衰老是指机体的结构和功能随着年龄增长发生退行性变化的现象，在此期间神经系统逐渐退化，导致行为障碍与学习记忆力下降[1-2]。其中氧化应激的增加是引发衰老的重要因素之一，氧化应激的程度取决于氧化与内源性抗氧化系统之间的平衡[3-4]。因此，提高机体的抗氧化能力可以延缓衰老过程[5]。
研究表明，蛋白肽具有良好的抗氧化活性，可以清除过剩自由基、抑制氧化损伤、提高机体的抗氧化能力，并通过调控衰老过程中重要基因的表达及相关途径的相互作用来延缓衰老[6-7]。而分子量越小的蛋白肽，更易被机体吸收，并在体内发挥生物活性，抗氧化、延缓衰老效果更好[8-9]。Lin等[10]制备出分子量小于3 kDa的海参肽，能有效延长果蝇寿命，抑制小鼠衰老。Zhu等[11]制备出分子量集中在1 kDa以下的水飞蓟蛋白酶解物，研究发现其在衰老模型小鼠体内具有良好的抗氧化和抗衰老功效。体外实验也证实，蛋白肽通过激活Nrf2转录因子和削弱衰老相关分泌表型的作用来抑制细胞衰老[12]。因此蛋白肽作为高效、低副作用的天然物质，为预防衰老和治疗衰老引起的相关疾病提供了更多选择。
南瓜籽是成熟南瓜的种子，其成分具有抗糖尿病、抗癌、改善前列腺增生的效果[13-14]。研究表明，南瓜籽蛋白肽具有良好的抗氧化活性[15-16]。王培宇[17]制备得到南瓜籽蛋白肽，并通过体外实验研究了其对人体皮肤细胞的抗衰老效果。相对于体外实验，体内实验涉及因素更复杂，能更准确地反映蛋白肽在生物体内的功效。因此，通过体内实验评价蛋白肽的抗衰老作用是必要的。
本研究将南瓜籽蛋白水解后采用超滤法分离得到不同组分的南瓜籽蛋白肽，测定其抗氧化活性并筛选作用效果最佳的组分进行动物实验。以D-半乳糖衰老模型小鼠为研究对象，通过测定各实验组小鼠的体质量、脏器系数、代谢产物肌酐、总胆固醇含量，以及血清和肝脏组织中总抗氧化能力、超氧化物歧化酶活性及肝脏组织中单胺氧化酶活性、B淋巴细胞瘤-2基因含量、半胱氨酸蛋白酶-3活性，探究南瓜籽蛋白肽抑制衰老的作用和机理，以期为从南瓜籽中提取天然抗衰老物质提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
SPF级雄性昆明小鼠：辽宁长生生物技术股份有限公司，6周龄，体质量（25±3）g，实验动物生产许可证号SCXK（辽）2020-0001；南瓜籽：黑龙江省双鸭山市宝清县。
Alcalase碱性蛋白酶（2.4 AU/g）：丹麦诺维信公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、水杨酸、D-半乳糖：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；双氧水、正己烷：天津市富宇精细化工有限公司；氢氧化钠：天津市大陆化学试剂厂；无水乙醇：天津市天利化学试剂有限公司；总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）测定试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性测定试剂盒、单胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）活性测定试剂盒、肌酐（creatinine，CRE）含量测定试剂盒、总胆固醇（total cholesterol，T-CHO）含量测定试剂盒、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）活性测定试剂盒、蛋白定量测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）测定试剂盒：上海颖心实验室设备有限公司。以上化学试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
