益生菌通过改善肠道菌群平衡,从而促进对人体健康有益的活性微生物的产生,其活菌数量(不少于107CFU/g)是其功效发挥的先决条件。乳杆菌(Lactobacillus)作为益生菌,对人类和动物健康有着重要的促进作用,如调节胃肠道生态平衡、增强免疫力、降低胆固醇、降血压和抑制肿瘤前体物质形成等[1],其常被用于发酵乳制品,但对牛奶蛋白过敏、乳糖不耐症、高胆固醇等人群不适宜饮用[2]。因此,需要探索非乳制品基质作为益生菌载体的替代品[3]。而果蔬汁因富含维生素、膳食纤维、甾醇等营养物质,且具有更清爽的口感备受消费者喜爱。因此,将益生菌与果蔬汁结合,开发益生菌发酵果蔬汁是十分必要的[4]。Hashemi等[5]利用植物乳杆菌LS5发酵甜柠檬汁,结果表明样品的pH值、乳酸和抗氧化能力增加,葡萄糖和果糖含量、总酸度、柠檬酸和酚类物质含量下降。杨立启等[6]探讨了4种不同柑橘全果汁经植物乳杆菌发酵前后主要成分变化规律,结果表明伴随着总酸含量的增加,总糖、还原糖和总黄酮含量总体下降。Zhang等[7]利用植物乳杆菌J26发酵蓝莓果汁,结果显示发酵后蓝莓果汁的DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基的清除能力明显增强,对Caco-2细胞(人结直肠腺癌细胞)的氧化损伤也有一定的减轻作用。由此可见,乳杆菌对发酵果蔬汁的组分及营养特性有显著改善效果,这可能与乳杆菌对果蔬组分的代谢有关。
蓝莓果蔬汁富含酚类化合物,酚类化合物是植物次生代谢物的主要类型之一,它直接关系到果蔬汁的色泽、风味等感官品质[8]。此外,多酚的化学结构使果蔬汁具有抗氧化、清除自由基、抗癌、抗炎等活性。其中花色苷属于小分子的水溶性酚类物质,易被人体吸收,具有较强的清除自由基能力,是有效的纯天然抗氧化剂。目前对于发酵蓝莓汁的工艺及其产品风味研究较多,但对于该过程中花色苷的变化规律研究较少。
本研究选取植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)FM-LP-9和发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)FMLP-SR6对蓝莓花色苷提取液进行发酵,研究发酵过程中微生物的发酵特性以及单体花色苷的衍变,以期为益生菌发酵富含花色苷类果蔬制品的研究提供参考数据。
蓝莓冻果(品种“灿烂”,属兔眼系列):南京悠维有机食品有限公司;植物乳杆菌FM-LP-9(保藏号CGMCC16701)、发酵乳杆菌FM-LP-SR6(保藏号CGMCC24329):保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;MRS肉汤培养基:北京奥博星生物技术有限公司;琼脂粉:广州赛国生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、福林酚(Folin-Ciocalteu):上海麦克林生化科技有限公司;总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)测定试剂盒:南京建成生物工程研究所;无水乙醇、没食子酸、芦丁、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、碳酸钠、苯酚、浓硫酸(均为分析纯):国药集团化学试剂有限公司。
RE-3000旋转蒸发器:上海亚荣生化仪器厂;HH-4恒温水浴锅:常州国华电器有限公司;SX-50高压灭菌锅:日本TOMY公司;LRH-150F生化培养箱:上海一恒科学仪器有限公司;1260高效液相色谱仪:美国Agilent公司;E-poch酶标仪:美国Bio-Tek公司;P5紫外/可见分光光度计:上海美谱达仪器有限公司;CR-400色差分析仪:日本柯尼卡美能达公司;ZD-2自动电位滴定仪:上海仪电科学仪器股份有限公司。
1.3.1 花色苷的提取
取蓝莓冻果于4℃下解冻12 h后打浆、5 000 r/min离心15 min,得到上清液。上清液与乙醇以1∶3的体积比混匀后静置过夜,40℃下旋转蒸发去除乙醇,得花色苷粗提液。旋蒸后的花色苷粗提液采用大孔树脂AB-8纯化,得到花色苷提取液备用。
1.3.2 菌种活化
