近年来，我国核桃产业发展迅速，2020年产量达468.9万t，全国种植面积超过807.6万hm2[1]。核桃仁除含有大量的油脂外，还含有丰富的蛋白质。核桃蛋白有较高的营养价值和良好的生理功能[2]，富含18种氨基酸，人体所需的8种必需氨基酸含量较丰富[3]，谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸含量较高[4]，且易被人体消化吸收[5]，是一种良好的植物蛋白来源。核桃蛋白的加工利用对实现核桃高值化利用具有重要意义。但核桃蛋白溶解性低、乳化性能差，在食品加工中的应用受到限制，因此需要对核桃蛋白改性以改善其功能性质。化学改性由于安全性原因，目前尚处于基础理论研究阶段。酶法改性虽效果显著但成本较高。物理改性因有较高的安全性、方便快捷，且对营养物质影响较小[6]，被广泛应用于蛋白质改性研究中。
超微粉碎技术是利用空气分离、剪切等形式进行粉碎的新兴物理技术。超微粉碎可分为干法粉碎和湿法粉碎两种，针对不同特性的物料，可采用不同的超微粉碎方法，如高速气流粉碎（气流粉碎）、球磨、高压均质、微射流粉碎、超声粉碎、高速旋转冲击粉碎[7]等。超微粉碎过后的物料粒径小于25 μm，颗粒更微细，表面积和孔隙率更大，物理性质和化学性质独特。超微粉碎技术制备的超细粉末具有良好的分散性和溶解性[8]，在粮油加工、水产品加工等领域得到广泛应用[9]。He等[10]研究表明水芹粉末经超微粉碎后溶解性和分散性显著增强。Sun等[11]研究表明超微粉碎技术可以提高乳清蛋白的乳化性能，张慧等[12]研究发现超微粉碎可以提高谷朊粉的起泡性能、乳化性能等。
目前，国内外对核桃蛋白的研究多集中在其营养价值和功能活性方面，常通过酶解、超声等改性方法提高核桃蛋白功能性质，但对超微粉碎改性核桃蛋白的研究鲜见报道。本试验采用超微粉碎技术对核桃蛋白进行处理，研究超微粉碎对核桃蛋白结构和功能性质的影响，以期为核桃蛋白的加工和利用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
核桃蛋白（蛋白质含量70.9%，常温干法制备）：北京农林科学院林业果实研究所核桃实验室自制；大豆油：中粮集团有限公司；试验用水均为蒸馏水；牛血清白蛋白标准品：北京酷莱博科技有限公司；90%乙醇、5，5’-二硫代双（2-硝基苯甲酸）[5，5’-dithiobis（2-nitrobenzoic acid），DTNB]、尿素（Urea）、三羟甲基氨基甲烷 [tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]、甘氨酸（glycine，Gly）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、考马斯亮蓝 G-250：北京索莱宝科技有限公司。以上化学试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
ZYK-303S型超微粉碎机：北京中科浩宇科技发展有限公司；UV-4802紫外分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；IKA T18数显分散机：艾卡仪器设备有限公司；LD4-40离心机：北京京立离心机有限公司；BT-9300S激光粒度分布仪：丹东百特仪器有限公司；MIRA LMS扫描电子显微镜：泰斯肯（中国）有限公司；LEICA-EM SCD005溅射镀膜仪：徕卡显微系统（上海）贸易有限公司；Tensor 27傅里叶变换红外光谱仪：德国BRUKER公司；DSC-8000差示扫描量热仪：珀金埃尔默仪器（上海）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 粉体的制备与粒度测定
采用超微粉碎机对核桃蛋白进行超微粉碎处理，通过改变变频器频率（15、25、35、45 Hz）制备不同粉体，在风机的作用下通过负压腔在上、下2个出口收集，得到不同粒径的核桃蛋白超微粉碎样品，样品处理名称的“上”“下”代表从上或下出料口得到的粉体。采用激光粒度分布仪对核桃蛋白粉体进行粒径测定。
1.3.2 扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）分析
