黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）为蔷薇科腺肋花楸属植物，原产于美国，上世纪九十年代引入国内。它能在恶劣的环境下生存，对环境的适应性强，不仅可以抵抗严寒，还能适应干旱的环境[1]。花楸果实呈黑紫色，富含大量的多酚类物质，其中以原花青素类化合物含量最高[2]，除此之外，还含有蛋白质、糖类、氨基酸、维生素、有机酸等多种有效成分[3]。花楸果实具有抗氧化[4-5]、抑菌[6-7]、抗炎[8-9]、抑制血管内皮炎症因子[10]、调节血糖[11-12]、改善脂质代谢[13]和肥胖[14]、抑制肿瘤生长[15-17]、保护神经细胞[18]等作用。
原花青素（proanthocyanidin，PC）的结构特殊，广泛存在于植物的果皮、果实和种子中。原花青素有“天然抗氧化剂”之称[19-22]，具有保护心脑血管、降低胆固醇[23]、缓解胃肠功能紊乱[24]和神经保护[25]等作用。根据聚合度不同原花青素可分为低聚原花青素（oligomeric proanthocyanidins，OPC） 和高聚原花青素（polymeric proanthocyanidins，PPC）[26]，研究证实，OPC 易被人体吸收利用，其抗氧化活性强于PPC[27]。
目前，从植物中获得原花青素的方法有很多[28-30]，超声波能够加速分子的运动，导致细胞壁的破碎，从而使细胞内的成分易于溶出，进入到溶剂中，可以有效地减少提取时间，提高提取效率[31]。
黑果腺肋花楸目前多用来制作复合果汁、酿造果酒[32]，而加工后剩余的果渣尚未被充分利用，造成一定程度的浪费。因此，本文将通过响应面法优化超声辅助提取黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素的工艺，并分析体外抗氧化能力，为果渣的精深加工奠定基础，为花楸植物的综合利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
1.1.1 原料及试剂
黑果腺肋花楸：市售；2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[ABTS，2，2'-amino-di（2-ethylbenzothiazoline sulphonic acid-6）ammonium salt]、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，1，1-Diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine）：美国Sigma公司；儿茶素标准品（纯度98%）、香草醛（纯度98%）：北京索莱宝科技有限公司；羟自由基试测试剂盒：南京建成生物工程研究所；甲醇、乙醇、浓盐酸、浓硫酸：天津鑫桥化工贸易有限公司。
1.1.2 仪器与设备
MK3酶标仪：美国热电公司；RV10旋转蒸发装置：IKA公司；JA4103A分析天平：上海精天电子仪器有限公司；中药粉碎机：郑州全泰机械有限公司；高速冷冻离心机：湘仪离心机有限公司；Elmasonic P 120H超声波提取仪：德国Elma公司；ALPHA 1-4冷冻干燥机∶德国Martin Christ公司。
1.2 试验方法
1.2.1 黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素提取工艺
取黑果腺肋花楸新鲜果实和果实榨汁后的果渣冻干后粉碎，分别过60目筛，得全果及果渣粉末，备用。准确称取花楸全果及果渣粉末各2.00 g，提取溶剂为不同浓度的乙醇，超声辅助提取后离心、浓缩、冻干，得到花楸全果及果渣原花青素提取物[33]。
1.2.2 单因素试验
分别考察液料比[35∶1、40∶1、45∶1、50：1、55∶1（mL/g）]、乙醇体积分数（30%、40%、50%、60%、70%）、提取时间（10、20、30、40、50 min）和提取温度（35、40、45、50、55 ℃）对黑果腺肋花楸全果及果渣原花青素得率的影响。
1.2.3 响应面试验
根据单因素试验结果，选取液料比、乙醇体积分数、提取时间和提取温度为自变量，以原花青素得率为响应值，设计四因素三水平的响应面试验，对黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素的提取工艺条件分别进行优化。响应面试验因素水平见表1。
表1 响应面因素水平
Table 1 Factors and levels in response surface design
水平D提取温度/℃-1 40∶1 45 0 45∶1 50 1 50∶1 55因素A液料比/（mL/g）B乙醇体积分数/%C提取时间/min 40 30 50 40 60 50
1.2.4 原花青素得率的计算
1.2.4.1 制作标准曲线