榨油机（CZR309）：广州万彪通用设备有限公司；酶标仪（Tecan Infinite M200）：瑞士帝肯（TECAN）集团公司；紫外-可见分光光度计（UV-1700）：日本岛津公司；低温高速离心机（Sigma 3-18K）：德国Sigma公司；精密pH计（PHS-3C）：上海精密科学仪器有限公司；电热恒温水浴锅（HWS-24）：上海齐欣科学仪器有限公司；电子天平（FA 2004）：上海横平仪器仪表厂；真空冷冻干燥机（FD-1）：北京博医康实验仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 南瓜籽蛋白肽的制备
南瓜籽采用冷榨法和溶剂（正己烷）萃取法去除南瓜籽油，得到的南瓜籽粕采用碱溶酸沉法提取南瓜籽蛋白[18]。将南瓜籽蛋白配制成质量分数为6%的南瓜籽蛋白溶液，使用Alcalase碱性蛋白酶酶解，酶解条件确定为添加Alcalase碱性蛋白酶3%（基于南瓜籽蛋白质含量）、pH8、温度55℃、酶解时间5 h。于沸水浴灭酶15 min，酶解液经6 000 r/min离心20 min，取上清液冷冻干燥制得南瓜籽蛋白肽粉末。
1.3.2 南瓜籽蛋白肽的超滤分离
依次采用截留分子质量为10、3 kDa的超滤离心管对南瓜籽蛋白肽进行分离，得到的3个组分分别为A1（小于 3kDa）、A2（3kDa～10kDa）和 A3（大于 10kDa），各组分收集、冻干后测定抗氧化活性。
1.3.3 南瓜籽蛋白肽抗氧化活性的测定
1.3.3.1 DPPH自由基清除率测定
以无水乙醇配制浓度为0.1 mmol/L的DPPH溶液，将DPPH溶液与南瓜籽蛋白肽溶液按3∶1的体积比利用漩涡振荡器混合均匀，于室温下避光反应30 min后在517 nm波长下测定吸光度，每组设定3个平行。DPPH自由基清除率计算公式如下。
式中：A0为空白组（DPPH溶液+蒸馏水）的吸光度；A1为样品组（DPPH溶液+南瓜籽蛋白肽溶液）的吸光度；A10为对照组（无水乙醇+南瓜籽蛋白肽溶液）的吸光度。
1.3.3.2 羟自由基清除率测定
在1 mL南瓜籽蛋白肽溶液中依次加入1 mL 9 mmol/L的FeSO4、1 mL 9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液和1 mL 8.8 mmol/L的H2O2，振荡混合均匀后于37℃下水浴30 min，在510 nm波长下测定吸光度，每组设定3个平行。羟自由基清除率计算公式如下。
式中：A0为空白组（水杨酸+蒸馏水）的吸光度；A1为样品组（水杨酸+南瓜籽蛋白肽溶液）的吸光度；A10为对照组（蒸馏水+南瓜籽蛋白肽溶液）的吸光度。
1.3.4 小鼠的分组及处理
选用SPF级雄性昆明小鼠，共60只。适应性饲喂7 d后，随机分为正常对照组，模型对照组，南瓜籽蛋白肽低、中、高剂量组，每组12只。除正常对照组外其余各组小鼠皮下注射200mg/（kg·d）D-半乳糖以构建衰老模型，正常对照组小鼠每日注射等体积的生理盐水[19]。同时南瓜籽蛋白肽低、中、高剂量组小鼠分别灌胃250、500、1 000 mg/（kg·d）的南瓜籽蛋白肽，正常对照组和模型对照组小鼠每日灌胃等体积的蒸馏水，连续6周，实验期间小鼠自由摄食饮水，每周记录1次小鼠体质量。
1.3.5 小鼠检测样品的采集
小鼠末次灌胃后，禁食、禁水12 h，摘取其眼球取血，采血过程应注意清洁以防止红细胞出现溶血。室温下平衡1 h～2 h后，4℃3 500 r/min条件下离心15 min，取上清液分装，储存于-80℃。
脱颈处死小鼠，解剖取出肝脏、肾脏、心脏，用4℃的生理盐水清洗去除各脏器表面血迹及其他杂质，储存于-80℃。
1.3.6 小鼠脏器系数的测定
取小鼠肝脏、肾脏、心脏，采用电子天平称量质量，按下式计算各脏器组织的脏器系数。
1.3.7 小鼠代谢产物的测定
小鼠血清中代谢产物肌酐、总胆固醇含量的测定按照试剂盒说明书的方法进行。
1.3.8 小鼠血清、肝脏组织生化指标的测定
将肝脏与生理盐水以1∶9的质量比混合，冰水浴条件下在匀浆器中制成匀浆。随后4℃3 500 r/min条件下离心15 min，分离上清液制得小鼠肝脏组织匀浆，储存于-80℃。小鼠血清、肝脏组织匀浆中的T-AOC、SOD活性及肝脏组织匀浆中的MAO活性、Bcl-2含量、Caspase-3活性、组织蛋白含量测定均严格按照试剂盒说明书的方法进行。