取冻存于-80℃下的植物乳杆菌FM-LP-9和发酵乳杆菌FM-LP-SR6,于室温解冻后,以1%接种量接种在MRS肉汤培养基并于37℃活化,用平板划线法接种于MRS固体培养基,37℃培养24 h获得单菌落,挑取单菌落于3 mL MRS肉汤培养基中,37℃培养24 h获得菌悬液备用。
1.3.3 蓝莓花色苷发酵
采用无菌滤膜对提取的花色苷提取液过滤除菌,并用MRS培养基调整两株菌初始花色苷总浓度一致。将L.plantarum FM-LP-9和L.fermentum FM-LP-SR6菌悬液以2%接种量接种于样品,37℃静置发酵48 h,前18 h内每4 h取样进行菌落计数,随后每8 h取样进行理化及微生物指标分析。以未添加菌悬液蓝莓花色苷培养液为对照组。
1.3.4 指标测定
1.3.4.1 菌落总数与发酵液pH值
采用GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》测定发酵过程中益生菌的菌落总数[9]。pH值采用自动电位滴定仪进行测定。
1.3.4.2 色差的测定
色差采用色差分析仪进行测定,其中L*代表亮度,a*代表红(+)或绿(-),b*代表黄(+)或蓝(-),ΔE表示花色苷发酵液与花色苷和培养基的色度差,根据以下公式进行计算[10]。
式中:L0*为未添加菌悬液蓝莓花色苷培养液的亮度;a0*为未添加菌悬液蓝莓花色苷培养液红绿颜色的亮度;b0*为未添加菌悬液蓝莓花色苷培养液黄蓝颜色的亮度。
1.3.4.3 总黄酮含量
参考杨赟[11]的方法,以芦丁为标准品,绘制标准曲线,并将测得的吸光值代入标准曲线回归方程y=3.690 2x+0.034 4中,计算样品中总黄酮含量。
1.3.4.4 总糖含量
参考刘志明等[12]的方法,以葡萄糖为标准品,绘制标准曲线,并将测得的吸光值代入标准曲线回归方程y=5.862x+0.296中,计算得到总糖含量。
1.3.4.5 总酚含量
参考Herken等[13]的方法,以没食子酸为标准品,绘制标准曲线,代入标准曲线回归方程y=0.013 1x+0.150 8中,获得总酚含量。
1.3.4.6 体外抗氧化能力
DPPH自由基清除能力测定采用Lee等[14]的方法,取2 mL花色苷发酵液,加入2 mL DPPH溶液,混合均匀后,置于室温下遮光反应30 min,在517 nm处测定样品组吸光值,以无水乙醇为对照组,DPPH自由基清除率按下式计算。
式中:A1为样品组吸光值;A0为对照组吸光值。
按T-AOC测定试剂盒说明书方法测定总抗氧化能力,在37℃下反应10 min后,520 nm处测定吸光值,以双蒸水为对照组,总抗氧化能力计算公式如下。
式中:A测定为样品在520 nm下的吸光值;A对照为对照组在520 nm下的吸光值;T为反应时间,min;V反总为反应体系总体积,mL;V样为取样量,mL;N为样品测试前稀释倍数。
1.3.4.7 花色苷含量
采用pH示差法[15]测定发酵前后样品中的花色苷含量,分别吸取1.0 mL样品,用pH1.0和pH4.5的缓冲液稀释至10 mL,混匀。以1.0 mL花色苷样品发酵液和9.0 mL相应缓冲液混合作为空白,分别在520 nm和700 nm处测定吸光值。花色苷含量按下列公式计算。
式中:ΔA为吸光值差值;A520为520 nm处吸光值;A700为700 nm处吸光值;Mw为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的摩尔质量,449.2 g/mol;ε为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的消光系数,26 900 L/(mol·cm);DF为稀释倍数;L为比色皿光程,1 cm。
1.3.4.8 单体花色苷含量
单体花色苷的含量测定采用高效液相色谱-质谱联用(high performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS)技术[16]。HPLC-MS 测定参数如下。
色谱柱型号:Agilent Poroshell 120 EC-C18柱(3.0 mm×100 mm,2.7 μm);流动相:A 相为 0.1%乙酸,B 相为乙腈。梯度洗脱程序参数:0~5 min,5%B,5 min~20 min,40%B,20 min~22 min,40%~95%A,22 min~24 min,95%B;流速:0.35 mL/min;进样量:2 μL。
