蛹虫草[Cordyceps militaris（L）Link]又名北虫草，属子囊菌门（Ascom ycota）肉座目（Hypocreales）麦角菌科（Clavicipitaceae）[1-3]，主要化学成分有蛋白质、氨基酸、糖类、有机酸、生物碱、甾醇及酚类、无机元素和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等，具有良好的免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、抗感染等功能作用[4-6]。近年来，蛹虫草由于具有多种功能价值，受到研究者越来越多的关注，2009年被批准为新食品原料[7-9]，以蛹虫草子实体或其提取物为原料所生产的各类食品、保健品、化妆品已有多种，并且不断有新产品面世。但是，目前对蛹虫草功能成分的研究还不是很完善，主要侧重于虫草素[10]、虫草多糖[11]、虫草酸[12]、腺苷[13]的提取和相关生理功能作用的研究，而对于蛹虫草多酚提取工艺优化及其抗氧化活性评价等方面的研究报道相对较少。顾宇翔等[14]发现天然蛹虫草水提物中多酚含量明显高于醇提物，并且在抑制亚油酸氧化、清除DPPH自由基和羟自由基、螯合金属离子方面均显示出很高的活性；刘晓红等[15]研究表明蛹虫草子实体中总酚含量高于多糖含量，并且具有抗氧化活性；朱屋彪等[16]以乙醇为提取溶剂获得的多酚提取物对DPPH自由基和ABTS+自由基的清除率分别可达88.73%和84.71%。可见，蛹虫草子实体是天然多酚化合物的潜在资源，并且具有一定的抗氧化活性。研究表明，多酚是植物和大型真菌生长发育过程中一类重要的次生代谢产物[17]，具有多种生物活性，被称为“第七类营养素”，具有降血脂、抗衰老、抑菌、抗肿瘤等作用，在食品、保健品等行业具有重要的应用价值[17-20]。蛹虫草多酚作为天然无毒抗氧化剂的可再生绿色资源，其提取条件的优化及其生物活性的评价仍是其应用研究的前提与关键。近年来，响应面法已应用于蛹虫草多糖[21]、虫草素等[22]活性成分的提取，但在蛹虫草多酚提取工艺优化中的应用鲜有报道。本研究以蛹虫草子实体为原料，基于回流水浴提取技术，在单因素试验基础上，利用响应面法对蛹虫草多酚的提取工艺进行优化，并对其抗氧化活性进行测定分析，旨在为蛹虫草抗氧化功效评价及功能性产品研发奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
蛹虫草子实体干品：辽宁省微生物科学研究院；无水乙醇、福林酚试剂、碳酸钠（均为分析纯）、维生素C（优级纯）：天津博迪化工股份有限公司；pH7.0磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）、没食子酸标准对照品:上海源叶生物科技有限公司；总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）测定试剂盒、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力测定试剂盒、羟自由基清除能力测定试剂盒：苏州格锐思生物肯德基有限公司。
1.2 仪器与设备
TU1810紫外可见分光光度计：北京谱析通用仪器有限责任公司；PR224ZH/E型电子天平：奥豪斯仪器（常州）有限公司；SL-H-4型电热水浴锅：江苏荣华仪器制造有限公司；150型多功能粉碎机：永康市松青五金厂；GL-21M型医用离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 原料预处理
取新鲜无霉变的蛹虫草干燥子实体，利用粉碎机及80目样品筛进行粉碎、过筛，备用。
1.3.2 多酚含量测定
参照邓真华等[23]的多酚含量测定方法，采用分光光度法，以没食子酸浓度为横坐标，以吸光值A750为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线方程为y=4.012x+0.007，R2=0.999 7。于750 nm处分别测定不同试验条件获得的多酚提取液的吸光值，按照标准曲线方程计算供试样品液中多酚的浓度，多酚得率计算见公式（1）。
式中:C为供试样品液的多酚浓度，mg/mL；V为蛹虫草多酚提取液总体积，mL；m为样品质量，g；D为稀释倍数。
1.3.3 单因素试验
准确称取蛹虫草子实体干燥粉末0.500 0 g于磨口锥形瓶中，以水为提取溶剂，置于水浴锅中水浴回流提取；各因素的固定值为提取温度40℃、提取时间2 h、液料比 30∶1（mL/g），保持其他 2 个因素值不变，每次改变1个因素值，按照不同的提取时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）、提取温度（30、40、50、60、70 ℃）、液料比[20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）]对蛹虫草子实体多酚进行提取，于15℃、4 000 r/min的条件下离心15 min，将上清液过0.22 μm微孔滤膜，得到样品溶液测定多酚含量。