将少量核桃蛋白固定到导电胶上，并使用溅射镀膜仪涂上金。使用扫描电子显微镜观察核桃蛋白的微观形态，工作电压为3 kV，放大倍数为10 000倍。
1.3.3 二级结构测定
采用傅里叶变换红外色谱（Fourier transform infrared spectra，FTIR）对核桃蛋白的二级结构进行测定，参考张爱琴等[13]的方法，准确称取1 mg样品与100 mg溴化钾。充分混合，碾磨压片，采用傅里叶变换红外色谱仪进行全波段扫描，扫描范围为400 cm-1～4 000 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描次数为64。
1.3.4 游离巯基含量测定
配制1%的核桃蛋白溶液，取0.5 mL蛋白溶液，加2.5 mL Tris-Gly-Urea（8 mol/L），加入 0.02 mL DTNB 溶液（4 mg/mL），25℃下保温30 min，其余步骤与Segat等[14]的方法一致。
1.3.5 热学性质分析
采用差示扫描量热（differential scanning calorimetry，DSC）法，以变性温度和热焓值为指标对核桃蛋白进行热学性质分析。将核桃蛋白制备成15%的溶液，称取10 mg压盘，以空铝盘为空白对照，进行DSC扫描。从30℃开始，至120℃扫描结束，升温速率为 20℃/min[15]。
1.3.6 溶解性测定
称取核桃蛋白0.5 g，加入100 mL蒸馏水，用磁力搅拌器搅拌1 h，3 000 r/min离心20 min，将上清液过滤到100 mL容量瓶中，定容备用，蛋白含量采用考马斯亮蓝法进行测定[16]，溶解性计算公式如下。
1.3.7 持水性测定
称取1.0 g核桃蛋白，质量记为m1（g），加入20 mL蒸馏水，搅拌均匀，静置30 min，在3 000 r/min下离心10 min，除去上清液，控干多余水分，记录沉淀质量m2（g），持水性计算公式[17]如下。
1.3.8 持油性测定
核桃蛋白的持油性采用李梁宵[18]的方法进行测定，并略作修改。称取1.0g核桃蛋白，质量记作m1（g），加入10 mL大豆油，充分搅拌，静置30 min，在3 000 r/min下离心25 min，弃去上清液，用滤纸吸去沉淀中残余大豆油，记录沉淀质量m2（g）。持油性计算公式如下。
1.3.9 起泡性及泡沫稳定性测定
参考Mao等[19]的方法，将30 mL 10 mg/mL的核桃蛋白溶液磁力搅拌30 min后，以10 000 r/min的速度高速分散2 min，将混合物立即转入量筒中，记录溶液和泡沫的总体积V1（mL）。静置30min后，记录溶液和泡沫总体积V2（mL）。起泡性及泡沫稳定性计算公式如下。
1.3.10 乳化性能测定
参考Zhao等[20]的方法，取30 mL 1%的核桃蛋白样品溶液于小烧杯中，室温条件下磁力搅拌30 min，加入10 mL大豆油。在10 000 r/min下分散2 min，取烧杯底部乳液100 μL，加入5 mL 0.1%SDS溶液在500 nm下测定吸光值，10 min后重复上述操作。乳化活性和乳化稳定性计算公式如下。
式中：D 为稀释因子，100；c 为样品浓度，g/mL；θ为油相占乳液的体积分数，0.25；A0和A10分别为样品在0 min和10 min时的吸光值。
1.4 数据处理
试验数据利用SPSS 22软件进行统计分析，采用Origin 2018软件作图。
2 结果与分析
2.1 超微粉碎核桃蛋白粒度分析
核桃蛋白原料以及经不同频率超微粉碎处理的粉体的粒径和比表面积如表1所示。
表1 超微粉碎对核桃蛋白粒径和比表面积的影响
Table 1 Effect of superfine grinding on the particle size and specific surface area of walnut protein
处理 粒径/μm比表面积/（m2/kg）原料 65.06 155.7 45 Hz下 24.01 244.6 45 Hz上 46.26 194.5 35 Hz下 19.45 267.7 35 Hz上 22.67 250.5 25 Hz下 18.08 274.5 25 Hz上 16.57 280.9 15 Hz下 15.93 293.7 15 Hz上 10.65 354.2