MS采用电喷雾离子源,正离子扫描模式,扫描范围为m/z 50~1 200;干燥气温度350℃;氮气流速1.5 L/min;干燥器压力133.0 kPa;喷射电压4 kV;扫描一级质谱和二级质谱,源温度120℃,源电流0.24 μA,毛细管电压2.0 V。应用Masslynx 4.1和UNIFI收集和处理数据。
1.3.4.9 有机酸含量
花色苷发酵前后有机酸变化的测定采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法[17]。色谱柱型号:Waters Atlantis T3(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:0.02 mol/L NaH2PO4,pH2.7;流速:0.9 mL/min;进样量:10 μL;柱温:35 ℃;波长:210 nm。
试验均重复3次,结果以平均值±标准差表示,采用Origin 2021软件作图。使用IBM SPSS Statistics 26对试验数据进行单因素显著性分析,P<0.05代表差异显著。
菌落总数可直接反映乳杆菌在含有花色苷培养液中的生长代谢情况,可作为发酵过程的重要指标[18]。Lactobacillus plantarum FM-LP-9和L.fermentum FMLP-SR6在花色苷发酵液中的菌落总数和pH值变化如图1所示。
图1 发酵过程中菌落总数、pH值变化情况
Fig.1 Changes in the total number of colonies and pH during the fermentation
由图1可知,两株菌的初始浓度约为8.0 lg(CFU/mL),随着乳杆菌发酵时间的延长,菌落总数呈现出先上升后下降最终趋于稳定的变化趋势。这是由于发酵初始阶段,营养基质丰富,乳杆菌迅速增殖,在发酵8 h时菌落总数达到最高值,分别为(10.27±0.23)lg(CFU/mL)和(10.29±0.24)lg(CFU/mL)。16 h后随着发酵时间的延长,菌体生长趋于平稳,发酵48 h时,两株菌的菌落总数分别下降至(9.22±0.12)lg(CFU/mL)和(9.14±0.10)lg(CFU/mL),但均能达到益生菌发挥作用的国家标准限量[7.0 lg(CFU/mL)][19]。随着发酵时间的延长,pH值呈现逐渐下降的变化趋势。发酵前花色苷培养基体系的pH值为4.88和4.87,经L.plantarum FM-LP-9和 L.fermentum FM-LP-SR6发酵 48 h,pH值分别降至3.69和3.66。综上,菌落总数降低可能是由于高酸环境抑制了乳杆菌的增长,随着pH值趋于稳定,菌落总数也逐渐稳定,两种益生菌均能在添加蓝莓花色苷的培养基体系中较好生长[20]。
乳杆菌发酵过程中发酵液总糖含量的变化如图2所示。
图2 发酵过程中总糖含量变化情况
Fig.2 Changes in total sugar content during the fermentation
不同大小写字母表示相同菌株不同发酵时间下存在显著性差异(P<0.05)。
由图2可知,L.plantarum FM-LP-9和L.fermentum FM-LP-SR6发酵8 h~48 h,随着发酵时间延长总糖含量与初始时间相比均显著下降。这是因为在发酵过程中未添加碳源情况下,糖类物质为主要碳源物质,随着发酵的进行总糖含量减少。然而,两株乳杆菌发酵过程中总糖含量下降幅度存在差异,经37℃发酵48 h,L.plantarum FM-LP-9 和 L.fermentum FM-LPSR6发酵液中总糖含量相较于发酵前分别降低了48.65%和58.97%。
黄酮类化合物有着较强的抗氧化能力,常作为评价营养品质的重要指标[21]。乳杆菌发酵过程中发酵液总黄酮含量和总酚含量的变化如图3所示。
图3 发酵过程中总黄酮和总酚含量变化情况
Fig.3 Changes of total flavonoids and total phenols during the fermentation
不同大小写字母表示相同菌株不同发酵时间下存在显著性差异(P<0.05)。
