮分别干燥粉碎，过60目筛后封存备用。
1.3.2 菌种的活化与培养
将植物乳杆菌接种于MRS固体培养基进行斜面活化，培养温度为37℃，恒温培养24 h，挑取菌落接种至液体培养基，根据前期制得的生长曲线，植物乳杆菌于MRS液体培养基37℃、180 r/min培养12 h至对数生长期，备用。
1.3.3 发酵工艺
称取等比例马齿苋和陈皮粉末于三角瓶，按照一定的料液比加入含2%葡萄糖、1%酵母浸粉、0.5%NaCl溶液和0.5%牛肉浸膏的培养基。将三角瓶放入高压蒸汽灭菌锅，在115℃条件下灭菌20 min，取出后冷却至室温。在一定的发酵时间、料液比、菌种接种量、发酵温度条件下，于恒温摇床180 r/min进行发酵，发酵结束后将发酵液离心（8 000 r/min，15 min）取上清液，测量比较发酵前后上清液中总黄酮含量。
1.3.4 发酵条件的确定
采用单因素法考察发酵时间（0、8、16、24、32、40、48 h）、料液比[1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）]、菌种接种量（1%、3%、5%、7%、9%）、发酵温度（30、33、35、37、40℃）这几个因素对马齿苋陈皮发酵液中总黄酮含量的影响，确定最优发酵条件。考察某一因素时其他因素固定条件为发酵时间48 h，料液比1∶20（g/mL），菌种接种量3%，发酵温度37℃。
1.3.5 指标测定
1.3.5.1 发酵液中总黄酮含量的测定和计算
发酵液中总黄酮含量的测定参考文献[27]的方法，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法，并稍作改动。取样品200 μL于10 mL容量瓶中，加入300 μL 5%NaNO2溶液摇匀后静置6 min，再加入300 μL 10%Al（NO3）3溶液摇匀后静置6 min，最后加入4 mL 4%NaOH溶液摇匀，以70%乙醇溶液定容至10 mL后静置15 min，在510 nm处测量吸光度。采用0～0.5 mg/mL的芦丁标准溶液绘制标准曲线，其中芦丁浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，所得标准曲线回归方程为y=0.565 2x-0.000 7，相关系数R2=0.999 6，说明在0～0.5 mg/mL范围内，溶液浓度与吸光度呈良好的线性关系。所有样品测量均作3次平行。
将发酵液于8 000 r/min条件下离心15 min，取上清液，按照1.3.5.1的方法测量，并根据标准曲线回归方程计算出发酵液中总黄酮含量。
1.3.5.2 DPPH自由基清除能力的测定
DPPH自由基清除能力的测定参考文献[28]并稍作改动，将发酵液离心后取上清液，用蒸馏水稀释10倍，取0.3 mL加入3.7 mL 1.0×10-4mol/L DPPH溶液，充分混匀后室温避光反应20 min，8 000 r/min离心5 min，取上清液于517 nm波长处测定其吸光度记作A1，以蒸馏水代替样液，其吸光度记作A0，以无水乙醇代替DPPH溶液，其吸光度记作A2，按照下列公式计算DPPH自由基清除率。
1.3.5.3 羟基自由基清除能力的测定
羟基自由基清除能力的测定参考文献[29]并稍作改动，将发酵液离心后取上清液，用蒸馏水稀释5倍，取2 mL，分别加入2 mL 9 mmol/L水杨酸乙醇溶液，2 mL 9 mmol/L FeSO4·7H2O，混匀后静置 5 min，最后加入2 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，充分混匀后置于37℃恒温水浴锅中反应30 min后取出，于510 nm波长处测定其吸光度，以蒸馏水作空白参比，再按照下列公式计算羟基自由基清除率。
式中：A01为空白对照的吸光值；AS为加入样品的体系的吸光值；A02为不加显色剂H2O2的体系的吸光值。
1.3.5.4 还原力的测定
还原力的测定在文献[30]的基础上稍作改动，将发酵液离心后取上清液，用蒸馏水稀释10倍，取2 mL pH6.6、0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液，加入0.5 mL样液、2.5 mL 1%铁氰化钾溶液，混匀后置于50℃恒温水浴锅中反应30 min后取出，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，振荡均匀，于3 000 r/min条件下离心10 min，取2 mL上清液，加入2 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，以蒸馏水代替样液作为空白对照，于700 nm处测定吸光值，吸光值越大，还原力越强。
1.4 数据处理与统计分析
采用 Microsoft Excel 2016、Origin 2018软件进行数据的处理与分析，所有试验均重复3次，取平均值。
2 结果与分析
2.1 发酵条件的确定
