近年来，随着经济发展和生活水平的提高，消费者对具有预防慢性疾病和延缓衰老等功能食品的需求增加。许多研究表明，慢性疾病和衰老与体内自由基的氧化有关[1]。流行病学研究表明，富含多酚的饮食能够预防各种与氧化损伤有关的慢性疾病，如糖尿病、癌症和心血管疾病[2]。多酚可作为抗氧化剂主要与其能够抑制脂质自由基的形成、将氢过氧化物还原为稳定化合物、螯合游离金属离子有关[3]。蜂花粉是蜜蜂采集的花粉粒与蜂蜜及其分泌物混合形成的扁圆形的花粉团[4]。蜂花粉除含有多酚类物质外，还含有蛋白质、糖、脂类、纤维素、氨基酸和维生素等多种营养物质[5]，可作为膳食补充剂或运动员的能量补充剂，满足人体每日所需，并具有降低血糖的功效[6]。蜂花粉所含的表儿茶素、儿茶素、槲皮素、柚皮素等黄酮类化合物，以及绿原酸、阿魏酸、咖啡酸、没食子酸、对香豆酸等酚酸类化合物，使蜂花粉具有较好的抗氧化活性[4]。一些体外和体内研究表明，蜂花粉在抗衰老和预防自由基对人体的损伤方面有重要作用[7]。许多研究已经将蜂花粉应用于烘焙食品中，Conte等[8]研究表明蜂花粉添加量为3%～5%时，可以改善面包的感官品质，延缓面包的老化；Krystyjan等[9]研究表明蜂花粉添加量5%时，饼干的感官品质最佳，饼干的抗氧化活性升高至24%。但目前关于烘焙产品的研究中，蜂花粉的最适添加量相对较低，一般不超过5%。
曲奇作为一种以低筋粉、黄油、糖等为主要原料的甜酥性饼干，具有酥脆的口感和良好的风味，深受消费者的喜爱。但是传统曲奇制作工艺中，蔗糖添加量高达20%[10]，不适合糖尿病等特殊人群食用[11]。与蔗糖相比，蜂蜜中的果糖含量较高，血糖生成指数相对较低[12]。因此，蜂蜜作为蔗糖的替代物在焙烤食品中得到了广泛的应用[13]。蜂蜜是蜜蜂从植物的花蜜或植物活体的分泌物中采集，并与自身的特定物质结合转化、沉淀、脱水而生成的高营养价值的天然甜味剂[14]，主要成分为碳水化合物（其中果糖和葡萄糖占85%～95%）、水，还含有机酸、蛋白质、多酚类物质、维生素等[15]。蜂蜜因其特有的口感、甜味和质地而深受人们的喜爱。
我国是全球蜂蜜和蜂花粉的主要生产国和出口国，蜂蜜的产量位居世界第一，但蜂蜜和蜂花粉的消费量却很低[12]，主要原因是市场上以蜂花粉和蜂蜜为原料的食品较少。因此，本文以蜂花粉和蜂蜜为试验材料，部分替代传统曲奇中的小麦粉和蔗糖，采用单因素和正交试验的方法，研究蜂花粉添加量、蜂蜜添加量、焙烤温度、焙烤时间等因素对曲奇感官评分、硬度和色泽（明亮度L*）的影响，通过聚类分析法确定曲奇的硬度等级范围，并探究蜂花粉和蜂蜜的添加对曲奇抗氧化能力的影响，以获得较高蜂花粉和蜂蜜添加量的曲奇配方。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
蜂花粉、蜂蜜：山东华翰食品有限公司；低筋小麦粉：益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司；玉米淀粉：诸城兴贸玉米开发有限公司；糖粉：山东凯贝食品有限公司；黄油：新西兰安佳乳品牌有限公司；食用小苏打：安琪酵母股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美国Sigma-Aldrich公司；试验涉及的原辅料均为食品级，试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
TA-XT.Plus质构仪：英国Stable Micro Systems公司；CR-400色彩色差计：日本美能达公司；UV2000紫外-可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；Tissuelyser多样品组织研磨仪：上海净信实业发展有限公司；SGB-3Y烤箱：广州三麦烤箱有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 曲奇的加工流程
