湛江位于我国大陆最南端，是盛产各类水产的沿海城市，其中2019年贝类产量达1 279 t。虽然水产养殖给湛江带来经济收益，但作为贝类加工副产物的贝壳却未得到很好的利用[1]。在我国，每年约产生100万t的壳体废弃物，仅有少部分用于水泥添加剂或饲料营养素等方面，而大量废弃贝壳作为固体垃圾被丢弃，造成污染环境和资源浪费[2]。因此，如何高值化利用废弃贝壳已成为亟待解决的社会和环境问题。
研究表明，贝壳中含有90%以上的碳酸钙，是一种很好的天然钙源[3]。钙是维持生命健康必需的矿物元素[4]，然而，由于人们不良的饮食习惯，导致膳食钙摄入不足，而钙可结合食物中的膳食纤维、饱和脂肪酸、肌醇六磷酸等物质形成难溶性物质，导致钙的吸收率较低，缺钙已成为十分普遍的现象，在孕妇和中老年人群体中尤为突出[5]。因此，选择合适有效的补钙制剂是预防和改善缺钙的有效方法之一。现今国内补钙制剂种类众多，传统补钙剂以第一代无机钙补钙剂以及第二代有机酸钙补钙剂为主，但第一代补钙剂普遍存在溶解度和吸收率低等缺陷。虽然第二代补钙剂的吸收率有所提高，但存在含钙量低的问题，并且上述补钙剂都有不同程度的毒副作用[6]。近年来，氨基酸螯合钙因具有稳定的生化性质，吸收率高，生物利用率高，能达到既补钙又补充氨基酸的双重营养功效，已成为第三代补钙剂发展的方向[7]。国外学者也对氨基酸螯合钙展开了大量研究，Pawlos等[8]使用氨基酸螯合钙来评价生产山羊酸凝乳奶酪的可能性；Arabloo等[9]研究表明，氨基酸螯合钙可以显著提高澳洲苹果树的质量和数量。
L-组氨酸和L-精氨酸都是人体内的碱性半必需氨基酸，人体自身所合成的L-组氨酸和L-精氨酸不能完全满足其生命活动的需要，需从外界环境中获取[10]。同时，单一氨基酸摄入过多可能对人体有一定的副作用，有着人群使用限制[11]，而复合氨基酸则可避免这类情况发生，且复合碱性氨基酸螯合钙在通过小肠吸收途径吸收钙离子时，能更好地保护钙离子，不受胃酸等因素的影响[12]，作为配体的氨基酸具有保护作用，避免直接吸收钙离子对胃肠道造成的损伤，保持钙离子的生理活性[13]。
虽然氨基酸螯合钙产品优点显著，但是依然存在一些不足。首先，目前制备氨基酸螯合钙的方式主要是借助酶或酸使动物蛋白或植物蛋白水解获得复合氨基酸，再与钙源螯合制备复合氨基酸螯合钙[14]，该方法存在成本高、资源浪费、易污染环境、投入大等缺陷[15]。其次，目前复合氨基酸螯合钙产品的生产工艺单一，分别生产不同种类的单一氨基酸螯合钙后，再通过物理混合的方式将各单一氨基酸螯合钙复配，该方法工艺复杂，成本较高。最后，目前对氨基酸螯合钙的研究主要集中在酸性氨基酸螯合钙，对于碱性氨基酸螯合钙的研究较少，而碱性氨基酸螯合钙更容易被人体吸收，补钙效果更好[16]。因此，如何克服上述困难，得到工艺简单、成本低廉、效果显著的复合氨基酸螯合钙的生产工艺具有重要意义。
本研究以食品级贝壳粉作为钙源，L-组氨酸和L-精氨酸作为碱性氨基酸原料，通过水体系合成法将2种氨基酸与贝壳粉同时螯合，制备基于L-组氨酸和L-精氨酸的复合氨基酸螯合钙，探索优化合成工艺条件，为复合氨基酸螯合钙的研制和废弃贝壳综合利用提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
海湾扇贝贝壳：广东省湛江市雷州半岛；屈臣氏蒸馏水：市售（执行GB19298标准生产）；L-精氨酸（生物试剂）、L-组氨酸（生物试剂）、二硫腙试剂（分析纯）、茚三酮显色剂（分析纯）：上海麦克林生化科技股份有限公司；稀盐酸、氢氧化钠、NH3-NH4Cl缓冲溶液（pH10.4）、乙二胺四乙酸二钠、铬黑T指示剂、无水乙醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 主要仪器与设备