1.3.4 响应面工艺优化
在单因素试验基础上，以多酚得率为响应值，选择提取温度、提取时间、液料比3个因素为自变量，运用Box-Behnken组合试验设计，利用Design Expert 8.0软件进行多酚提取工艺的响应面优化分析。因素编码及水平见表1。
表1 Box-Behnken设计因素水平编码
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design
水平 因素A提取温度/℃B提取时间/hC液料比/（mL/g）-1 35 1.0 25∶1 0 50 1.5 40∶1 1 65 2.0 55∶1
1.3.5 抗氧化活性测定
1.3.5.1 总抗氧化能力测定
分别配制质量浓度为 0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 mg/mL的维生素C及蛹虫草多酚溶液，以维生素C溶液作阳性对照，采用2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]方法，使用 T-AOC 测定试剂盒进行测定分析，按照公式（2）计算供试样品液的总抗氧化能力。
式中：△A=A 空白-（A 测定-A 对照），其中的 A 测定为样品与ABTS工作液的吸光度，A对照为样品与PBS混合液吸光度，A空白为ABTS工作液与PBS混合液的吸光度；D为样品的稀释倍数。
1.3.5.2 DPPH自由基清除率测定
分别配制质量浓度为 0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 μg/mL的维生素C及蛹虫草多酚溶液，以维生素C溶液作阳性对照，利用DPPH自由基清除能力测定试剂盒进行测定，供试样品液的DPPH自由基清除率计算方法见公式（3）。
式中：A测定为样品与DPPH混合液的吸光度；A对照为样品与无水乙醇混合液的吸光度；A空白为DPPH与无水乙醇混合液的吸光度。
1.3.5.3 羟自由基清除率测定
分别配制质量浓度为0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg/mL 蛹虫草多酚溶液及 0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的维生素C溶液，以维生素C溶液作阳性对照，利用羟自由基清除能力测定试剂盒进行测定分析，供试样品液的羟自由基清除率计算方法见公式（4）。
式中：A测定为测定管的吸光度；A对照为对照管的吸光度；A空白为空白管的吸光度。
1.4 数据处理
采用Excel2007进行数据处理和制作图表，采用Design Expert8.0进行响应面试验设计和分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 不同提取时间对多酚得率的影响
提取时间对蛹虫草多酚得率的影响见图1。
图1 提取时间对蛹虫草多酚得率的影响
Fig.1 Effect of extraction time on the yield of Cordyceps militaris polyphenols
由图1可知，随着提取时间的延长，多酚得率先是呈逐渐增加的趋势，提取时间为1.5 h时，多酚得率达到峰值，当提取时间超过1.5 h时，多酚得率小幅度下降，之后变化趋势较为平稳。这主要是由于随着提取时间的延长，胞内多酚逐渐溶出直至胞外浓度趋于饱和，同时由于多酚在高温条件下具有不稳定性，以一定的速率进行降解，当多酚溶出速率与降解速率持平时，随着提取时间的延长多酚得率不再发生明显变化，趋于稳定。因此，选择提取时间为1.0、1.5、2.0 h进行后续试验。
2.1.2 不同提取温度对多酚得率的影响
提取温度对蛹虫草多酚得率的影响见图2。
图2 提取温度对蛹虫草多酚得率的影响
Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of Cordyceps militaris polyphenols
由图2可知，在30℃～70℃温度范围内，提取温度对多酚得率具有一定的影响，多酚得率随着提取温度的升高呈先升高后降低的趋势，当提取温度为50℃时多酚得率最大。这可能是由于在30℃～50℃，随着提取温度的升高，细胞壁软化程度增大，进而改变了细胞膜的通透性，促进胞内物质溶出速率增加，但提取温度过高，会导致溶液中杂质溶出量增加及部分多酚类物质分解或变性，从而导致多酚得率的明显降低。因此，选择提取温度为35、50、65℃进行后续试验。
2.1.3 不同液料比对多酚得率的影响
液料比对蛹虫草多酚得率的影响见图3。
图3 液料比对蛹虫草多酚得率的影响
Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the yield of Cordyceps militaris polyphenols
由图3可知，蛹虫草多酚得率随着液料比增大先升高后降低。液料比为30∶1（mL/g）时，多酚得率达到了较高水平（6.09 mg/g），然后随着液料比增加，多酚得率缓慢增加，液料比为40∶1（mL/g）时，多酚得率最高（6.19 mg/g）。这是由于随着提取溶剂的增加，样品与溶剂接触的表面积增大，多酚得率明显增加，继续增加液料比，胞内和胞外多酚浓度逐渐趋于一致。因此，选择 25∶1、40∶1、55∶1（mL/g）的液料比进行后续试验。
2.2 响应面优化结果
2.2.1 响应面试验设计及结果
响应面试验设计及结果见表2。
表2 响应面试验设计及结果
Table 2 Design and results of response surface experiment
试验号 因素 Y多酚得率/（mg/g）A提取温度/℃B提取时间/h C液料比/（mL/g）1 35 2.0 55∶1 5.325 2 65 1.0 55∶1 4.756 3 65 1.5 25∶1 4.705 4 65 2.0 40∶1 5.197 5 50 1.5 40∶1 6.108 6 50 2.0 55∶1 5.891 7 50 1.5 40∶1 6.024 8 35 1.5 55∶1 5.136 9 50 1.5 40∶1 5.989 10 50 1.5 40∶1 6.133 11 50 1.0 55∶1 5.797 12 50 2.0 25∶1 5.615 13 35 1.5 25∶1 5.130 14 50 1.0 25∶1 4.864 15 50 1.5 40∶1 6.327 16 65 1.5 55∶1 5.734 17 35 1.0 40∶1 5.164
利用Design Expert 8.0软件，对表2中的试验数据进行非线性回归分析，得到的预测模型方程：Y=6.098-0.045A+0.181B+0.281C+0.700AB+0.256AC-0.164BC-0.677A2+0.311B2-0.245C2。
回归模型方差分析结果见表3。
表3 回归方差及可信度分析
Table 3 Analysis of variance and reliability of regression
注：P<0.05表示差异显著；P<0.01表示差异极显著。
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值模型 4.11 9 0.46 28.57 0.000 1 A 0.016 1 0.016 0.48 0.344 1 B 0.26 1 0.26 34.86 0.004 9 C 0.63 1 0.63 55.01 0.000 4 AB 0.020 1 0.020 4.22 0.305 0 AC 0.26 1 0.26 8.89 0.004 9 BC 0.11 1 0.11 7.34 0.035 6 A2 1.93 1 1.93 165.38 <0.000 1 B2 0.41 1 0.41 63.11 0.001 5 C2 0.25 1 0.25 0.83 0.005 3残差 0.11 7 0.016失拟项 0.074 3 0.025 2.60 0.189 6纯误差 0.038 4 9.50×10-3总离差 4.23 16
由表3可知，回归模型的P=0.000 1＜0.01，表明模型达到了极显著水平，具有统计学意义；各因素对多酚得率的影响大小依次为液料比（C）>提取时间（B）>提取温度（A）；通过显著性检验可知，B、C、AC、A2、B2、C2对多酚得率的影响均为极显著，BC对多酚得率有显著影响，因素A、AB影响不显著，可见各因素对于响应值的影响并不是简单的线性关系；失拟项不显著（P=0.189 6>0.05），所获得的回归方程拟合度较好，试验中未知因素对试验结果的影响程度较小；回归方程的相关系数R2=0.973 5，说明多酚得率与提取温度、提取时间、液料比之间存在良好的线性关系，多酚得率的实际测定值与模型预测值之间具有良好的拟合相关性；模型调整决定系数RAdj2=0.939 4，表明蛹虫草多酚提取工艺中93.94%的变异分布均包含在所研究的3个因素中。因此，利用该回归方程确定最佳提取工艺条件是可行的。
2.2.2 各因素的交互作用对多酚得率的影响
各因素交互作用的响应面及等高线见图4。
图4 各因素两两交互作用的响应面图和等高线图
Fig.4 Response surface and contour of pairwise interaction of various factors
