何首乌为蓼科植物何首乌（Polygonum multiflorum Thunb.）的干燥块根，其性微温，味苦、甘、涩，归肝、心、肾经[1]，为贵州道地药材之一。目前对何首乌的研究主要集中在其肝损伤[2]与小分子成分[3]的研究，对其所含的大分子成分研究较少。抗性淀粉（resistant starch，RS），是指在健康人体小肠中不能被消化但却可在大肠中被微生物分解的淀粉[4]，因其具有更优越于膳食纤维的生理功能和特性，近年来受到广泛关注。经前期研究发现，由何首乌块根制备的何首乌抗性淀粉分子量大，聚合度高，能够自发形成内部体积较大的螺旋腔[5]，对胃肠道酶和pH值的耐受性较高[6]。目前，RS多以高直链玉米淀粉制备，制备工艺复杂且含量较低[7]，在功能性淀粉加工领域，RS纯化工艺的改进以及RS制备的新来源的优选受到持续关注。
研究发现，RS在肠道中不仅为益生菌提供养分，还会抑制致病菌的生长[8]。大肠杆菌又名大肠埃希氏菌（Escherichia coli），为主要的革兰氏阴性致病菌，属于常见的肠道微生物，可引起胃肠道感染、炎症反应等多种疾病，研究表明荞麦抗性淀粉[9]、鹰嘴豆抗性淀粉[10]均具有抑制大肠杆菌的生长，调节肠道微生物群的作用。目前，对RS纯化及其对微生物生长影响的相关研究报道较少。
本研究通过Box-Behnken响应面法优化何首乌RS纯化条件，并选取大肠杆菌为体外微生物试验代表菌株，考察纯化前后RS对致病菌增殖效力的影响，为抗性淀粉应用于调节肠道菌群提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
何首乌（批号：1991001）：北京本草方源药业科技有限公司；何首乌淀粉（经检测淀粉含量>90%）：贵州中医药大学第一附属医院制剂研发中心实验室自制；普鲁兰酶（≥1 000 npun/g）、糖化酶（10万 U/mL）、葡萄糖：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；耐高温α-淀粉酶（40 000 U/g）：北京索莱宝科技有限公司；LB培养基：青岛海博生物技术有限公司；大肠杆菌：北京百欧博伟生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
PHS-3C pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；AL204电子天平：梅特勒-托利多公司；FD冷冻干燥机：上海拓纷机械设备有限公司；LMQ.C-50E高压灭菌器：山东新华医疗器械股份有限公司；BSC-1004ⅡA2超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；MJ-250恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；UV-6000PC紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司；Quanta 250 FEG扫描电镜：美国FEI公司。
1.3 方法
1.3.1 何首乌RS的制备
采用热压-酶法制备何首乌RS[5]。配制浓度为20%何首乌淀粉液，调节pH值为4.3，预糊化后121℃高压20 min，降至室温后加入普鲁兰酶（30 npun/g）60℃酶解12 h，酶解结束后100℃水浴30 min使酶失活，4℃老化24 h，冷冻干燥后用于后续试验。
1.3.2 RS的含量测定
采用耐高温型α-淀粉酶法[11]测定。取1 g样品用淀粉酶与糖化酶酶解后，离心弃上清，沉淀以2 mol/L KOH溶解后，HCl调pH值至中性，糖化酶酶解其中的还原糖，离心收集上清，用3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitros－alicylic acid，DNS）法测定其中还原糖的含量，抗性淀粉含量即还原糖含量乘以0.9。
1.3.3 纯化RS单因素考察
1.3.3.1 不同淀粉乳浓度对RS含量的影响
精密称取1.3.1制备的何首乌RS，配制淀粉乳浓度分别为5%、10%、15%、20%、25%的淀粉液，加入耐高温α-淀粉酶20 U/g，100℃酶解40 min，离心弃上清液，洗涤沉淀2次，冷冻干燥并对其进行含量测定。
1.3.3.2 不同酶添加量对RS含量的影响
精密称取1.3.1制备的RS，配制淀粉乳浓度为15%的淀粉液，加入耐高温 α-淀粉酶（10、15、20、25、30 U/g），100℃酶解40 min，离心弃上清液，洗涤沉淀2次，冷冻干燥并对其进行含量测定。