使用多样品组织研磨仪1 000 r/min研磨蜂花粉5 min，过80目筛，制得破壁蜂花粉。黄油于室温软化后，充分搅打至顺滑，加入糖粉和蜂蜜打发，再加入鸡蛋搅拌均匀，制得曲奇湿料。称取面粉、破壁蜂花粉、玉米淀粉、小苏打和食盐加入搅拌好的曲奇湿料中，混合均匀，制得曲奇面糊。将面糊置于曲奇模具，压出厚度为1 cm、直径为5 cm的曲奇面胚，焙烤后冷却至室温并密封保存。曲奇制作工艺流程如图1所示。
图1 曲奇制作工艺流程
Fig.1 Cookie making process
1.3.2 单因素试验
以低筋小麦粉为100%计，其他原辅料按照一定质量比添加。通过预试验确定曲奇配方中辅料的添加量分别为黄油30%，糖粉20%、玉米淀粉5%，小苏打0.5%，食盐0.5%，蛋液25%。
选择蜂花粉添加量、蜂蜜添加量、焙烤温度、焙烤时间4个因素，以曲奇硬度、L*值（明亮度）和感官评分为评价指标，进行单因素试验。
1）固定蜂蜜添加量10%，焙烤温度170℃，焙烤时间18 min，蜂花粉添加量分别为0%、5%、10%、20%、30%，研究不同蜂花粉添加量对曲奇品质的影响。
2）固定蜂花粉添加量为20%，焙烤温度170℃，焙烤时间18 min，蜂蜜添加量分别为0%、5%、10%、15%、20%，研究不同蜂蜜添加量对曲奇品质的影响。
3）固定蜂花粉添加量为20%，蜂蜜添加量为10%，焙烤时间 18 min，焙烤温度分别为 150、160、170、180、190℃，研究不同焙烤温度对曲奇品质的影响。
4）固定蜂花粉添加量为20%，蜂蜜添加量为10%，焙烤温度 170℃，焙烤时间分别为 14、16、18、20、22 min，研究不同焙烤时间对曲奇品质的影响。
1.3.3 正交试验
通过单因素试验确定蜂花粉添加量（A）、蜂蜜添加量（B）、焙烤温度（C）和焙烤时间（D）4个因素的水平范围，以曲奇的感官评分为评价指标，进行四因素三水平L9（34）正交试验，确定各因子的最佳配比。
1.3.4 感官评价
参考GB/T 20980—2007《饼干》的感官评价标准，采用综合评分法对曲奇的品质进行感官评价。由经过培训的9名感官评价员组成评定小组，对曲奇的色泽、风味、苦涩味接受度、组织结构和喜好性进行评分，每项满分均为20分，感官评价总分为100，感官评价标准如表1所示。
表1 曲奇感官评价标准
Table 1 Criteria for sensory evaluation of cookie
评价指标 评价内容 分值色泽 金黄色，表面颜色均匀，无斑点 15～20深黄色或暗黄色，表面颜色较均匀，有较少斑点 8～14焦黄色或灰白色，表面颜色不均匀，有明显斑点 0～7风味 蜂花粉香味浓郁 15～20仅有少量蜂花粉香味 8～14无蜂花粉香味 0～7苦涩味 可以接受 11～20接受度 不可以接受 0～10组织结构 断面呈致密均匀的多孔状，无裂缝；口感酥松可口、不粘牙；无明显颗粒感15～20断面呈较均匀的多孔状，有少量裂缝；口感较酥松、不粘牙；有轻微颗粒感8～14断面不均匀，有明显裂缝；口感坚硬紧实、粘牙；有明显颗粒感0～7喜好性 极喜欢 15～20喜欢 8～14不喜欢 0～7
1.3.5 曲奇硬度的测定
参考De Almeida等[16]的方法，焙烤后的曲奇室温下冷却2 h，置于质构仪上，采用压缩模式对曲奇硬度进行测试。选择P/2探头，测试前速度2.0 mm/s，测试速度1.0 mm/s，测试后速度2.0 mm/s，压缩形变量为50%，记录测试过程中的力-时间曲线，曲线峰值对应的力为曲奇硬度。硬度的测试位置在曲奇中心附近，选择3个位置，重复5次，取平均值。
1.3.6 色差测定
参考Brito等[17]的方法，用色差计在曲奇的顶部与底部中心位置平整处测定曲奇的L*值（明亮度），重复5次，取平均值。
1.3.7 抗氧化能力的测定
1.3.7.1 多酚提取液的制备