2.1.1 发酵时间对发酵液总黄酮含量的影响
发酵时间对发酵液中总黄酮含量的影响结果见图1。
图1 发酵时间对总黄酮含量的影响
Fig.1 The effect of fermentation time on the content of total flavonoids
由图1可知，随着发酵时间的延长，发酵液中总黄酮含量呈先上升后下降的趋势，在发酵32 h时总黄酮含量达到最大值，为0.60 mg/mL，是发酵前样品中总黄酮含量的1.15倍，之后随着发酵时间的延长，总黄酮含量逐渐减少。其原因可能在于发酵初期植物乳杆菌生长代谢产生的酶可分解植物细胞壁，促进了总黄酮的释放[31]，而随着发酵时间的延长，部分黄酮化合物被分解利用，导致总黄酮含量降低[32]。因此，确定发酵时间为32 h。
2.1.2 料液比对发酵液总黄酮含量的影响
料液比对发酵液中总黄酮含量的影响结果见图2。
图2 料液比对总黄酮含量的影响
Fig.2 The effect of solid-liquid ratio on the content of total flavonoids
由图 2 可知，在料液比为 1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）时发酵后总黄酮含量与发酵前的相比有明显提高，而在料液比较高的条件下，发酵前后总黄酮含量并无明显变化，可能是由于发酵体系过于浓稠，水分较少，影响了微生物的生长和代谢进程[33]，因此综合考虑，确定最佳料液比为 1∶20（g/mL）。
2.1.3 菌种接种量对发酵液总黄酮含量的影响
菌种接种量对发酵液中总黄酮含量的影响结果见图3。
图3 菌种接种量对总黄酮含量的影响
Fig.3 The effect of inoculation volume on the content of total flavonoids
由图3可知，总黄酮含量随菌种接种量的增大呈先上升后下降的趋势，当菌种接种量为3%时，总黄酮含量最高，为0.61 mg/mL，说明植物乳杆菌发酵对发酵液中总黄酮含量的提高有一定作用，但是当菌种接种量较小时菌体作用不明显，而菌种接种量过大又会由于菌体自身代谢而导致总黄酮含量降低[34]，因此确定植物乳杆菌的菌种接种量为3%。
2.1.4 发酵温度对发酵液总黄酮含量的影响
发酵温度对发酵液中总黄酮含量的影响结果见图4。
图4 发酵温度对总黄酮含量的影响
Fig.4 The effect of fermentation temperature on the content of total flavonoids
由图4可知，发酵温度为33℃时总黄酮含量最高，为0.69 mg/mL，继续提高发酵温度总黄酮含量呈下降趋势，原因可能是低温更有利于酶的产生，从而更好地促进黄酮的释放。而温度升高抑制了酶活，还可能导致黄酮化合物的分解。因此，确定最佳发酵温度为33℃。
综上，根据试验可得，最佳发酵条件为发酵时间32h，料液比1∶20（g/mL），菌种接种量3%，发酵温度33℃。
2.2 抗氧化活性的测定
马齿苋陈皮经植物乳杆菌在最佳发酵条件下发酵后测定其抗氧化活性，结果见图5。
图5 发酵过程中抗氧化活性变化
Fig.5 Changes in antioxidant activity during fermentation
由图5可知，随着发酵时间的延长，DPPH自由基清除率逐步增大，之后趋于平缓，从发酵前的54.32%升高至59.12%，总体变化趋势不是很明显。随着发酵时间的延长，羟基自由基清除率逐渐增大，从发酵前的56.22%增大至77.66%，这与发酵液中总黄酮含量变化趋势一致。还原力是指物质提供电子的能力，与多种抗氧化机制有关[35]，测得的吸光度大小反映物质还原力的大小，吸光度越大，还原力越强[36]。马齿苋陈皮经植物乳杆菌发酵后还原力的变化趋势与其对羟基自由基的清除能力相似，随发酵时间的延长，还原力逐渐增强，较发酵前的还原力有明显提高。通过对发酵过程中DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率以及还原力的测定结果可知，植物乳杆菌发酵有利于提高发酵液的抗氧化活性。
3 结论
本研究采用植物乳杆菌发酵马齿苋陈皮，以总黄酮含量为指标对发酵工艺进行了优化，得到最佳工艺条件：发酵时间为 32 h，料液比为 1∶20（g/mL），菌种接种量为3%，发酵温度为33℃，在此条件下发酵液中总黄酮含量为0.69 mg/mL。在此工艺条件下通过测定DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率以及还原力，对发酵过程中发酵液的抗氧化活性进行了评价，结果表明，马齿苋陈皮经植物乳杆菌发酵后所得到的发酵液具有良好的抗氧化性，这可能与发酵液中黄酮类成分含量和组分变化有关，而其成分变化可能与植物乳杆菌的生长代谢存在一定联系。
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