1.3.3.3 不同酶解时间对RS含量的影响
精密称取1.3.1制备的RS，配制淀粉乳浓度为15%的淀粉液，加入耐高温α-淀粉酶20 U/g，100℃分别酶解 20、30、40、50、60 min，离心弃上清液，洗涤沉淀2次，冷冻干燥并对其进行含量测定。
1.3.4 RS纯化条件的响应面试验设计
为选择最佳试验条件，以A淀粉乳浓度、B酶添加量、C酶解时间为独立变量，RS含量为响应变量，采用Design Export 8.0.6的Box-Behnken响应面法[12]优化纯化过程。每组平行3次，响应面试验因素和水平见表1。
表1 响应面优化试验因素水平
Table 1 Factors and levels of response surface optimization
水平 因素A淀粉乳浓度/%B酶添加量/（U/g）C酶解时间/min-1 10 15 30 0 15 20 40 1 20 25 50
1.3.5 碘结合曲线及平均聚合度测定
参照文献[13]的方法测定，称取样品20 mg，用无水乙醇润湿，吸取1 mL 2 mol/L KOH溶解样品。调节溶液pH值至中性，用去离子水定容50 mL。取10 mL定容液与2 mL碘试液混合，用去离子水定容100 mL。用紫外分光光度计于波长500 nm～800 nm全波长扫描样液，测定最大吸收峰（λmax）。根据 Banks公式（1）计算平均聚合度（degree polymerization，DP）。
1.3.6 颗粒形貌观察
取少量样品用导电双面胶固定在扫描电镜的样品台上，在真空条件下进行喷金处理，经过短暂干燥后，用扫描电子显微镜观察拍摄具有代表性的样品颗粒形貌。1.3.7 RS对大肠杆菌增殖的影响
1.3.7.1 培养基配制
试验培养基选用LB培养基[14]，以不同浓度0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、8.0%的RS为碳源配制，以葡萄糖作为阳性碳源，不加碳源的培养基作为对照。
1.3.7.2 不同RS浓度对大肠杆菌增殖效力的考察
取50 mL的锥形瓶，每瓶配制25 mL纯化后RS培养基，碳源浓度分别为0%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、8.0%，121℃灭菌15 min，冷却至室温，每瓶加入0.2 mL活化后的大肠杆菌悬液（3.5×104cfu/mL），37℃培养24 h后，吸取一定体积的培养液进行菌落计数，同时测定培养液pH值，试验重复3次。
1.3.7.3 不同碳源对大肠杆菌增殖过程的影响
取50 mL的锥形瓶，根据1.3.7.2大肠杆菌增殖结果，选择增殖效果最明显的碳源浓度配制试验培养基，每瓶25 mL，121℃灭菌15 min。取活化后的大肠杆菌菌悬液0.2 mL大肠杆菌悬液（1×103cfu/mL）分别接种到不同碳源的培养基中，37℃培养48 h。在不同的时间点（0、6、9、12、24、30、36、48 h） 吸取一定体积的培养液进行菌落计数，同时测定培养液的pH值。以葡萄糖作为阳性碳源，不加碳源的培养基作为对照，试验重复3次。
1.4 数据处理
试验结果用平均值±标准差表示，使用Design Expert 8.0.6进行响应面试验数据优化；使用origin 2018绘图。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
单因素试验结果如图1所示。
图1 各单因素对RS含量的影响
Fig.1 Effects of single factors on RS content
A.淀粉乳浓度；B.酶添加量；C.酶解时间。
由图1A可知，随淀粉乳浓度的增大，RS含量呈现先增后减的趋势，在淀粉乳浓度为15%时，纯化所得RS的含量最高。推测适宜的淀粉乳浓度有利于酶解反应的高效进行，在酶添加量一定的条件下，当淀粉乳浓度较低时，溶液中分子扩散接触作用迅速且酶量充足，酶解作用强，而当淀粉乳浓度过高时，可能由于酶量不足或产生底物抑制[15]，反而使得酶解作用逐渐减弱。因此不同淀粉乳浓度之间具有明显差异，综合考虑选取淀粉乳浓度10%～20%进行响应面法优化试验。
由图1B可知，随着酶添加量的增多，RS含量呈现先增大后略减小的趋势，在酶添加量为20 U/g，纯化所得RS的含量最高。耐高温α-淀粉酶纯化RS时，同时也可以除去其中的可溶性淀粉，这是RS含量提高的重要原因之一。纯化所用耐高温α-淀粉酶可使淀粉分子链断裂，适宜链长的淀粉分子更有利于形成RS[16]，当酶添加量过多时，分子运动比较强烈，并使得分子链过短，扩散速度也较大，因此较难聚集使得RS含量降低。因此不同酶添加量之间具有明显差异，综合考虑选取酶添加量15 U/g～25 U/g进行响应面法优化试验。