制备未添加蜂花粉和蜂蜜的曲奇（P0H0）、添加10%蜂蜜的曲奇（P0H10）、添加20%蜂花粉的曲奇（P20H0）、同时添加20%蜂花粉和10%蜂蜜的曲奇（P20H10）。
参考Krystyjan等[9]的方法并稍作修改。将曲奇研磨，过80目筛，取1 g曲奇粉末，加入体积分数为80%的甲醇溶液10 mL，室温下水浴振荡3 h，5 000 r/min离心15 min，上清液即为多酚提取液。
1.3.7.2 DPPH自由基清除能力的测定
参考Pasqualone等[18]的方法并稍作修改。取0.2 mL多酚提取液，加入0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液3.8 mL，混合均匀后，在室温环境下避光静置30 min后，用紫外-可见分光光度计测定波长517 nm处吸光度，根据式（1）计算DPPH自由基清除能力。
式中：A1为0.2 mL多酚提取液与3.8 mL DPPH乙醇溶液混合后的吸光度；A2为0.2 mL多酚提取液与3.8 mL乙醇混合后的吸光度；A0为0.2 mL甲醇与3.8 mL DPPH乙醇溶液混合后的吸光度。
1.3.7.3 羟基自由基清除能力的测定
参照Zhou等[19]的方法，取1 mL多酚提取液，加入4 mmol/L FeSO4溶液1 mL、6 mmol/L水杨酸溶液1 mL、2 mmol/L H2O2溶液1 mL，均匀混合，于37℃恒温水浴反应1 h，用紫外-可见分光光度计测定波长510 nm处吸光度，根据式（2）计算羟基自由基清除能力。
式中：B1为多酚提取液的吸光度；B2为不含H2O2的混合溶液吸光度；B0为蒸馏水吸光度。
1.3.7.4 总还原能力的测定
参照Yu等[20]的方法，取1 mL多酚提取液，加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH6.6）2.2 mL和质量分数1%的铁氰化钾溶液2.5 mL，均匀混合，50℃恒温水浴反应20 min后，加入2.5 mL质量分数10%的三氯乙酸溶液，3 000 r/min离心10 min。取上清液2.5 mL，加入0.5 mL质量分数0.1%的氯化铁溶液混合，室温下静置10 min后，用紫外-可见分光光度计测定波长700 nm处的吸光度。吸光度越大，总还原能力越强。
1.3.8 曲奇硬度等级划分
参照王莹钰等[21]的方法，按照曲奇硬度（H）分布，将上述曲奇样品分为5组，每组样品约4个，组间距为60 g。根据硬度与感官评分之间的相关性，确定最佳硬度范围，分组标准如表2所示。
表2 曲奇硬度分组
Table 2 Criteria of hardness group of cookie
分组 H/g 1组 H≤300 2组 300＜H≤360 3组 360＜H≤420 4组 420＜H≤480 5组 H＞480
1.4 数据处理与分析
采用 Excel 2019、IBM SPSS Statistics 26.0软件分析数据。试验重复不少于3次，结果以平均值±标准差形式表示。采用Duncan检验进行单因素方差分析，以P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。
2 结果与分析
2.1 硬度等级划分
曲奇硬度聚类分析树状图如图2所示。
图2 曲奇硬度聚类分析
Fig.2 Clustering analysis chart for hardness of cookies
由图2可知，聚类距离为12.5时，曲奇样品可分为3个等级。
曲奇等级分级见表3。
表3 曲奇等级分级
Table 3 Hardness grading standards of cookie
H/g 等级360＜H≤420 1级H≤360；420＜H≤480 2级H＞480 3级