1.4 数据统计分析
利用SPSS25对所得数据进行统计分析，结果均以平均值±标准差表示。利用Origin 2021进行图表绘制。
2 结果与分析
2.1 不同分子量南瓜籽蛋白肽的抗氧化活性
南瓜籽蛋白肽经超滤分离得到3个组分，分别为A1（分子量小于 3 kDa）、A2（分子量 3 kDa～10 kDa）、A3（分子量大于10 kDa），南瓜籽蛋白肽混合物为空白对照组。各组分抗氧化活性见图1。
图1 不同分子量南瓜籽蛋白肽的抗氧化活性
Fig.1 Antioxidant activity of pumpkin seed protein peptides with different molecular weights
不同小写字母表示相同指标下组间差异显著（P＜0.05）。
由图1可知，A1组分的DPPH自由基清除率和羟自由基清除率均显著高于其他组分，抗氧化活性最强。相关研究表明，相对于大分子蛋白肽，分子量较小的组分具有更好的抗氧化效果[20]。因此，选择A1组分进行后期小鼠的饲喂。
2.2 南瓜籽蛋白肽对小鼠体质量的影响
南瓜籽蛋白肽对小鼠体质量的影响见表1。
表1 南瓜籽蛋白肽对小鼠体质量的影响
Table 1 Effect of pumpkin seed protein peptides on body weight of mice
注：同行相同小写字母表示差异不显著（P＞0.05）。
时间/d 小鼠体质量/g正常对照组 模型对照组 南瓜籽蛋白肽低剂量组 南瓜籽蛋白肽中剂量组 南瓜籽蛋白肽高剂量组0 32.29±1.14a 32.57±1.05a 32.96±2.84a 32.19±1.60a 33.07±1.12a 7 38.68±1.64a 38.11±1.84a 39.06±1.92a 38.79±2.35a 39.78±1.65a 14 42.25±2.91a 41.51±2.19a 42.74±2.54a 42.68±2.47a 43.12±2.02a 21 44.44±3.09a 43.92±2.47a 46.43±3.16a 44.47±2.57a 46.10±2.37a 28 45.97±3.07a 46.72±2.91a 48.61±3.26a 46.99±2.59a 47.67±2.48a 35 48.01±2.90a 47.99±3.46a 50.14±3.69a 48.08±3.19a 49.45±2.82a 42 49.64±2.95a 49.90±3.42a 51.43±3.94a 49.85±3.74a 51.00±2.96a
体质量作为衡量机体生长的一项指标，常用于反映机体的健康状况[21]。由表1可知，各组小鼠之间的初始体质量无显著差异（P＞0.05）。灌胃42 d后，各组小鼠体质 量增加量分别为 17.35、17.33、18.47、17.66、17.93 g。相同时间点，与正常对照组和模型对照组相比，南瓜籽蛋白肽低、中、高剂量组的体质量差异不显著（P＞0.05），表明南瓜籽蛋白肽对小鼠的生长发育无不良影响。
2.3 南瓜籽蛋白肽对小鼠脏器系数的影响
南瓜籽蛋白肽对小鼠脏器系数的影响见表2。
表2 南瓜籽蛋白肽对小鼠脏器系数的影响
Table 2 Effect of pumpkin seed protein peptides on organ coefficient of mice
注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
心脏系数/（mg/g）正常对照组 38.83±1.73a 14.08±0.79a 5.38±0.30a模型对照组 33.02±1.87c 11.76±0.39c 4.67±0.16b南瓜籽蛋白肽低剂量组 35.92±1.85b 12.80±0.84b 4.89±0.33b南瓜籽蛋白肽中剂量组 36.00±1.49b 13.73±0.77a 5.44±0.27a南瓜籽蛋白肽高剂量组 39.78±2.54a 13.70±0.71a 5.36±0.40a组别 肝脏系数/（mg/g）肾脏系数/（mg/g）