旋转蒸发仪（RE-52AA）：上海亚荣生化仪器厂；高速冷冻离心机（TGL20MW）：湖南赫西仪器装备有限公司；集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101C）：上海羌强实业发展有限公司；傅里叶红外光谱仪（Spectrum 100）：珀金埃尔默仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 贝壳粉的制备
海湾扇贝贝壳用清水洗净，除去贝壳表面杂物，将处理后的贝壳用2 mol/L稀盐酸浸泡，使贝壳表面的壳聚物和壳质素等溶解，取出贝壳，用蒸馏水进行冲洗，烘干后粉碎，过100目筛，得到贝壳粉（钙源）。
1.3.2 氨基酸螯合钙的制备
采用水体系合成法制备氨基酸螯合钙，将一定量的贝壳粉充分溶解于2 mol/L的稀盐酸溶液，得到CaCl2溶液，备用。将摩尔比为1∶1的L-组氨酸和L-精氨酸用蒸馏水充分溶解，所得的复合氨基酸水溶液与上一步所得CaCl2溶液充分混合，调节混合溶液至合适的pH值。将上述混合液置于恒温水浴锅中，发生螯合反应。将反应完成的螯合液进行离心处理，取上清液进行减压浓缩，再加入无水乙醇纯化，离心分离，所得沉淀物即为复合氨基酸螯合钙。
1.3.3 复合氨基酸螯合钙的钙含量与螯合率的测定
采用GB/T 5009.92—2003《食品中钙的测定》的乙二胺四乙酸二钠（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）滴定法，以铬黑T为指示剂。取一定量的复合氨基酸螯合钙沉淀物配成溶液，加入适量铬黑T指示剂和NH3-NH4Cl缓冲溶液调节pH值，摇晃均匀后，用0.005 mol/L EDTA-2Na溶液进行3次平行滴定，并记录消耗的EDTA-2Na溶液平均体积为V1，另取等量的贝壳粉替代沉淀物配成溶液，重复上述试验过程，记录消耗的EDTA-2Na溶液平均体积为V2，螯合率计算公式如下[17]。
式中：V1为滴定复合氨基酸钙元素所消耗的EDTA-2Na溶液的体积，mL；V2为滴定钙元素总量所消耗的EDTA-2Na溶液的体积，mL。1.3.4 单因素试验优化螯合条件
1.3.4.1 摩尔比对螯合效果的影响
取一定量的复合氨基酸溶于水，在复合氨基酸与贝壳粉的摩尔比分别为 3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3，pH7.0，反应温度为70℃，反应时间为60min的条件下进行螯合反应。待反应结束后，用EDTA-2Na进行滴定，根据EDTA-2Na的用量，计算螯合率，以确定最佳的摩尔比。
1.3.4.2 反应pH值对螯合效果的影响
取一定量的复合氨基酸溶于水，分别在pH7、8、9、10、11，原料摩尔比为 1∶1，反应温度为 70 ℃，反应时间为60 min的条件下进行螯合反应。计算螯合率，以确定最佳反应pH值。
1.3.4.3 反应温度对螯合效果的影响
取一定量的复合氨基酸溶于水，在温度分别为30、40、50、60、70 ℃，原料摩尔比为 1∶1，pH7.0，反应时间为60 min的条件下进行螯合反应。计算螯合率，以确定最佳反应温度。
1.3.4.4 反应时间对螯合效果的影响
取一定量的复合氨基酸溶于水，在反应时间分别为 50、55、60、65、70 min，原料摩尔比为 1∶1，pH7.0，反应温度为70℃的条件下进行螯合反应。计算螯合率，以确定最佳反应时间。
1.3.5 正交优化试验
在单因素试验基础上，采用四因素三水平L9（34）进行正交试验，以螯合率为指标，考察摩尔比，pH值，反应温度，反应时间等4个不同因素对螯合率的影响，筛选较优螯合条件。正交试验因素如表1所示。
表1 正交试验因素
Table 1 Factors of the orthogonal experiment