由图1C可知，随着酶解时间的延长，RS含量呈现先增加后趋于平缓的趋势，在酶解时间为40 min时RS含量相对稳定。由此可得，当酶解时间在40 min之内时，RS含量随着酶解时间的延长而增大；当酶解时间大于40 min时，由于底物量固定，酶解完全，使得其结果逐渐趋于恒定。因此不同酶解时间之间具有明显差异，综合考虑选取酶解时间30 min～50 min进行响应面法优化试验。
2.2 响应面分析RS纯化工艺试验结果
2.2.1 响应面法优化试验设计及结果
每组样品平行测定3次，取平均值，进行统计分析。Design Expert 8.0.6软件进行响应面设计及结果分析。结果如表2所示。
表2 响应面试验方案与结果
Table 2 Response surface test scheme and results
试验号 A淀粉乳浓度 B酶添加量 C酶解时间 RS含量/%1-1 -1 0 17.93 2 1-1 0 26.17 3-1 1 0 29.65 4 1 1 0 33.86 5-1 0 -1 17.57 6 1 0-1 21.73 7-1 0 1 21.96 8 1 0 1 31.66-1 -1 22.15 10 0 1 -1 22.71 11 0 -1 1 23.80 12 0 1 1 33.86 13 0 0 0 43.10 14 0 0 0 41.66 15 0 0 0 43.89 16 0 0 0 41.21 17 0 0 0 40.80 9 0
由表2可知，得拟合方程：Y=42.13+3.29A+3.75B+3.39C-1.01AB+1.39AC+2.37BC-8.81A2-6.41B2-10.09C2。
2.2.2 方差分析结果
响应面试验方差分析见表3。
表3 响应面试验方差分析
Table 3 Response surface test variance analysis
注：**表示具有极显著差异，P<0.01。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 1 358.7 9 150.97 61.91 <0.000 1 **A淀粉乳浓度 86.53 1 86.53 35.48 0.000 6 **B酶添加量 112.73 1 112.73 46.23 0.000 3 **C酶解时间 91.94 1 91.94 37.7 0.000 5 **AB 4.06 1 4.06 1.67 0.237 9 AC 7.67 1 7.67 3.15 0.119 4 BC 22.56 1 22.56 9.25 0.018 8 **A2 327.16 1 327.16 134.16<0.000 1 **B2 173.26 1 173.26 71.05 <0.000 1 **C2 428.43 1 428.43 175.69<0.000 1 **残差 17.07 7 2.44失拟项 10.2 3 3.4 1.98 0.259 6纯误差 6.87 4 1.72总和 1 375.77 16
如表3所示，模型F=61.91，P<0.01，说明此回归模型是极显著的。方程失拟项F=1.98，P>0.05，失拟项相对于纯误差影响不显著，说明回归模型与实测值拟合度较好，适用性高，可以使用该回归方程代替试验真实点分析试验结果。各因素的影响大小：淀粉乳浓度<酶解时间<酶添加量。通过F检验来判定，概率P（F>Fα）的值越小，则相应变量的显著程度越高，对试验指标的影响越大，A、B、C的P值均小于0.01，说明淀粉乳浓度、酶解时间、酶添加量对RS含量的影响极显著。R2=0.987 6，R2Adj=0.971 6，表示所建立的模型能够很好地反映独立变量和响应变量之间的关系。
2.2.3 因素交互作用
利用Design Expert8.0.6，根据回归方程，生成等高线和响应面图，并考察拟合响应曲面的形状，分析淀粉乳浓度、酶解时间、酶添加量对RS含量的影响，结果见图2～图4。
图2 淀粉乳浓度与酶添加量相互作用的等高线图与响应面图
Fig.2 Contour diagram and response surface diagram of interaction between starch milk concentration and enzyme dosage level
图3 淀粉乳浓度与酶解时间相互作用的等高线图与响应面图