精密称取儿茶素标准品，用甲醇溶解并配制成浓度为1 mg/mL的儿茶素母液。根据文献[34]，使用香草醛-浓盐酸法反应30 min，在500 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，儿茶素标准溶液浓度为横坐标，回归方程为y=1.927 7x+0.018 1，R2=0.999 3，线性范围0.2 mg/mL～1.0 mg/mL。
1.2.4.2 原花青素得率的计算
原花青素得率计算公式如下。
式中∶W为原花青素得率，mg/g；c为原花青素浓度，mg/mL；D为稀释倍数；V为样品溶液体积，mL；m为黑果腺肋花楸全果或果渣粉末取样质量，g。
1.2.5 黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素的体外抗氧化活性
1.2.5.1 DPPH自由基清除率的测定
取黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素粉末配成浓度为 50、100、200、300、400 μg/mL 的原花青素提取液。分别取上述不同浓度的原花青素提取液和VC溶液各2.0 mL，加入2.0 mL浓度为0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，置于暗处静置30 min，在517 nm测定吸光度A；取0.5 mL浓度为0.2 mmol/L的DPPH溶液与蒸馏水混合，以乙醇为对照，在517 nm处测定吸光度A0；取上述不同浓度的原花青素提取液和VC溶液各2.0 mL，分别加入2.0 mL乙醇混合均匀后，在517 nm处测定吸光度A1，按下面公式计算DPPH自由基清除率[34]。
1.2.5.2 ABTS+自由基清除率的测定
取2 mmol/L ABTS溶液50 mL和70 mmol/L过硫酸钾溶液200 mL混匀后，低温放置12 h，使用时用无水乙醇稀释，使其在734 nm波长处吸光度A0为0.70±0.02。分别取 0.1 mL 浓度为 50、100、200、300、400 μg/mL黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素提取液和VC溶液，加入1.9 mL稀释后的ABTS+自由基溶液，静置15 min，在734 nm处的测定吸光度A，按照下面公式计算ABTS+自由基清除率[35]。
式中∶A0为ABTS+自由基溶液的吸光度；A为样品溶液的吸光度；A空为用无水乙醇的吸光度。
1.2.5.3 还原能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）的测定
参考文献[36]的方法稍作修改，分别取0.1 mL浓度为 50、100、200、300、400 μg/mL 的黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素提取液和VC溶液，加入3 mL FRAP工作液，充分混匀，37℃避光反应10min，测定593nm处的吸光度。按照上述方法，测定浓度范围0.1 mmol/L～1.0 mmol/L的FeSO4系列标准溶液吸光度，回归方程为y=0.515 8x+0.216 8（R2=0.990 5），计算出对应的FeSO4浓度，即为FRAP值。
1.2.5.4 羟自由基清除率的测定
分别取 0.1 mL 浓度为 50、100、200、300、400 μg/mL的黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素提取液和VC溶液，操作步骤参照羟自由基测试试剂盒说明书。按下述公式计算羟自由基清除率。
式中∶对照OD值是对照组试验（水代替样品溶液）的吸光值；测定OD值是样品组的吸光值。
1.3 数据处理
本试验取3次测定的平均值。响应面试验设计采用Design-Expert.V10.0.7软件，方差分析采用SPSS 20.0软件。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 液料比对黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素得率的影响
液料比对黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素得率的影响见图1。
图1 液料比对黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素得率的影响
Fig.1 Effect of liquid-to-material ratio on yield of proanthocyanidins from Aronia melanocarpa fruits and marc
如图 1 所示，当液料比为 35∶1（mL/g）～45∶1（mL/g）时，随着溶剂的增加，黑果腺肋花楸全果、果渣的原花青素得率也随之增加，液料比为45∶1（mL/g）时，原花青素得率最大，分别为103.65 mg/g和73.71 mg/g，当液料比超过45∶1（mL/g）时，花楸全果、果渣原花青素得率均缓慢减少。原因是溶剂量低，细胞中原花青素扩散和溶出缓慢，随着溶剂量的增加，原花青素的溶出也在加速，到一定程度时，原花青素的溶出到达顶峰[37]，即使再提高溶剂的量原花青素得率的也不再增加。故选取液料比 40∶1、45∶1、50∶1（mL/g）进行响应面优化试验。