水平 因素A摩尔比 D反应时间/min 1 2∶1 50 2 1∶1 60 3 1∶2 70 B pH值 C反应温度/℃8 40 9 50 10 60
1.3.6 红外光谱分析
取适量的两种氨基酸及复合氨基酸螯合钙置于傅里叶红外光谱仪中检测其红外吸收变化，扫描范围在 400 cm-1～4 000 cm-1，分辨率为 0.1 cm-1。
1.4 数据处理
每个试验均设置3次平行。利用SPSS软件对数据进行分析，利用Origin软件进行图形绘制。
2 结果与分析
2.1 红外光谱图分析
红外光谱是重要的高分子聚合物鉴定方法，可研究不同聚合物的化学键和特征基团信息[18]。L-组氨酸、L-精氨酸以及复合氨基酸螯合钙的红外光谱图如图1所示。
图1 L-组氨酸、L-精氨酸以及复合氨基酸螯合钙的红外光谱
Fig.1 Infrared spectrum of L-histidine，L-arginine，and compound amino acids chelated calcium
由图1可知，所形成的复合氨基酸螯合钙的特征区中，-NH3的伸缩振动引起的吸收峰从3 045 cm-1红移至3 160 cm-1，表明氨基中的氮原子发生配位；L-组氨酸羰基特征吸收峰从1 500 cm-1蓝移至1 565 cm-1、L-精氨酸羰基特征吸收峰从1 675 cm-1红移到1 565 cm-1，表明两种氨基酸羰基中的氧原子均参与螯合反应。以上结果表明所生成的产物为复合氨基酸螯合钙。
2.2 摩尔比对螯合效果的影响
复合氨基酸与贝壳粉的摩尔比对螯合率的影响如图2所示。
图2 复合氨基酸与贝壳粉的摩尔比对螯合率的影响
Fig.2 Effect of molar ratio of compound amino acids to shell powder on chelation rate
* 表示差异显著，P＜0.05。
由图2可知，在其他条件因素不变的情况下，随着氨基酸的比例逐渐上升，螯合率呈先升后降的趋势。当氨基酸与贝壳粉的摩尔比为1∶1时，螯合率达到最大值。在摩尔比超过1∶1后，由于钙离子浓度升高，其与供电基团配对能力增强，导致氢氧化物沉淀的生成增多，氨基酸和钙离子的螯合程度下降，螯合产率下降[1]。因此，复合氨基酸与贝壳粉的最佳摩尔比为1∶1。
2.3 反应pH值对螯合效果的影响
溶液的pH值对螯合率的影响如图3所示。
图3 pH值对复合氨基酸螯合钙螯合率的影响
Fig.3 Effect of pH on chelation rate of compound amino acids chelated calcium
*表示差异显著，P<0.05。
由图3可知，在其他条件因素不变的情况下，螯合率随pH值的增大呈先升后降的趋势。在pH值为9时，螯合率达到最大值。在酸性条件下，游离的H+较多，可结合在氨基酸的表面，使得基团带上正电；由于同种电荷相互排斥，Ca2+无法与氨基酸结合，不利于螯合钙的形成，导致螯合率较低[19]。在碱性条件下，游离的H+可被溶液中的OH-所结合，使H+无法干扰螯合反应，螯合率升高。当pH值超过9时，过多的OH-易与氨基酸中的供电子基团争夺Ca2+，不利于反应，使得螯合率下降。因此，最佳的反应pH值为9。
2.4 反应温度对螯合效果的影响
反应温度对螯合率的影响如图4所示。
图4 反应温度对复合氨基酸螯合钙螯合率的影响
Fig.4 Effect of chelation temperature on chelation rate of compound amino acids chelating calcium
*表示差异显著，P<0.05。