由表1可见，原料的粒径最大，比表面积最小，分别为65.06 μm和155.7 m2/kg。超微粉碎处理后，核桃蛋白的粒径减小。随着超微粉碎频率降低，核桃蛋白粒径整体呈减小趋势，除45 Hz上以外，得到的核桃蛋白样品达到超微粉体的粒径要求（10 μm～25 μm）。15 Hz上得到的蛋白样品粒径最小（10.65 μm），比表面积最大（354.2 m2/kg），与原料相比，粒径降低了83.63%，比表面积增加了127%。这是由于随着变频器频率降低，风机转速减慢，通过负压腔吸走的蛋白颗粒减小，得到的核桃蛋白粒径减小。
2.2 超微粉碎对核桃蛋白二级结构的影响
核桃蛋白原料和超微粉碎核桃蛋白的二级结构见表2。
表2 超微粉碎对核桃蛋白二级结构的影响
Table 2 Effect of superfine grinding on the secondary structure of walnut protein
注：同列不同字母代表样品间差异显著（p＜0.05）。
处理 β-折叠/% 无规则卷曲/% α-螺旋/% β-转角/%原料 28.38±1.31a 22.80±1.24a 22.76±0.83b 26.06±0.80d 45 Hz下 22.49±0.66d 18.06±0.01b 17.22±0.16c 42.22±0.49b 45 Hz上 22.80±0.03d 18.07±0.02b 17.19±0.11c 41.94±0.12b 35 Hz下 21.72±0.12b 18.10±0.01a 17.36±0.12a 42.82±0.23d 35 Hz上 26.55±0.55d 23.11±0.58b 23.65±0.79c26.68±0.82ab 25 Hz下 24.40±0.58c 22.92±0.63a 23.83±0.66a 28.85±1.39c 25 Hz上 24.70±0.70c 22.81±0.56a 23.77±0.56a 28.73±1.36c 15 Hz下 20.23±0.38e 17.95±0.01b 17.66±0.04c 44.16±0.36a 15 Hz上 20.43±0.56e 17.94±0.04b 17.63±0.09c 43.99±0.49a
采用傅里叶变换红外光谱仪测定超微粉碎前后核桃蛋白的二级结构，采用Peakfit 4.12软件进行分析，选取1 600 cm-1～1 700 cm-1间的谱带，基线校正后去卷积、拟合，各二级结构以峰面积比表示。各子峰与二级结构对应关系：1 612cm-1～1 640 cm-1和 1 689 cm-1～1 698 cm-1为 β-折叠，1 640 cm-1～1 649 cm-1为无规则卷曲，1 650 cm-1～1 660 cm-1为 α-螺旋，1 660 cm-1～1 688 cm-1为 β-转角[21-22]。由表2可见，原料中β-折叠为主要结构，其次为β-转角，无规则卷曲和α-螺旋含量相当。超微粉碎处理后，β-转角变为主要结构，其次为β-折叠，无规则卷曲和α-螺旋含量相当。可能是因为蛋白质分子解折叠，埋藏的分子被暴露[23]。β-折叠是通过分子间氢键维持的蛋白质分子间的有序结构，β-转角和无规则卷曲是蛋白质分子的无序结构[24]，超微粉碎处理后，β-折叠比例下降，β-转角比例上升，说明超微粉碎后蛋白质分子间氢键作用减弱，蛋白质分子间聚集程度降低[25]，核桃蛋白分子由有序向无序转变。
2.3 超微粉碎对核桃蛋白微观结构的影响
采用扫描电子显微镜研究核桃蛋白颗粒的物理形态，核桃蛋白原料和超微粉碎核桃蛋白的SEM照片如图1所示。
图1 超微粉碎对核桃蛋白微观形态的影响
Fig.1 Effect of superfine grinding on the microstructure of walnut protein
a.原料；b.45 Hz下；c.45 Hz上；d.35 Hz下；e.35 Hz上；f.25 Hz下；g.25 Hz上；h.15 Hz下；i.15 Hz上。
由图1可以看出，不同超微处理的核桃蛋白颗粒显示出不同的表面结构。未经超微粉碎的核桃蛋白大部分呈现小片状，且以更加紧凑的形状出现。经超微粉碎后，核桃蛋白颗粒体积减小，呈现无序的不规则形，颗粒之间的分散性明显增大，与张爱琴等[26]的研究结果一致。以上印证了粒径越小的蛋白样品，扫描电子显微镜照片中的蛋白颗粒直径越小，比表面积越大。