2.1.2 乙醇体积分数对黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素得率的影响
乙醇体积分数对黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素得率的影响见图2。
图2 乙醇体积分数对黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素得率的影响
Fig.2 Effect of ethanol concentration on yield of proanthocyanidins from Aronia melanocarpa fruits and marc
如图2所示，当乙醇体积分数为30%～50%时，黑果腺肋花楸全果、果渣中的原花青素得率随着乙醇浓度的提高而增加，当乙醇体积分数为50%时，原花青素得率达到最高，分别为102.81 mg/g和80.23 mg/g，但随着乙醇浓度的增加，溶液的极性发生了变化，加速了醇溶性和脂溶性杂质的溶出，造成了黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素得率的下降[38]。因此选取乙醇体积分数40%、50%、60%进行响应面试验。
2.1.3 提取时间对黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素得率的影响
提取时间对黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素得率的影响见图3。
图3 提取时间对黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素得率的影响
Fig.3 Effect of extraction time on yield of proanthocyanidins from Aronia melanocarpa fruits and marc
如图3所示，随着提取时间的延长，黑果腺肋花楸全果、果渣的原花青素得率先增加后减少，在40 min时达到最大，分别为107.23 mg/g和81.94 mg/g。提取时间超过40 min原花青素得率降低是由于超声波使黑果腺肋花楸的细胞壁破裂，增加了原花青素的溶出，持续时间过长则使原花青素结构破坏，从而导致得率下降[39]。因此选取提取时间30、40、50 min进行响应面试验。
2.1.4 提取温度对黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素得率的影响
提取温度对黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素得率的影响见图4。
图4 提取温度对黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素得率的影响
Fig.4 Effect of extraction temperature on yield of proanthocyanidins from Aronia melanocarpa fruits and marc
如图4所示，随着提取温度的增加，黑果腺肋花楸全果、果渣的原花青素得率先增大后减小，在50℃时达到最大，分别为106.45 mg/g和80.86 mg/g。50℃以下随着温度升高，原花青素扩散速率加快，超过50℃后，温度过高可使原花青素分解，从而使原花青素得率有所下降[39]。因此选取提取温度45、50、55℃进行响应面试验。
2.2 响应面法优化结果与分析
2.2.1 模型建立及方差分析
利用Design-Expert.V10.0.7软件对所得数据进行响应面分析，响应面试验结果见表2。
表2 响应面试验结果
Table 2 Results of response surface test
编号A液料比/（mL/g）Y2果渣原花青素得率/（mg/g）1 45∶1 50 30 45 84.79 65.79 2 45∶1 60 50 50 78.13 60.62 3 40∶1 60 40 50 93.61 72.63 4 50∶1 50 30 50 82.65 64.12 5 45∶1 50 40 50 96.22 77.54 6 45∶1 50 40 50 102.77 79.68 7 45∶1 50 50 45 83.81 65.02 8 45∶1 40 40 45 97.32 75.51 9 45∶1 50 30 55 95.04 73.71 10 45∶1 50 40 50 99.93 78.46 11 45∶1 50 40 50 101.99 74.65 12 40∶1 50 30 50 100.34 77.85 13 45∶1 60 40 45 85.14 66.06 14 45∶1 60 30 50 89.90 