由图3可知,发酵液中初始总黄酮含量为8.6mg/L~8.7 mg/L,随着发酵时间的延长,发酵液中总黄酮含量整体呈先上升而后略有降低趋势。L.plantarum FMLP-9和L.fermentum FM-LP-SR6发酵48 h,总黄酮含量分别增加至11.4 mg/L和11.8 mg/L。经L.fermentum FM-LP-SR6发酵后总黄酮含量峰值出现的时间(24 h)要早于 L.plantarum FM-LP-9(32 h)。宫祥博等[22]研究发现红树莓果酒经发酵后黄酮含量增加,与本试验研究结果相似。两株菌发酵前后总酚含量整体变化不大。王行等[23]和黄晓杰等[24]研究证实,蓝莓酒发酵过程中总酚含量均无明显变化,与本研究结果一致。
色泽是评价果蔬汁饮品的重要指标之一。发酵液48 h内的色差变化如表1所示。
表1 乳杆菌发酵花色苷过程中色差变化Table 1 Changes of color difference in anthocyanins during Lactobacillus fermentation
注:同列不同字母表示相同发酵菌株不同发酵时间下存在显著性差异(P<0.05)。
发酵时间/h L.plantarum FM-LP-9 L.fermentum FM-LP-SR6 L* a* b* L* a* b* ΔE对照组 23.73±0.43 40.22±0.03 32.58±0.07 23.73±0.43 40.22±0.03 32.58±0.07 0 26.12±0.53 42.53±0.35 37.14±0.48 27.00±0.52 43.24±0.24 38.41±0.60 5.08±0.77i 4 19.25±0.24 41.84±0.11 29.63±0.31 19.55±0.49 41.66±0.04 30.09±0.70 7.33±0.74h 8 15.38±0.55 39.60±0.35 24.19±0.78 15.00±0.70 39.12±0.31 23.76±1.15 12.47±1.29g 12 12.89±0.36 37.47±0.21 20.53±0.53 12.75±0.14 37.16±0.08 20.27±0.21 16.78±0.18f 16 11.51±0.35 36.11±0.28 18.37±0.53 11.57±0.12 36.05±0.08 18.51±0.19 19.06±0.15e 20 10.77±0.31 35.48±0.21 17.21±0.52 10.65±0.12 35.11±0.02 17.06±0.21 20.94±0.16d 24 10.13±0.23 34.73±0.18 16.20±0.33 10.24±0.24 34.69±0.15 16.45±0.42 21.74±0.42cd 32 9.89±0.22 34.37±0.16 15.86±0.41 9.96±0.11 33.78±0.31 15.95±0.22 22.53±0.32bc 40 9.67±0.37 33.59±0.36 15.51±0.58 9.67±0.37 33.88±0.28 15.51±0.62 23.00±0.69ab 48 9.27±0.18 32.89±0.09 14.83±0.32 9.42±0.44 32.93±0.29 15.08±0.68 23.75±0.78a ΔE 5.60±0.32H 5.64±0.72H 11.86±0.93G 16.45±0.58F 19.19±0.60E 20.66±0.55D 21.99±0.35C 22.48±0.40BC 23.09±0.69AB 24.04±0.28A
由表1可知,随着发酵时间的延长,L*、a*、b*值整体上均逐渐降低。L*降低表示花色苷发酵液颜色变暗,a*值降低表示花色苷发酵液红色减弱,b*值降低表示花色苷发酵液蓝色减弱。ΔE值越大表示颜色差距越大,ΔE>3时能明显察觉出两者的颜色差别[25]。发酵过程中,两株菌ΔE分别从5.60、5.08增大至24.04、23.75,表明外观颜色有显著变化,这可能与花色苷发生降解有关[26]。
花色苷是蓝莓的呈色物质和功能性成分,由花青素和糖苷构成,大部分以单体的形式存在[27]。发酵过程中花色苷含量的变化如图4所示。
图4 发酵过程中花色苷含量变化情况