以感官评分为依据，根据聚类分析结果可得，3组曲奇样品为1级，1组、2组和4组曲奇样品为2级，5组曲奇样品为3级，1级曲奇硬度为360 g～420 g，曲奇色泽均匀，口感酥脆，不粘牙，具有蜂花粉独特的清香味，受欢迎程度最高。3级曲奇硬度超过480 g，曲奇表面色泽不均匀，质地坚硬，有难以接受的苦涩味，受欢迎程度最低。因此，可使用硬度来描述曲奇的品质和等级。
2.2 蜂花粉对曲奇品质的影响
蜂花粉添加量对曲奇硬度和色泽的影响见表4。
表4 蜂花粉添加量对曲奇硬度和色泽的影响
Table 4 Different amounts of bee pollen added on hardness and color of cookie
注：同列不同小写字母表示数据间差异显著（P＜0.05）。
蜂花粉添加量/%0 5 1 0 20 30 H/g 276±1d 306±3c 394±6b 402±2b 595±13a L* 感官评分74.91±1.59a 86 70.75±1.15b 84 67.12±0.52c 84 59.08±0.63d 90 53.46±0.93e 74
由表4可以看出，与未添加蜂花粉的曲奇相比，添加蜂花粉使曲奇的L*显著降低，说明蜂花粉降低了曲奇色泽明暗度[20]。这可能是因为蜂花粉本身含有的大量多酚类物质呈深黄色，降低了曲奇的亮度，而多酚类物质极易在小麦粉多酚氧化酶的催化下发生氧化反应，进一步降低曲奇色泽。另外，蜂花粉中蛋白质含量高，在焙烤过程中发生的美拉德反应也会使曲奇颜色加深[20]。随曲奇L*的降低，感官得分呈先增加后降低的趋势，这可能是因为L*的适当降低会提高曲奇的颜色饱和度，而L*过低则会显著降低曲奇的感官评分，这与Mcwatters等[22]研究豇豆粉对饼干色泽影响的结果一致。
随着蜂花粉添加量的增加，曲奇的硬度逐渐增大。这可能是因为蜂花粉的吸水性比面粉差，提高蜂花粉的添加量会降低面团与水的结合能力，焙烤过程中水分流失过多，导致曲奇硬度增加[11]。曲奇的硬度会影响酥脆性，硬度的升高可以一定程度提高感官评分。蜂花粉添加量为20%时，曲奇的硬度为402 g，比未添加蜂花粉的曲奇增加126 g，硬度等级在1级范围内，此时曲奇口感最佳，且具有蜂花粉独特的清香味，感官评分最高，为90；继续提高蜂花粉质量分数，曲奇质地过硬，且苦涩味过重，曲奇口感明显降低。综上所述，选择蜂花粉添加量为20%进行正交试验设计。
2.3 蜂蜜的添加量对曲奇品质的影响
蜂蜜添加量对曲奇硬度和色泽的影响，见表5。
表5 蜂蜜添加量对曲奇硬度和色泽的影响
Table 5 Different amounts of honey added on hardness and color of cookie
注：同列不同小写字母表示数据间差异显著（P<0.05）；蜂花粉和蜂蜜质量分数以面粉为基准。
蜂蜜添加量/%0 5 1 0 15 20 H/g 245±10e 285±4d 402±2c 447±13b 484±4a L* 感官评分69.06±1.05a 72 62.55±1.24b 78 59.08±0.63b 90 56.29±0.61c 80 54.47±0.46c 72
由表5可以看出，随着蜂蜜添加量的增加，曲奇L*显著降低，颜色变暗。这与张君[23]发现蜂蜜干粉的添加能降低面包色泽明亮度结果一致。这可能是因为蜂蜜本身含有偏黄色的黄酮类物质，焙烤过程中易被氧化，且蜂蜜中含有较多的果糖和葡萄糖，果糖和葡萄糖等还原糖易发生美拉德反应和焦糖化反应，进一步加深曲奇的颜色[9]。随着L*的降低，曲奇的感官评分呈先升高后降低的趋势，添加蜂蜜添加量为10%时，曲奇的感官评分最高，为90。
随着蜂蜜添加量的增加，曲奇硬度呈显著增加的趋势。这可能是因为与糖粉相比，蜂蜜含有较多的水分，有利于面筋网络结构的增强，焙烤的曲奇组织内部致密，硬度增加[24]。蜂蜜添加量为10%时，曲奇硬度为402 g，硬度等级为1级，蜂蜜的添加可以中和蜂花粉的苦涩味，使曲奇甜度适中，感官评分最高（90）。综上所述，选择蜂蜜添加量为10%时进行正交试验设计。
2.4 焙烤温度对曲奇品质的影响
焙烤温度对曲奇硬度和色泽的影响如表6所示。