由图4可知，在其他条件因素不变的情况下，随着反应温度的上升，螯合率也随之增大。当反应温度达到50℃时，螯合率达到最高值。合适的反应温度能促进分子间的碰撞，提高螯合反应的效率。然而，反应温度过高会加速氢氧化钙沉淀的速率，高温也会导致螯合物分解，进而降低螯合反应速率[20]。因此，最佳的反应温度为50℃。
2.5 反应时间对螯合效果的影响
反应时间对螯合率的影响如图5所示。
图5 反应时间对复合氨基酸螯合钙螯合率的影响
Fig.5 Effect of chelation time on chelation rate of compound amino acids chelating calcium
*表示差异显著，P<0.05。
在其他因素不变的条件下，螯合率随反应时间的增加呈先升后降趋势。当反应时间较短时，螯合反应不完全，螯合率较低；随反应的不断进行，螯合率不断上升。然而，当螯合反应完成后，继续延长反应时间，会破坏螯合钙的分子结构，导致生成的螯合钙被解离，螯合率下降[21-22]。因此，最佳的反应时间为60 min。
2.6 正交优化试验结果
正交优化试验结果见表2。
表2 复合氨基酸正交试验设计及结果
Table 2 Design and results of the orthogonal experiment of compound amino acids
试验号 A摩尔比 B pH值 C反应温度/℃D反应时间/min 螯合率/%1 1 1 1 40.47 2 1 2 2 2 88.74 3 1 3 3 3 59.73 4 2 1 2 3 44.13 5 2 2 3 1 50.49 6 2 3 1 2 47.82 7 3 1 3 2 70.20 8 3 2 1 3 38.43 9 3 3 2 1 83.25 K1 62.98 51.60 42.24 58.07 K2 47.48 59.22 72.04 68.92 K3 63.96 63.60 60.14 47.43 R 16.48 12.00 29.80 21.49 1
通过螯合率的极差分析可知，反应温度对螯合反应的影响最大，其次是反应时间，摩尔比、pH值的影响较小；影响因素的主次顺序：C＞D＞A＞B，因素水平的最佳组合为A3B3C2D2。综合考量单因素试验结果和正交试验结果，因摩尔比和pH值的R值偏低，其交互作用对氨基酸螯合钙的螯合率影响较小，故摩尔比和pH值采用单因素最优水平（1∶1；pH9）作为最佳制备工艺；而反应温度和反应时间的R值较高，其交互作用对氨基酸螯合钙的螯合率影响较大，故采用正交试验最优水平（50℃；60 min）作为最佳制备工艺。对最佳制备工艺进行验证，最终得出复合碱性氨基酸螯合钙的最佳制备工艺为反应原料摩尔比为1∶1，反应pH值为9，反应温度为50℃，反应时间为60 min。在此优化条件下进行3次试验，得到平均螯合率最高，为89.12%。
3 结论
本研究提出了一种合成复合碱性氨基酸螯合钙的工艺方法：以海湾扇贝贝壳为钙源，通过水体系合成法制备基于L-组氨酸和L-精氨酸的复合碱性氨基酸螯合钙。探索及优化最佳螯合工艺：反应原料摩尔比为1∶1，反应pH值为9，反应温度为50℃，反应时间为60 min，得到螯合率为89.12%。该方法简化了工艺流程，减少了酸和酶的使用，降低了生产成本，而且避免了酸类物质对设备的损耗，为复合氨基酸螯合钙的研制和废弃贝壳综合利用提供新的思路。
[1]许先猛,张增帅,郭俊花,等.鸡蛋壳赖氨酸螯合钙的制备及其结构表征[J].现代食品科技,2020,36(8):80-85,109.XU Xianmeng,ZHANG Zengshuai,GUO Junhua,et al.Preparation and characterization calcium-lysine chelate from eggshells[J].Modern Food Science and Technology,2020,36(8):80-85,109.