Fig.4 Changes of anthocyanin contents during the fermentation
如图4所示,发酵液中花色苷含量随着发酵时间的延长呈下降趋势。两株菌发酵前花色苷含量均在110 mg/L,发酵后花色苷含量明显下降,经L.plantarum FM-LP-9发酵48 h时,花色苷含量降至53.49 mg/L;L.fermentum FM-LP-SR6发酵48 h时,花色苷含量降至50.65 mg/L,表明在发酵过程中花色苷在乳杆菌作用下可能降解转化为其他化合物。
发酵过程中单体花色苷的变化分析结果如图5所示,发酵前后单体花色苷相对含量变化情况见表2。
图5 乳杆菌发酵培养液中单体花色苷的载荷图
Fig.5 Principal component analysis of anthocyanin monomers in the fermentation broth of Lactobacillus strains
表2 发酵前后单体花色苷相对含量变化情况
Table 2 Changes in relative contents of anthocyanin monomers before and after fermentation%
注:-表示无单体花色苷检出。
L.plantarum FM-LP-9飞燕草素-3-O-葡萄糖苷 1.57±0.25 - 2.64±0.23矢车菊素-3-O-葡萄糖苷 27.09±3.12 - 12.14±2.15矮牵牛素-3-O-半乳糖苷 1.08±0.03 - -矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷 4.42±0.73 5.94±1.81 7.53±2.23矢车菊素-3-O-阿拉伯糖苷 2.55±0.39 6.08±1.90 2.68±0.31矮牵牛素3-O-阿拉伯糖苷 - 2.56±0.15 2.02±0.08芍药素-3-O-半乳糖苷 - 1.62±0.04 14.30±3.26锦葵花素-3-O-半乳糖苷 24.17±1.75 65.35±4.23 42.10±9.35锦葵花素-3-O-葡萄糖苷 23.88±1.83 - -芍药素-3-O-阿拉伯糖苷 1.28±0.12 3.23±0.12 1.47±0.11锦葵花素-3-O-阿拉伯糖苷 13.96±1.42 15.21±2.40 15.11±2.56单体花色苷 对照组 L.fermentum FM-LP-SR6
由图5可知,不同乳杆菌发酵的样品在单体花色苷组分方面存在差异,对花色苷的代谢差异主要来自矮牵牛素-3-O-半乳糖苷、锦葵花素-3-O-葡萄糖苷。结合表2分析,与未发酵的花色苷相比,经L.fermentum FM-LP-SR6发酵后的花色苷中,未检测出飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矮牵牛素-3-O-半乳糖苷和锦葵花素-3-O-葡萄糖苷;经L.plantarum FM-LP-9发酵后的花色苷中,未检测到矮牵牛素-3-O-半乳糖苷、锦葵花素-3-O-葡萄糖苷;对照组的花色苷中未检测到矮牵牛素3-O-阿拉伯糖苷、芍药素-3-O-半乳糖苷。两株菌发酵过程中可能增强了花色苷生物利用率,在代谢过程中生成矮牵牛素3-O-阿拉伯糖苷和芍药素-3-O-半乳糖苷。不同菌株水解糖苷的能力有差异,两种乳杆菌对花色苷的代谢能力也有所不同。有研究表明β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶能将异黄酮苷水解为苷元[28],但不同菌株水解糖苷能力有差异[29],这可能是因为两株乳杆菌对花色苷的代谢能力不同。
有机酸对花色苷等物质有保护作用,同时也是决定果酒或果汁品质的重要指标[18]。两株乳杆菌发酵前后蓝莓花色苷发酵液有机酸含量变化见表3,乳杆菌发酵液中有机酸的载荷图见图6。
表3 不同乳杆菌发酵前后发酵液有机酸含量变化
Table 3 Changes of organic acids contents in the fermentation broth before and after Lactobacillus fermentation mg/L