脏器系数可反映实验动物的健康状况，可通过肝脏系数、肾脏系数和心脏系数来判断实验动物的机能变化和衰老情况[22]。由表2可知，与正常对照组相比，模型对照组小鼠的肝脏系数、肾脏系数和心脏系数均呈现显著的下降趋势（P<0.05），表明模型对照组小鼠脏器出现氧化损伤。与模型对照组相比，南瓜籽蛋白肽低、中、高剂量组可不同程度提高小鼠的脏器系数，其中南瓜籽蛋白肽低剂量组心脏系数变化差异不显著（P>0.05），其余各剂量组的各脏器系数均显著提升（P<0.05）。这表明南瓜籽蛋白肽对改善衰老小鼠脏器的氧化损伤有促进作用。
2.4 南瓜籽蛋白肽对小鼠代谢产物的影响
南瓜籽蛋白肽对小鼠代谢产物的影响见表3。
表3 南瓜籽蛋白肽对小鼠代谢产物的影响
Table 3 Effect of pumpkin seed protein peptides on metabolites in mice
注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
组别 肌酐含量/（μmol/L）总胆固醇含量/（mmol/L）正常对照组 25.85±2.97c 2.75±0.40c模型对照组 36.18±3.78a 4.13±0.72a南瓜籽蛋白肽低剂量组 32.13±2.89b 3.59±0.48b南瓜籽蛋白肽中剂量组 30.17±3.66b 3.41±0.58b南瓜籽蛋白肽高剂量组 28.81±3.05bc 3.34±0.30b
由表3可知，与正常对照组相比，模型对照组的肌酐和总胆固醇含量均显著升高（P<0.05）。与模型对照组相比，南瓜籽蛋白肽低、中、高剂量组血清中的肌酐含量分别降低了11.19%、16.61%、20.37%，总胆固醇含量分别降低了13.08%、17.43%、19.13%，差异均达到显著水平（P<0.05）。在衰老状态下小鼠组织器官的损伤会导致其血清中肌酐、总胆固醇含量的升高，而经南瓜籽蛋白肽灌胃给药后肌酐、总胆固醇含量有所降低，表明南瓜籽蛋白肽具有一定的调节代谢功能。
2.5 南瓜籽蛋白肽对小鼠血清、肝脏组织生化指标的影响
各组小鼠血清、肝脏组织各生化指标测定结果如表4和表5所示。
表4 南瓜籽蛋白肽对小鼠血清生化指标的影响
Table 4 Effect of pumpkin seed protein peptides on serum biochemical indices in mice
注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
组别T-AOC/（mmol/L)SOD活性/（U/mL）正常对照组 0.74±0.07a 84.12±6.02a模型对照组 0.45±0.08c 57.45±3.71c南瓜籽蛋白肽低剂量组 0.49±0.08c 76.10±4.69b南瓜籽蛋白肽中剂量组 0.48±0.06c 77.98±7.20ab南瓜籽蛋白肽高剂量组 0.66±0.06b 82.80±5.40ab
表5 南瓜籽蛋白肽对小鼠肝脏组织生化指标的影响
Table 5 Effect of pumpkin seed protein peptides on biochemical indices of liver tissues in mice
注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
组别T-AOC/（μmol/g prot）SOD活性/（U/mg prot）MAO活性/（U/mg prot）Bcl-2含量/（ng/mg prot）Caspase-3活性正常对照组 72.70±9.19a 54.76±4.20a 11.12±0.90c 3.88±0.34a 1.00±0.10c模型对照组 53.56±6.11d 41.03±5.11d 16.83±1.62a 3.02±0.17c 1.34±0.09a南瓜籽蛋白肽低剂量组 55.00±5.70cd 48.22±4.19bc 15.35±1.01b 3.40±0.23b 1.27±0.08ab南瓜籽蛋白肽中剂量组 61.88±3.40bc 43.79±3.47cd 15.01±0.97b 3.43±0.23b 1.24±0.09ab南瓜籽蛋白肽高剂量组 63.06±6.84b 51.06±3.13ab 14.25±1.15b 3.66±0.26ab 1.17±0.13b