[2]吴一凡,俞园园,陈琛.赖氨酸-钙螯合物的研究进展[J].化学工程与装备,2020(6):227-228,226.WU Yifan,YU Yuanyuan,CHEN Chen.Research progress of lysine-calcium chelate[J].Chemical Engineering&Equipment,2020(6):227-228,226.
[3]王真,姜岁岁,张帆,等.太平洋牡蛎壳制备L-天冬氨酸螯合钙的工艺优化及表征[J].食品科学,2020,41(10):238-245.WANG Zhen,JIANG Suisui,ZHANG Fan,et al.Optimized preparation and characterization of calcium-chelating L-aspartate with Pacific oyster(Crassostrea gigas)shells as calcium source[J].Food Science,2020,41(10):238-245.
[4]葛淑华,刁屾,栾俊,等.利用废革屑制备肽Ca螯合物的工艺探究[J].土壤通报,2019,50(3):704-712.GE Shuhua,DIAO Shen,LUAN Jun,et al.The technique of preparing peptide calcium chelate from leather waste[J].Chinese Journal of Soil Science,2019,50(3):704-712.
[5]李云姣,陈杨扬,侯宝岩,等.响应面法优化海湾扇贝壳赖氨酸螯合钙的制备工艺[J].食品工业科技,2017,38(12):248-253.LI Yunjiao,CHEN Yangyang,HOU Baoyan,et al.Optimization of preparation of calcium-lysine chelate from bay scallop shell by response surface method[J].Science and Technology of Food Industry,2017,38(12):248-253.
[6]张蕾,程润青,孙媛媛,等.河蚬多肽螯合钙的制备和抗氧化活性分析[J].食品工业,2017,38(3):94-98.ZHANG Lei,CHENG Runqing,SUN Yuanyuan,et al.Study on the preparation of peptides from Corbicula fluminea meat chelated calcium and its antioxidation activity evaluation[J].The Food Industry,2017,38(3):94-98.
[7]胡文翠.角蛋白水解液柱下液制备复合氨基酸钙的研究[D].武汉:湖北工业大学,2016.HU Wencui.Synthesis of compound amino acid chelated calcium by passing keratin hydrolyzing liquid through column[D].Wuhan:Hubei University of Technology,2016.
[8]PAWLOS M,ZNAMIROWSKA A,ZAGUŁA G,et al.Use of calcium amino acid chelate in the production of acid-curd goat cheese[J].Foods,2020,9(8):994.
[9]ARABLOO M,TAHERI M,YAZDANI H,et al.Effect of foliar application of amino acid and calcium chelate on some quality and quantity of Golden Delicious and Granny Smith apples[J].Trakia Journal of Sciences,2017,15(1):14-19.
[10]刘佳彤.河蚌肉/大豆粕酶解氨基酸螯合钙的制备及特性研究[D].长春:吉林大学,2016.LIU Jiatong.Research on preparation and properties of mussel meat/soybean meal calcium amino acid chelate[D].Changchun:Jilin University,2016.
[11]陈涛,刘睿,吴皓,等.四角蛤蜊制备复合氨基酸螯合钙的工艺优选[J].中国实验方剂学杂志,2015,21(8):25-28.CHEN Tao,LIU Rui,WU Hao,et al.Optimization of preparation process of compound amino acid chelated calcium from Mactra veneriformis[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2015,21(8):25-28.