2.4 超微粉碎对核桃蛋白游离巯基含量的影响
核桃蛋白原料和超微粉碎核桃蛋白的游离巯基含量见图2。
图2 超微粉碎对核桃蛋白游离巯基含量的影响
Fig.2 Effect of superfine grinding on the content of free sulfhydryl group of walnut protein
不同字母表示样品间差异显著（p＜0.05）。
由图2可知，超微粉碎处理后，随着频率的减小，游离巯基含量整体呈现先增加后减小的趋势，与高国祥等[27]的研究结果一致。原料的游离巯基含量最低，为23.66μmol/g。35 Hz上时得到的核桃蛋白游离巯基含量最高，为30.01 μmol/g。15 Hz上得到的核桃蛋白游离巯基含量为28.29 μmol/g，但仍旧高于原料的游离巯基含量。这可能是由于超微粉碎使核桃蛋白变性伸展，内部巯基裸露出来，所以游离巯基含量增加。但在空气中与氧接触，游离巯基被氧化形成二硫键[28]。
2.5 热学性质分析
用差示扫描量热法分析蛋白质的热学性质变化，结果见表3。
表3 超微粉碎前后核桃蛋白的DSC测定结果
Table 3 DSC results of walnut protein before and after superfine grinding
处理 起始温度/℃ 峰值温度/℃ 结束温度/℃ 热焓值/（J/g）原料 97.18±1.32 103.09±1.34 114.68±0.28 0.85±0.25 45 Hz下 97.34±0.85 103.67±0.16 111.82±1.14 0.78±0.58 45 Hz上 96.67±0.31 102.20±0.73 113.79±1.18 0.77±0.26 35 Hz下 96.31±0.57 101.78±0.29 112.95±1.52 0.78±0.18 35 Hz上 96.23±0.04 101.48±0.29 114.77±0.20 0.76±0.13 25 Hz下 97.46±0.27 102.63±0.59 112.74±1.74 0.69±0.34 25 Hz上 96.77±0.02 101.78±0.28 114.04±0.91 0.43±0.16 15 Hz下 97.49±0.14 102.50±0.13 112.40±0.78 0.51±0.11 15 Hz上 98.90±1.11 102.63±0.55 114.97±0.02 0.31±0.19
变性温度为图谱中最大峰的峰值温度，热焓值为最大峰的峰面积。变性温度表示蛋白质的热稳定性，热焓值反映蛋白质分子聚集程度[29]。从表3可以看出，吸热峰的峰值温度为101℃～104℃。超微粉碎处理后，核桃蛋白的变性温度无明显差异，说明超微粉碎对核桃蛋白的热稳定性无明显影响；随着频率的减小，热焓值整体呈降低趋势，由0.85 J/g下降到0.31 J/g，说明聚集程度下降，这与2.2得出超微粉碎后蛋白质分子间聚集程度降低这一结果一致。
2.6 超微粉碎对核桃蛋白溶解性的影响
核桃蛋白原料和超微粉碎核桃蛋白的溶解性见图3。
图3 超微粉碎对核桃蛋白溶解性的影响
Fig.3 Effect of superfine grinding on solubility of walnut protein
不同字母表示样品间差异显著（p＜0.05）。
溶解性是蛋白质最基本的物理属性，是评估蛋白质功能性质的关键参数[30]。由图3可知，随着频率的减小，溶解性整体上呈现先升高后降低的趋势。原料的溶解性最低，为24.63%。超微粉碎后，核桃蛋白颗粒在25 Hz下的溶解性达到最大值，为29.19%，比原料增加了18.51%；在45 Hz上最低，为24.80%，略高于原料的溶解性。这可能是由于超微粉碎后核桃蛋白粒径减小，比表面积增大，提高了蛋白质-水的结合能力，溶解性整体增加[27]。然而随着核桃蛋白粒径继续减小，蛋白分子解折叠，疏水性氨基酸暴露，巯基和二硫键交换形成不可溶性热聚集物，溶解性整体降低[27，31]。
2.7 超微粉碎对核桃蛋白持水性和持油性的影响
核桃蛋白原料和超微粉碎核桃蛋白的持水性和持油性见图4。