三维响应面阐释了当其他因素保持在零水平不变时，因变量和两个测试变量之间的相互作用[24]，曲面图越陡峭说明影响越大，相反，越平缓说明影响越弱，椭圆形的等高线表明两个因素的交互作用显著，圆形的等高线表明两个因素的交互作用不显著[25-26]。由图4可知，各因素间的交互作用所形成的响应面均为开口向下的凸形曲面；液料比及提取时间的坡面较提取温度的坡面较陡，以液料比的坡面最为陡峭，说明提取的液料比对多酚得率影响最大，并且3种交互作用对多酚得率的影响程度不尽相同，相比而言，提取温度与提取时间（AB）交互作用的等高线呈典型圆形，对多酚得率的影响不显著；提取时间与料液比（BC）、提取温度与液料比（AC）交互作用的响应面坡度陡峭，等高线呈椭圆形，对多酚得率的影响显著，这一结果与方差分析结果一致。
2.2.3 最优提取工艺参数及验证
利用Design-Expert8.0软件，通过分析及预测，获得了蛹虫草多酚最优提取工艺条件，即在提取温度51.22 ℃、提取时间 1.58 h、液料比 48.45∶1（mL/g）条件下，多酚得率最大预测值为6.19 mg/g。考生产虑到实际中可操作性，对最优工艺参数进行了修正：提取温度 51 ℃、提取时间 1.6 h、料液比 49∶1（mL/g）。为检验模型预测的准确性，优化条件下进行了3次验证试验，蛹虫草多酚得率平均值为6.03 mg/g，与模型预测值的偏差为2.65%，说明模型有效，可以用来指导蛹虫草多酚的提取。
2.3 抗氧化活性评价
2.3.1 总抗氧化能力分析
蛹虫草多酚提取液总抗氧化能力见图5。
图5 蛹虫草多酚和VC的总抗氧化能力
Fig.5 Total antioxidant activity of Cordyceps militaris polyphenols and VC
由图5可知，在0～4.0 mg/mL质量浓度范围内，随着维生素C及蛹虫草多酚质量浓度的增加，二者总抗氧化能力随之增强，且蛹虫草多酚溶液总抗氧化能力始终高于同等浓度的维生素C溶液，说明蛹虫草多酚具有良好的总抗氧化能力。
2.3.2 DPPH自由基清除率分析
蛹虫草多酚提取液的DPPH自由基的清除能力见图6。
图6 蛹虫草多酚和VC对DPPH自由基的清除能力
Fig.6 DPPH free radicals scavenging ability of Cordyceps militaris polyphenols and VC
由图6可知，在0～25 μg/mL质量浓度范围内，多酚提取液和维生素C对DPPH自由基清除率与其质量浓度呈现出良好的线性关系，蛹虫草多酚溶液和维生素C溶液的半抑制质量浓度IC50分别为19.52、14.69 μg/mL，表明蛹虫草多酚溶液对DPPH自由基具有一定清除能力，其对DPPH自由基清除能力为阳性对照维生素C溶液的75.25%。
2.3.3 羟自由基清除率分析
蛹虫草多酚提取液及维生素C对羟自由基清除率试验结果见图7、图8。
图7 蛹虫草多酚对羟基自由基的清除能力
Fig.7 Scavenging ability of Cordyceps militaris polyphenols against hydroxyl radicals
图8 维生素C对羟基自由基的清除能力
Fig.8 Scavenging ability of Vc against hydroxyl radicals
由图7、图8可知，在试验范围内，蛹虫草多酚及维生素C对羟自由基清除能力均随着质量浓度的升高而增强，供试样品液的质量浓度与清除率呈良好的线性关系；当蛹虫草多酚溶液的质量浓度为100 μg/mL时，对羟自由基的清除率达到了60.19%，其对羟自由基半抑制质量浓度为86.47 μg/mL，是维生素C溶液半抑制质量浓度（IC50=1.04 mg/mL）的8.31%。可见，蛹虫草多酚溶液羟自由基清除能力较强，明显优于阳性对照维生素C溶液。
3 结论
试验以水为提取溶剂，采用回流水浴提取的方法，在考察不同提取温度、提取时间、液料比对蛹虫草多酚得率影响的单因素试验基础上，利用响应面分析方法优化了蛹虫草多酚提取条件，确定最佳提取工艺为提取温度 51℃、提取时间 1.6 h、液料比 49∶1（mL/g）；优化条件下多酚得率为6.03 mg/g，与模型预测值6.19 mg/g较接近，表明建立的模型可靠，该提取工艺稳定合理，是提取蛹虫草多酚的可行方法。抗氧化活性试验表明：试验范围内，蛹虫草多酚溶液的总抗氧化能力及其对DPPH自由基、羟基自由基的清除率随着质量浓度的增加而增强，显示出了较好的量效关系。其中，蛹虫草多酚溶液总抗氧化能力始终高于同等质量浓度的维生素C溶液，对DPPH自由基的半抑制质量浓度为19.52 μg/mL，是阳性对照维生素C（IC50=14.69 μg/mL）清除能力的75.25%，对羟自由基半抑制质量浓度（IC50=86.47 μg/mL），是维生素C溶液半抑制质量浓度（IC50=1.04 mg/mL）的8.31%。可见，蛹虫草多酚具有较好的抗氧化活性，特别在总抗氧化能力及羟自由基清除能力方面明显优于维生素C溶液，是良好的天然抗氧化剂资源，有待于进一步开发及利用。以上研究结论为蛹虫草多酚提取及其功能食品的开发应用奠定了理论基础。
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