有机酸种类 对照组 L.plantarum FM-LP-9 L.fermentum FM-LP-SR6草酸 323.76±11.23 94.95±4.32 70.58±7.45苹果酸 273.60±12.58 71.46±4.60 76.40±6.57乳酸 40.06±4.54 3 142.36±28.30 3 040.85±36.40乙酸 63.28±5.78 1 132.23±13.60 912.36±16.40柠檬酸 1 123.90±37.05 1 099.56±7.80 913.49±17.30
图6 乳杆菌发酵液中有机酸的载荷图
Fig.6 Principal component analysis of organic acids in the fermentation broth of the Lactobacillus strains
由表3可知,经L.plantarum FM-LP-9发酵后乳酸、乙酸含量增加至3 142.36、1 132.23 mg/L,分别是对照组的78.44、17.89倍,草酸、苹果酸、柠檬酸含量分别降低至 94.95、71.46、1 099.56 mg/L,与对照组相比下降了70.67%、73.88%、2.17%;经 L.fermentum FM-LPSR6发酵后乳酸、乙酸含量分别增加至3 040.85、912.36 mg/L,分别是对照组的75.91、14.42倍,草酸、苹果酸、柠檬酸含量分别降低至 70.58、76.40、913.49 mg/L,与对照组相比下降了78.20%、72.08%、18.72%。草酸含量的降低可能是由于草酸在发酵过程中以草酸钙的形式沉积在细胞中。苹果酸、柠檬酸含量降低的可能原因是乳杆菌通过均质发酵、异质发酵和其他代谢途径将其转化生成乳酸、乙酸[28],从表3中可以看出乳酸和乙酸含量明显提高。结合图6进行分析,经发酵后乳酸、乙酸含量明显增加,柠檬酸的变化较其他4种酸变化不明显。L.plantarum FM-LP-9的发酵效果优于L.fermentum FM-LP-SR6。
浆果中富含的花色苷和其他酚类物质是主要的抗氧化活性物质[30]。通过测定发酵前后发酵液的抗氧化能力变化,可以反映两种乳杆菌发酵过程对花色苷及其他酚类物质生物活性的影响[31]。体外抗氧化能力测定结果如图7所示。
图7 不同乳杆菌发酵前后发酵液DPPH自由基清除能力和总抗氧化能力变化
Fig.7 Changes in DPPH radical scavenging capacity and total antioxidant capacity in the fermentation broth before and after Lactobacillus fermentation
不同小写字母表示存在显著性差异(P<0.05)。
由图7可知,经发酵后的蓝莓花色苷对DPPH自由基清除能力相比发酵前有显著提高,这与Zhang等[7]和Ryu等[32]的研究结果一致,经L.plantarum FM-LP-9、L.fermentum FM-LP-SR6发酵后,两发酵体系的总抗氧化能力分别下降了6.95 U/mL和4.21 U/mL,这与花色苷含量降低、总酚含量无明显变化结果一致。
本研究选用自主分离的Lactobacillus plantarum FM-LP-9和Lactobacillus fermentum FM-LP-SR6对蓝莓花色苷发酵48 h,研究了发酵过程中菌落总数、营养成分、花色苷含量等指标的变化规律,重点研究了花色苷的色泽、含量、单体成分的变化情况,并评价了发酵后花色苷的抗氧化活性。发酵后两株乳杆菌的菌落总数均可维持在9.0 lg(CFU/mL),达到益生菌在人体发挥作用的标准。发酵结束后,花色苷发酵液的pH值降低,色差值升高;总糖含量降低,总黄酮含量增加,总花色苷含量降低。两株菌均能代谢花色苷和转化酚类物质,其对花色苷代谢的差异主要来自飞燕草素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷。两株乳杆菌发酵后体系中的乳酸、乙酸含量升高,草酸、苹果酸、柠檬酸含量均降低。该研究结果可为益生菌发酵花色苷类果蔬汁的相关研究提供参考。
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