由表4、表5可知，与正常对照组相比，模型对照组小鼠血清和肝脏组织中的T-AOC均显著降低（P<0.05）。与模型对照组相比，南瓜籽蛋白肽低、中、高剂量组小鼠血清中T-AOC分别提高了8.89%（P>0.05）、6.67%（P>0.05）、46.67%（P<0.05），肝脏组织中 T-AOC分别提高了 2.69%（P>0.05）、15.53%（P<0.05）、17.73%（P<0.05）。T-AOC是衡量生物体整体抗氧化能力的指标，其水平越高，表明机体的抗氧化能力越强[23]。同时机体的健康、衰老及疾病等也可通过T-AOC的强弱反映[24]。综上表明，经D-半乳糖诱导后的模型对照组小鼠整体抗氧化能力降低，而南瓜籽蛋白肽能够提高衰老小鼠整体的抗氧化水平，从而起到延缓衰老的作用。
由表4、表5可知，与正常对照组相比，模型对照组小鼠的血清和肝脏组织中的SOD活性分别降低了31.70%、25.07%，变化显著（P<0.05）。与模型对照组相比，南瓜籽蛋白肽低、中、高剂量组的小鼠血清中SOD活性分别升高了 32.46%（P<0.05）、35.74%（P<0.05）、44.13%（P<0.05），肝脏组织中SOD活性分别升高了17.52%（P<0.05）、6.73%（P>0.05）、24.45%（P<0.05）。SOD是生物体清除自由基的关键酶，其活性的高低可反映机体抗氧化的能力[25]。研究证明，SOD能清除超氧阴离子自由基，从而保护机体细胞和组织不受自由基损害，延缓机体衰老[26]。灌胃南瓜籽蛋白肽对机体SOD活性的提高有促进作用。
由表5可知，模型对照组小鼠肝脏组织中的MAO活性与正常对照组相比显著升高（P<0.05）。与模型对照组相比，南瓜籽蛋白肽低、中、高剂量组小鼠肝脏组织中MAO活性均呈现显著下降趋势（P<0.05），并且在给药剂量范围内，MAO活性的下降程度与灌胃剂量呈正比。MAO是神经递质降解酶，主要存在于神经胶质细胞内，在神经系统中主要调节单胺类递质的含量，其低活性有利于保持神经系统的正常功能，对机体的抗氧化及抗衰老有促进作用[27-28]。南瓜籽蛋白肽可降低衰老小鼠MAO的活性，抑制衰老。
由表5可知，在肝脏组织匀浆中，与模型对照组相比，南瓜籽蛋白肽低、中、高剂量组Bcl-2含量均显著上升（P<0.05），分别提高了 12.58%、13.58%、21.19%。Bcl-2具有抑制细胞凋亡、延长细胞生存期的作用[29]。Bcl-2的表达可抑制脂质过氧化物的产生和氧自由基的形成，从而抑制衰老。这些结果表明南瓜籽蛋白肽在一定程度上调节相关凋亡因子的表达，且南瓜籽蛋白肽灌胃剂量越高，该作用越明显。
由表5可知，与正常对照组相比，模型对照组小鼠肝脏组织中的Caspase-3活性显著提高（P<0.05）。与模型对照组相比，南瓜籽蛋白肽低、中、高剂量组中Caspase-3活性受到不同程度的抑制，降低幅度分别为5.22%（P>0.05）、7.46%（P>0.05）、12.69%（P<0.05）。Caspase-3为细胞中重要的凋亡执行因子，其活性受Bcl-2的调节，对机体衰老具有加速作用[30-31]。综上表明，南瓜籽蛋白肽对凋亡因子Caspase-3的活性具有一定的抑制功效，进而起到延缓小鼠组织细胞衰老凋亡的作用。
3 结论
本研究制备分离出具有良好抗氧化活性的南瓜籽蛋白肽，并进行小鼠体内实验，通过灌胃南瓜籽蛋白肽改善了衰老模型小鼠脏器系数，降低了代谢产物（肌酐、总胆固醇）含量，提高了衰老模型小鼠的TAOC、SOD活性、Bcl-2含量，降低了MAO、Caspase-3的活性。南瓜籽蛋白肽可能是通过清除机体中过剩自由基，抑制氧化应激反应，调节细胞中凋亡因子的活性从而起到延缓衰老的作用。
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