Fig.3 Contour diagram and response surface diagram of interaction between starch milk concentration and enzymatic hydrolysis time
图4 酶解时间与酶添加量相互作用的等高线图与响应面图
Fig.4 Contour diagram and response surface diagram of interaction between enzymatic hydrolysis time and enzyme dosage level
从图2～图4可见，3个因素在所选范围内存在极值，即等高线中最小椭圆的中心点。结果表明，BC交互作用显著，与F值结果一致。
2.2.4 验证试验
经软件分析，该模型得到的最优条件：淀粉乳浓度15.93%、酶添加量21.59 U/g、酶解时间42.19 min，预测RS含量理论值为43.404 6%。考虑到实际操作的可能性，将试验条件修正为淀粉乳浓度16%、酶添加量22 U/g、酶解时间42 min。在该修正条件下进行3次重复试验，RS含量平均为（43.23±0.26）%，接近理论值。表明该数学模型可用于RS纯化过程。
2.3 RS碘结合曲线
碘吸收曲线见图5。
图5 碘吸收曲线
Fig.5 Iodine absorption curve
淀粉和碘相互作用可引起特有的颜色反应[17]，是影响淀粉结构和功能的重要因素。直链淀粉与碘结合，在范德华力的作用下碘分子进入直链淀粉的螺旋结构中，形成稳定的蓝色复合物[18]，并且最大吸收峰在600 nm～640 nm；支链淀粉由于其分支状况的不同，与碘结合生成紫红色复合物，最大吸收峰在520 nm～560 nm[19]。淀粉-碘复合物的颜色越深，碘结合能力越强，最大吸收波长、吸收峰的范围和吸光值变化可作为分析淀粉中直/支链比例以及分子量的大小的重要依据之一。如图5所示，何首乌RS及纯化后RS的最大吸收峰分别是在598、561 nm，由直链淀粉处向支链淀粉处偏移，充分说明何首乌RS是由直链淀粉和支链淀粉构成的混合物。纯化后RS的吸光度远远大于何首乌RS，表明纯化后RS且具有更强的碘结合能力；纯化后RS-碘络合物的吸收峰比何首乌RS的窄，表明纯化后RS的分子量分布比较集中，该纯化工艺对RS纯化效果较好。
2.4 平均聚合度（DP）分析
不同样品的平均聚合度见表4。
表4 不同样品的平均聚合度
Table 4 Average degree of polymerization of different samples
不同RS含量17.93%21.73%26.17%33.86%43.89%平均聚合度125.58 91.72 87.35 80.06 69.42 62.38 47.03淀粉类型 何首乌淀粉何首乌RS
RS的形成是由靠近分子链的末端区域相互缠绕发生双螺旋结构，并使原来杂乱无章的淀粉分子链进一步延伸，延伸的分子链再发生折叠卷曲，更有利于分子上的羟基相互作用形成螺旋之间的氢键，从而形成紧密的螺旋与螺旋的聚集体，形成抗酶解的结晶区。RS的DP关系到抗性淀粉的形成及含量，DP过低淀粉链过短无法形成螺旋结构[20]，研究表明DP>20更利于双螺旋与结晶区的形成[21]。热压-酶法制备的何首乌RS与纯化后的RS分子的平均聚合度分别为91.72和47.03，纯化后RS的DP明显减小，也证实了何首乌RS在酶解纯化过程中发生降解，纯化过程中形成了聚合度较小的分子链，提供了许多容易形成双螺旋结构的链端，分子自由移动能力增加，进而更易组成的稳定双螺旋结构，提高RS含量并使得使整个淀粉分子处于有序状态。
2.5 颗粒形貌观察
扫描电镜图见图6。
图6 样品扫描电镜图
Fig.6 Scanning electron microscopy of samples
A.何首乌淀粉（20 000×）；B.何首乌 RS（20 000×）；C.纯化后 RS（20 000×）；D.纯化后 RS（50 000×）。
由图6可以看出何首乌RS与纯化后RS样品均为冷冻干燥制备，样品呈层片状，形态保存较好[22]。何首乌淀粉颗粒呈不规则圆球形，大小不一，表面比较光滑平整，由于何首乌RS是热压-酶法处理法制备而成的，从扫描电镜图可见其颗粒形状已经被破坏，大部分已经呈现层片的形状，淀粉在糊化过程中吸水膨胀破裂，破坏了原有结构，并在回生阶段直链淀粉分子依靠氢键和范德华力重新聚集形成了结构较为紧密稳定的新晶体[23]。经纯化后的RS粉颗粒均呈现多孔结构，纯化所用耐高温α-淀粉酶能使淀粉分子片段减小，从而增大了其可酶解成分与淀粉酶的接触面积，可能是纯化效果较好的原因之一，纯化过程使小分子糖与可消化淀粉被去除[19]，使得抗性淀粉结晶区暴露出来。由于淀粉酶的作用，纯化后RS表面出现凹陷[24]，淀粉酶仅在非结晶区水解支链淀粉，充分显示了抗性淀粉的紧密结构[25]，这些观察结果与有关莲子淀粉的报道一致。