[12]薛荣涛,李翠芹,何腊平.复合氨基酸螯合钙的研究进展[J].食品工业科技,2014,35(21):390-394.XUE Rongtao,LI Cuiqin,HE Laping.Research progress in compound amino acid chelated calcium[J].Science and Technology of Food Industry,2014,35(21):390-394.
[13]胡静荣,郭艳,来静,等.氨基酸螯合钙的结构表征和功能特性研究[J].食品研究与开发,2021,42(22):36-43.HU Jingrong,GUO Yan,LAI Jing,et al.Structural and functional characteristics of amino acid chelate calcium[J].Food Research and Development,2021,42(22):36-43.
[14]张妹,过世东.氨基酸多肽螯合钙的制备及其工艺优化[J].食品与生物技术学报,2014,33(4):422-425.ZHANG Mei,GUO Shidong.Study on preparation and optimization of amino acid chelated calcium[J].Journal of Food Science and Biotechnology,2014,33(4):422-425.
[15]刘媛,王健,孙剑峰,等.我国海洋贝类资源的利用现状和发展趋势[J].现代食品科技,2013,29(3):673-677.LIU Yuan,WANG Jian,SUN Jianfeng,et al.Utilization status of the resource of marine shellfish in China and preliminary study on its development[J].Modern Food Science and Technology,2013,29(3):673-677.
[16]吴玉琪.复合必需氨基酸钙的制备及药理学初步评价[D].泉州:华侨大学,2012.WU Yuqi.Synthesis and preliminary pharmacological evaluation of essential amino acids chelated calcium[D].Quanzhou:Huaqiao University,2012.
[17]蒋金来,王令充,吴皓,等.钙制剂研究进展[J].食品工业科技,2012,33(11):379-382,387.JIANG Jinlai,WANG Lingchong,WU Hao,et al.Research progress in calcium preparation[J].Science and Technology of Food Industry,2012,33(11):379-382,387.
[18]杨青华,林勤保,关伟焰,等.基于傅里叶变换红外光谱和气相色谱-质谱的未知涂料成分分析[J].分析测试学报,2021,40(11):1571-1579.YANG Qinghua,LIN Qinbao,GUAN Weiyan,et al.Analysis of components in unknown coating by Fourier transform infrared spectroscopy and gas chromatography-mass spectrometry[J].Journal of Instrumental Analysis,2021,40(11):1571-1579.
[19]李翠芹,何腊平,仇保权.氨基酸螯合钙的研究进展[J].食品研究与开发,2011,32(10):162-164.LI Cuiqin,HE Laping,QIU Baoquan.Research progress on amino acid chelated calcium[J].Food Research and Development,2011,32(10):162-164.
[20]杜冰,蔡巽楷,谢伊澄,等.蛋壳粉制备氨基酸螯合钙工艺优化[J].食品工业科技,2011,32(4):287-289,292.DU Bing,CAI Xunkai,XIE Yicheng,et al.Study on preparation technology of calcium amino acid chelate from eggshell power[J].Science and Technology of Food Industry,2011,32(4):287-289,292.
[21]王俊,程薇,熊光权,等.复合氨基酸钙螯合物的研究[J].湖北农业科学,2010,49(9):2202-2204.WANG Jun,CHENG Wei,XIONG Guangquan,et al.Study on chelation of compound amino acid with calcium[J].Hubei Agricultural Sciences,2010,49(9):2202-2204.
[22]王家明,魏玉西,殷邦忠,等.以牡蛎壳为钙源的谷氨酸螯合钙制备工艺研究[J].中国海洋药物,2010,29(2):22-26.WANG Jiaming,WEI Yuxi,YIN Bangzhong,et al.Study on the technology of glutamic acid chelated calcium prepared with oyster shell as calcium source[J].Chinese Journal of Marine Drugs,2010,29(2):22-26.