表6 焙烤温度对曲奇硬度和色泽的影响
Table 6 Different baking temperature on hardness and color of cookie
注：同列不同小写字母表示数据间差异显著（P<0.05）。
焙烤温度/℃150 160 170 180 190 H/g 311±6d 415±8c 402±2c 463±10b 484±9a L* 感官评分71.38±3.57a 74 66.86±4.20a 80 59.08±0.63b 88 54.01±2.66bc 82 48.28±1.11c 68
由表6可知，随着焙烤温度的升高，曲奇的L*显著降低，颜色变暗。廖珺等[25]研究焙烤温度对绿茶面包色差影响时也有相似结论。随着L*的降低，曲奇感官评分呈先升高后降低的趋势，L*为59.08，曲奇表面颜色均匀，呈金黄色，感官评分最高。这可能是因为焙烤温度低于170℃时，曲奇面团不能充分受热，曲奇颜色较浅，L*较高，而焙烤温度高于170℃时，容易在曲奇表面产生黑色不溶性物质，曲奇边缘出现焦糊状，颜色加深，L*较低。
随着焙烤温度的升高，曲奇硬度逐渐增大。这可能与曲奇焙烤过程中脂肪融化、淀粉糊化、蛋白质变性，以及气体排出、水分蒸发而引起的面团膨胀有关，这些变化均与焙烤温度密切相关[26]。随着焙烤温度的升高，曲奇感官评分呈先增加后降低的趋势。焙烤温度低于170℃时，曲奇烘焙成熟度低，硬度较小，有粘牙感；焙烤温度超过170℃时，曲奇硬度过高，感官评分降低[27]。另外，过高的焙烤温度还会加重曲奇的苦涩味，降低消费者对曲奇的喜好性。焙烤温度为170℃时，曲奇硬度为402 g，硬度等级为1级，此时曲奇口感酥脆，组织结构均匀，感官评分最高，为88分。综上所述，选择焙烤温度为170℃进行正交试验设计。
2.5 焙烤时间对曲奇品质的影响
焙烤时间对曲奇硬度和色泽的影响如表7所示。
表7 焙烤时间对曲奇硬度和色泽的影响
Table 7 Different baking time on hardness and color of cookie
注：同列不同小写字母表示数据间差异显著（P<0.05）。
焙烤时间/min 14 16 18 20 22 H/g 256±11d 348±24c 402±2b 464±23a 486±8a L* 感官评分73.52±1.54a 74 71.02±0.53a 78 59.08±0.63ab 90 53.68±0.23b 74 47.94±0.90c 64
由表7可知，随着焙烤时间的延长，曲奇的L*显著降低，曲奇颜色变暗。焙烤时间的延长会使更多还原糖与蛋白质发生美拉德反应，导致曲奇颜色变暗[28]。
曲奇的硬度随焙烤时间的延长呈上升趋势，这与Mudgil等[29]的研究结果一致，他们发现饼干硬度随焙烤时间的增加而增加。随焙烤时间的延长，曲奇的感官评分呈先升高后降低的趋势，焙烤时间为18 min时，曲奇硬度等级为1级，感官评分最高，为90分。焙烤时间低于18 min时，曲奇烘焙成熟度可能较低，有粘牙现象；而焙烤时间大于18 min时，曲奇水分散失过多，质地坚硬，影响曲奇感官品质。综上所述，选择曲奇焙烤时间为18 min进行正交试验设计。
2.6 曲奇正交试验
正交试验设计与结果见表8，方差分析结果见表9。
表8 正交试验设计与结果
Table 8 Design and result of orthogonal experiment
试验编号 A蜂花粉添加量/%感官评分1 3（30） 2（10） 3（180） 1（16） 74 2 3 3（15） 1（160） 2（18） 75 3 2（20） 1（5） 3 2 84 4 2 3 2（170） 1 80 5 2 2 1 3（20） 90 6 1（10） 3 3 3 74 7 1 1 1 1 74 8 3 1 2 3 75 9 1 2 2 2 88 K1 236 233 239 228 K2 254 252 243 247 K3 224 229 232 239 k1 78.67 77.67 79.67 76.00 k2 84.67 84.00 81.00 82.33 k3 74.67 76.33 77.33 79.67 R1 10.00 7.67 3.67 6.33 B蜂蜜添加量/%C焙烤温度/℃D焙烤时间/min