2.6 RS对大肠杆菌增殖的影响
2.6.1 不同RS浓度对大肠杆菌增殖效力的考察
培养液中不同RS浓度对大肠杆菌菌落数及培养液pH值的影响如图7所示。
图7 培养液中不同RS浓度对大肠杆菌增殖的影响
Fig.7 Effect of RS concentration on the proliferation of Escherichia coli in culture medium
A.大肠杆菌菌落数变化；B.培养液pH值变化。
纯化后RS对大肠杆菌的增殖存在最大增殖量浓度，由图7A可看出，当RS浓度为2.0%时，为菌落数最高值，碳源浓度继续增加，菌落数出现下降趋势，这可能是由于过高浓度的碳源影响了培养基渗透压[26]，渗透压过高不利于使大肠杆菌增殖，或是大肠杆菌在大量增殖过程中产生的代谢产物影响了自身的生长。培养液pH值变化也是反应细菌生长情况的指标之一，大肠杆菌生长产酸[27]，使得培养液pH值降低，由图7B可看出，当RS浓度为2.0%时，培养液pH值最低，即培养液中菌落数最多，培养液pH值结果与菌落数变化趋势一致，由此得出不同碳源浓度对大肠杆菌的增殖作用有一定影响，且过高浓度的碳源并不利于大肠杆菌的生长。
2.6.2 不同碳源对大肠杆菌增殖过程的影响
不同碳源对大肠杆菌菌落数及培养液pH值的影响如图8所示。
图8 不同碳源对大肠杆菌增殖的影响
Fig.8 Effects of different carbon sources on the proliferation of Escherichia coli
A.不同碳源对大肠杆菌菌落数变化；B.不同碳源对培养液pH值变化。
由图8可看出，6 h内处于细菌的生长延迟期，细菌总数变化不大，但可以看出葡萄糖组的生长延迟期较RS组明显减短。6 h后细菌进入对数生长期，葡萄糖组对大肠杆菌的增殖能力最强，纯化后RS组在对数生长期的菌落数比何首乌RS组明显减少，说明纯化后RS能显著降低细菌增殖能力。30 h后细菌进入生长稳定期，细菌生长速率下降，死亡率上升，且纯化后RS组较其他组提前进入细菌衰亡期，菌落数明显下降，培养液pH值与菌体数变化趋势一致，由此得出何首乌RS可明显降低大肠杆菌的增殖速率，且纯化后RS的作用更为明显。发酵底物在被消化分解后，才可以被细菌利用，底物的分解速度越快，发酵速度就会越快[28]。RS包含大量的直链淀粉和少量的支链淀粉，微生物降解后部分低聚物不能直接被细菌利用需进一步需要分解为更小的碎片。研究结果表明RS发酵速度较慢，是因为其复杂的序列结构和双螺旋特性[29]，RS特有的结晶区不利于细菌分解[30]，纯化后RS结晶区明显增加，影响细菌与底物的结合能力，导致发酵动力学减慢。功能性淀粉对细菌降解具有更强的抵抗力[31-32]，不利于细菌的增殖生长，进而RS组在对数生长期菌落数明显低于葡萄糖组。大肠杆菌能够发酵碳水化合物产生乙酸、甲酸和乳酸，并且在氢解酶系统裂解二氧化碳和氢[33]，因此造成了发酵液在后期pH值有所下降，而当培养基中酸性物质到一定含量时会对大肠杆菌增殖产生抑制作用，这也是大肠杆菌在生长后期菌落数下降的原因之一。
3 结论
抗性淀粉作为一种新型食品添加物，具有高膳食纤维含量、低热量的功能。本研究采用单因素结合响应面法优化RS纯化工艺结果表明，在淀粉乳浓度16%、酶添加量22 U/g、酶解时间42 min条件下纯化RS，含量为（43.23±0.26）%，高温酶解法可以用于 RS纯化。同时对其理化特性进行了研究，碘结合曲线表明，何首乌RS是由直链淀粉和部分支链淀粉组成，且纯化后RS碘结合能力明显提高。何首乌RS的DP值为91.72，纯化后RS的DP值为47.03，DP值的降低表明直链淀粉分子链减小而集中，RS含量提高。扫描电镜显示纯化后RS呈现多孔状。体外微生物试验结果显示，RS对抑制大肠杆菌增殖具有良好的效果，何首乌RS及纯化后RS对大肠杆菌的增殖效力均低于葡萄糖，且纯化后RS对大肠杆菌增殖的影响更为显著。相比于原抗性淀粉，酶法纯化工艺在降低酶使用量及确保安全健康的基础上大大提高了其纯度，为制备高纯度抗性淀粉提供了基础方法，有利于抗性淀粉制备研究的继续进行，也为何首乌RS作为功能性淀粉的开发潜力奠定了一定的基础。
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