69.75 15 45∶1 40 40 55 92.74 71.95 16 50∶1 50 50 50 86.25 66.92 17 45∶1 40 50 50 92.22 71.55 18 50∶1 50 40 55 91.47 70.96 19 45∶1 50 50 55 82.71 64.17 20 45∶1 40 30 50 89.72 69.62 21 45∶1 50 40 50 100.70 79.74 22 40∶1 40 40 50 94.54 73.35 23 40∶1 50 40 45 93.67 72.67 24 50∶1 50 40 45 83.46 64.75 25 45∶1 60 40 55 92.39 71.68 26 40∶1 50 40 55 94.42 73.26 27 50∶1 40 40 50 90.77 70.42 28 50∶1 60 40 50 87.93 68.22 29 40∶1 50 50 50 87.35 67.77 B乙醇体积分数/%C提取时间/min D提取温度/℃Y1全果原花青素得率/（mg/g）
经回归拟合后，得出黑果腺肋花楸全果和果渣模型的二次多项回归方程分别为Y1=100.32-3.45A-2.52B-2.66C+1.72D-0.48AB+4.15AC+1.82AD-3.57BC+2.96BD-2.84CD-3.95A2-4.21B2-8.15C2-5.14D2和Y2=78.61-2.68A-1.95B-2.07C+1.33D-0.37AB+3.22AC+1.40AD-2.76BC+2.30BD-2.19CD-3.46A2-3.65B2-6.71C2-4.38D2。
对上述回归模型的方差及显著性分析结果见表3（全果）和表4（果渣）。
表3 模型回归方差分析结果（全果）
Table 3 Variance analysis results of regression equation（fruits）
注：*差异显著（p<0.05）；**差异极显著（p<0.01）。
来源 平方和 自由度 均方 F值 p值 显著性模型 1 105.11 14 78.93 15.44 3.81×10-6 **A 142.83 1 142.83 27.94 1.15×10-4 **B 76.05 1 76.05 14.88 0.001 7 **C 85.17 1 85.17 16.66 0.001 1 **D 35.29 1 35.29 6.90 0.020 0 *AB 0.91 1 0.91 0.18 0.680 0 AC 68.81 1 68.81 13.46 0.002 5 **AD 13.18 1 13.18 2.58 0.130 0 BC 50.91 1 50.90 9.96 0.007 0 **BD 34.99 1 34.99 6.84 0.020 0 *CD 32.20 1 32.20 6.30 0.025 0 *A2 101.32 1 101.32 19.82 5.47×10-4 **B2 114.89 1 114.89 22.47 3.17×10-4 **C2 430.42 1 430.43 84.20 2.68×10-7 **D2 171.35 1 171.35 33.52 4.69×10-5 **残差 71.56 14 5.11失拟项 45.67 10 4.57 0.70 0.70纯误差 25.90 4 6.47总和 1 176.67 28
表4 模型回归方差分析结果（果渣）
Table 4 Variance analysis results of regression equation（marc）
注∶*差异显著（p<0.05）；**差异极显著（p<0.01）。
来源 平方和 自由度 均方 F值 p值 显著性模型 677.53 14 48.40 15.06 4.45×10-6 **A 86.08 1 86.08 26.79 1.41×10-4 **B 45.79 1 45.79 14.25 0.002 1 **C 51.21 1 51.21 15.94 0.001 3 **D 21.15 1 21.15 6.58 0.022 0 *AB 0.55 1 0.55 0.17 0.690 0 AC 41.47 1 41.47 12.90 0.002 9 **AD 7.90 1 7.90 2.46 0.140 0 BC 30.58 1 30.58 9.52 0.008 1 **BD 21.07 1 21.07 6.56 0.023 0 *CD 19.23 1 19.23 5.98 0.028 *A2 64.63 1 64.63 20.11 5.14×10-4 **B2 72.86 1 72.86 22.67 3.04×10-4 **C2 266.54 1 266.54 82.94 2.94×10-7 **D2 107.99 1 107.99 33.60 4.63×10-5 **残差 44.99 14 3.21失拟项 27.50 10 2.75 0.63 0.75纯误差 17.49 4 4.37总和 722.52 28