表9 感官评价方差分析结果
Table 9 Results of variance analysis of sensory evaluation
注：F0.01（2，9）=8.02；** 表示差异极显著（P＜0.01）。
因素 偏差平方和 自由度 均方 F值 显著性A 304.000 2 152.000 390.857 **B 196.333 2 98.167 252.429 **C 34.333 2 17.167 44.143 **D 114.333 2 57.167 147.000 **误差 3.500 9 0.389
由表8可知，影响曲奇感官评分的因素主次顺序为A、B、D、C，即蜂花粉添加量>蜂蜜添加量>焙烤时间>焙烤温度，4个因素均极显著影响曲奇的感官评分（P<0.01）（表9）。曲奇的最优工艺组合为A2B2C2D2，即蜂花粉添加量20%，蜂蜜添加量10%，焙烤温度170℃，焙烤时间18 min。在此工艺条件下进行验证试验，曲奇感官评分为91，硬度为395 g，L*为60.25，曲奇硬度等级为1级，与未添加蜂花粉和蜂蜜的曲奇相比，其感官评分更高，确定此工艺为最佳工艺。
2.7 蜂花粉曲奇的抗氧化能力
DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力和总还原能力被广泛用于生物物质的抗氧化活性评价[30]。蜂花粉和蜂蜜对曲奇抗氧化活性的影响如表10所示。
表10 蜂花粉和蜂蜜对曲奇抗氧化活性的影响
Table 10 Influence of bee pollen and honey on the antioxidant activities of cookie
注：同列不同小写字母表示数据间差异显著（P＜0.05）。
样品名称 DPPH自由基清除能力/%羟基自由基清除能力/% 总还原力P0H0 12.45±0.31e 21.24±1.17d 0.93±0.01e P0H10 74.75±0.38d 75.57±0.52c 1.30±0.01d P20H0 85.01±0.06c 88.09±0.64b 1.42±0.02c P20H10 90.14±0.45b 91.78±0.37a 2.91±0.01a
由表10可以看出，与未添加蜂花粉和蜂蜜的曲奇相比，单独添加蜂花粉或单独添加蜂蜜的曲奇，其抗氧化活性显著升高，同时添加蜂花粉（添加量20%）和蜂蜜（添加量10%）的曲奇，其DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力和总还原能力分别提高了77.69%、70.54%和1.98。这应该是因为蜂花粉中富含类黄酮类和酚酸类等具有抗氧化能力的多酚类物质[18]，而蜂蜜中单糖含量较高，焙烤过程中因美拉德反应形成的类黑素具有清除自由基的作用[31]。
3 结论
本文通过单因素和正交试验的方法研究了蜂花粉和蜂蜜添加量、焙烤温度、焙烤时间对曲奇品质的影响，并探究了蜂花粉和蜂蜜对曲奇抗氧化活性的影响。通过聚类分析确定1级曲奇硬度范围为360 g～420 g。通过色泽（明亮度L*）、硬度和感官评价确定曲奇的最优工艺：蜂花粉添加量为20%，蜂蜜添加量为10%，焙烤温度为170℃，焙烤时间为18 min。最优工艺制备的曲奇，感官评分为91分，硬度为395 g，硬度等级为1级。添加蜂花粉和蜂蜜显著提高了曲奇的总还原能力、DPPH自由基清除能力和羟基自由基清除能力。研究结果为开发营养型曲奇提供了新的思路。
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