图4 超微粉碎核桃蛋白持水性持油性变化
Fig.4 Effect of superfine grinding on the water-holding capacity and oil-binding capacity of walnut protein
不同字母表示样品间差异显著（p＜0.05）。
蛋白质的持水性代表蛋白质对水的保持能力，持油性代表蛋白质与游离油脂的结合能力[32]。由图4可见，随着频率的减小，核桃蛋白的持水性和持油性整体呈降低趋势。原料的持水性和持油性最高，分别为3.87 g/g和2.52 g/g。15 Hz上的核桃蛋白样品持水性和持油性最低，分别为1.55 g/g和1.39 g/g，与原料相比分别降低了59.95%和44.84%。分析原因可能是核桃蛋白在粉碎过程受到强烈的机械剪切作用，蛋白内部的孔状结构和表面极性氨基酸遭到破坏，导致蛋白滞留水或油的能力下降[33-34]。
2.8 超微粉碎对核桃蛋白起泡性能的影响
核桃蛋白原料和超微粉碎核桃蛋白的起泡性和泡沫稳定性见图5。
图5 超微粉碎对核桃蛋白起泡性能的影响
Fig.5 Effect of superfine grinding on the foaming properties of walnut protein
不同字母表示样品间差异显著（p<0.05）。
蛋白质的起泡性能是指它在气-液界面形成坚韧的薄膜，使大量气泡并入和稳定的能力，包括起泡性和泡沫稳定性[35]。起泡性能的好坏由蛋白质浓度、蛋白分子柔性、蛋白质疏水性、带电基团以及极性基团的数量、分布等决定[36]。由图5可知，随着频率的减小，核桃蛋白的起泡性整体呈上升趋势，泡沫稳定性整体呈降低趋势，15 Hz上起泡性达到最大值（104.4%），是原料的1.92倍，泡沫稳定性达到最小值，比原料降低了23.64%。这可能是因为超微粉碎破坏了蛋白空间结构，核桃蛋白分子结构展开，柔性更高，埋藏在内部的疏水性基团裸露出来，促进空气-水界面的形成，致使起泡性增大[37]。强烈的蛋白质-蛋白质相互作用是形成稳定泡沫所必需的[38]，超微粉碎破坏了蛋白质分子间的作用力，导致泡沫稳定性下降。
2.9 超微粉碎对核桃蛋白乳化性能的影响
核桃蛋白原料和超微粉碎核桃蛋白的乳化活性和乳化稳定性见图6。
图6 超微粉碎对核桃蛋白乳化性能的影响
Fig.6 Effect of superfine grinding on the emulsifying properties of walnut protein
不同字母表示样品间差异显著（p<0.05）。
蛋白质的乳化活性和乳化稳定性与蛋白质溶解性、表面电荷、表面疏水性、分子柔顺性密切相关[27]。由图6可见，随着频率的减小，核桃蛋白的乳化稳定性整体呈增加趋势。原料的乳化活性和乳化稳定性分别为44.41 m2/g和72.64 min。超微粉碎后，35 Hz上时乳化活性最大，为49.31 m2/g，15 Hz上时的乳化稳定性最佳，为101.79 min，为原料的1.4倍。可能是随着频率减小，粒径整体减小，蛋白质的空间结构破坏，疏水基团暴露出来，表面疏水性增强，界面张力降低，乳化活性增强，乳状液越稳定[39-40]。然而随着粒径减小，核桃蛋白分子进一步展开，表面疏水性增强，导致亲水-疏水作用不平衡，乳化活性降低[31]。
3 结论
超微粉碎处理可使核桃蛋白结构发生改变，部分功能性质有显著改善。超微粉碎处理使核桃蛋白的颗粒粒径减小，比表面积增加，从β-折叠为主要结构转变为β-转角为主要结构，分子由有序向无序转变。随着超微粉碎频率降低，核桃蛋白的粒径整体呈减小趋势，泡沫稳定性、持水性和持油性呈降低趋势，溶解性、巯基含量整体呈先增加后降低趋势，起泡性、乳化稳定性整体呈增加趋势。原料的持水性和持油性最好，45 Hz超微粉碎处理得到的蛋白泡沫稳定性较高，35Hz超微粉碎处理得到的蛋白乳化活性较好，25 Hz超微粉碎处理得到的蛋白溶解性较高，15 Hz超微粉碎处理得到的蛋白起泡性最高。综上所述，超微粉碎处理可以改善核桃蛋白的功能性质，可根据所需核桃蛋白的功能性质选择适宜的超微粉碎频率对核桃蛋白进行处理，提高核桃蛋白利用价值。
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