由表3和表4可知，全果和果渣模型的p<0.000 1，极显著，失拟项p值均>0.05，不显著，表明上述模型的拟合度良好，R2分别为0.939 2和0.931 2，表明有93.92%和93.12%的试验数据可以运用上述两个模型进行分析，试验误差小，模型的可靠性高。模型中一次项 A、B 和 C，交互项 AC 和 BC，二次项 A2、B2、C2和 D2对花楸全果、果渣原花青素得率的影响极显著（p<0.01）；花楸全果、果渣原花青素得率受一次项D，交互项BD和CD的影响显著（p<0.05），通过F值可以判断出4个因素对黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素得率的影响大小依次为A（液料比）>C（提取时间）>B（乙醇体积分数）>D（提取温度）。由此可知，各因素对花楸全果和果渣原花青素得率的影响是基本一致的。
2.2.2 因素间交互作用分析
通过响应面立体曲面图进一步分析两个因素间的交互作用，其曲面越陡峭，说明两个因素的交互作用越显著（图5和图6）。
图5 各因素交互作用对黑果腺肋花楸全果原花青素得率的影响
Fig.5 Response surface plot of the effect of each factor on the yield of proanthocyanidins from Aronia melanocarpa fruits
图6 各因素交互作用对黑果腺肋花楸果渣原花青素得率的影响
Fig.6 Response surface plot of the effect of each factor on the yield of proanthocyanidins from Aronia melanocarpa marc
由图5和图6可以看出，黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素得率受AC、BC、BD和CD的影响显著，与上述的方差分析结果相一致。
2.2.3 验证试验
由回归方程得到的黑果腺肋花楸全果原花青素最优提取工艺∶液料比 42.17∶1（mL/g），乙醇体积分数49.07%，提取时间36.92 min，提取温度50.63℃。由回归方程（2）得到的黑果腺肋花楸果渣原花青素最优提取工艺：液料比 42.58∶1（mL/g），乙醇体积分数48.93%，提取时间37.34 min，提取温度50.56℃。在此工艺下黑果腺肋花楸全果和果渣原花青素理论得率分别为101.93、79.71 mg/g。充分考虑到操作的可行性，将上述黑果腺肋花楸全果和果渣原花青素提取最优工艺调整为液料比45∶1（mL/g），乙醇体积分数50%，提取时间37 min，提取温度50℃。通过3次平行试验，黑果腺肋花楸全果和果渣原花青素得率平均值分别为98.48、78.04 mg/g，与理论预测值相差3.4%和2.1%，表明该模型优化的最优提取工艺条件稳定可靠，具有实际应用价值。
2.3 黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素的体外抗氧化活性
2.3.1 DPPH自由基清除能力的测定
不同浓度的黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素对DPPH自由基的清除作用见图7。
图7 不同浓度黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素对DPPH自由基的清除作用
Fig.7 DPPH radical scavenging ability of different concentration of proanthocyanidins from Aronia melanocarpa fruits and marc
如图7可知，黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素和VC溶液的DPPH自由基清除率随浓度的增加而逐渐增加，呈现显著的正相关。黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素浓度为400 μg/mL时，DPPH自由基的清除率分别达到51.78%和73.64%，IC50分别为406.73 μg/mL和156.73 μg/mL，均弱于VC（IC50为4.29 μg/mL）。果渣原花青素的DPPH自由基清除能力强于全果，这与刘文旭等[40]的研究结果相一致，可能是由于果渣原花青素中低聚原花青素含量较高所致[41]。
2.3.2 ABTS+自由基清除能力的测定
不同浓度的黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素对ABTS+自由基的清除作用见图8。
图8 不同浓度黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素对ABTS+自由基的清除作用
Fig.8 ABTS+radical scavenging ability of different concentration of proanthocyanidins from Aronia melanocarpa fruits and marc
由图8可知，黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素和VC溶液的ABTS+自由基清除率随浓度的增大而逐渐增大。黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素浓度为400μg/mL时，对ABTS+自由基的清除率分别达到33.08%和58.12%，IC50分别为 779.51 μg/mL 和 315.95 μg/mL，均弱于VC（IC50为23.57 μg/mL）。这与孙伟鹏等[42]得出的沙棘果渣中原花青素对清除ABTS+自由基的IC50为354.62 μg/mL的结论相近。在同样的浓度下，黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素清除ABTS+自由基的能力弱于清除DPPH自由基的能力。同时，果渣原花青素的ABTS+自由基清除能力仍然强于全果，这与上述清除DPPH自由基的结果相一致。
2.3.3 还原能力测定结果
黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素还原能力测定结果如图9所示。
图9 不同浓度黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素的铁离子还原能力
Fig.9 Reducing ability of different concentration of proanthocyanidins from Aronia melanocarpa fruits and marc
总抗氧化能力的评价一般采用铁离子的还原抗氧化分析法，其结果反映抗氧化剂的还原能力大小[43]。由图9所示，在所测定的浓度范围内，随着浓度的增大，黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素和VC的FRAP值增大，且呈现一定的正相关，有剂量依赖关系，这与文献中柳树叶原花青素总抗氧化能力结果一致[44]。黑果腺肋花楸果渣总抗氧化能力在低浓度时明显弱于VC，高浓度时与VC相当。果渣原花青素的总抗氧化能力优于全果原花青素，可能是由于果渣原花青素中低聚原花青素含量较高所致，与上述清除ABTS+、DPPH自由基结果一致。
2.3.4 羟自由基清除能力的测定
不同浓度的黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素对羟自由基的清除作用见图10。
图10 不同浓度黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素对羟自由基的清除作用
Fig.10 Hydroxyl radicals-scavenging ability of different concentration of proanthocyanidins from Aronia melanocarpa fruits and marc
由图10可知，黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素和VC溶液对羟自由基的清除率随浓度的提高而逐步增加，呈现出显著的正相关，这与徐晓云等[45]研究的沙棘籽原花青素体外清除羟自由基的量效关系相一致。黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素与VC（IC50为268.03 μg/mL）比较，其对羟自由基的清除能力相对较弱，IC50分别为 1 319.02、393.66 μg/mL。当浓度达到为400 μg/mL时，其对羟自由基的清除率分别达到33.14%和50.30%，高浓度时果渣原花青素的清除能力依然明显高于全果原花青素。
3 结论
本文采用超声波辅助法提取黑果腺肋花楸全果和果渣中原花青素，通过单因素和响应面优化得到的最优提取工艺：液料比45∶1（mL/g），乙醇体积分数50%，提取时间37 min，提取温度50℃。在此工艺下，黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素得率分别为98.48、78.04 mg/g。体外抗氧化试验表明黑果腺肋花楸全果、果渣原花青素不仅具有良好的还原能力，对ABTS+自由基（IC50为 779.51、315.95 μg/mL）、DPPH 自由基（IC50为 406.73、156.73 μg/mL）和羟自由基（IC50为 1 319.02、393.66 μg/mL）均具有一定的清除能力，其中对DPPH自由基清除能力最优。黑果腺肋花楸果渣中仍含有大量的原花青素，且其体外抗氧化能力优于全果原花青素。因此，黑果腺肋花楸果渣具有良好的再利用价值，可以进一步开发成抗氧化产品的原料，充分发挥花楸植物的价值。
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