雪松[Cedrus deodara（Roxb.）Loud]又称喜马拉雅雪松、喜马拉雅杉、香柏，为松科（Pinaceae）雪松属（Cedrus）树种的泛称[1]。据文献记载，雪松具有清热利湿、散瘀止血的功效[2]，常被民间用于治疗抽搐、发烧、咳嗽、支气管炎、溃疡和肺结核等疾病[3]。雪松树皮也可作为治疗炎症、关节疼痛和皮肤病常用药[4]。现代药理学研究表明，以儿茶素、没食子酸、木脂素、雪松醇、雪松烯为主的雪松活性组分有显著的抗炎、镇痛、抗高血糖、抗溃疡、抗痉挛、抗菌、抗癌等活性[5-6]。
随着科技日益发展，以具有活性的天然产品的替代疗法在非器质性病变的疾病缓解治疗中应用广泛[7]。雪松精油是由雪松的木质部提取得到的无色透明或黄色油状液体，有似檀香的木质香，常用于解痉镇痛、缓解焦虑[8-10]。国内流通的雪松精油多为大西洋雪松（Cedrus atlantica）所产[11]。目前对雪松的研究主要局限于雪松松针及花序的挥发性成分研究，尚缺乏对雪松精油成分分析及生理活性的报道[12]。因此，本研究拟采用气相色谱-质谱联用（gas chromatograph-mass specrometer，GC-MS）技术对大西洋雪松精油的化学成分进行分析，并测试其体外抗菌、抗炎等生理活性，以期为雪松精油的合理利用及推广提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大西洋雪松精油：英国Aroma zone 公司；正己烷：天津市风船化学试剂科技有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、沙氏琼脂培养基、青链霉素、0.25%胰蛋白酶、MTT 溶液：北京索莱宝科技有限公司；RPMI-1640 培养基、胎牛血清、Trizol 液、iScript cDNA 合成试剂：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）：上海源叶生物科技有限公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）：武汉普诺赞生命有限公司；生理盐水：贵州天地药业责任有限公司；硫酸庆大霉素：国药荣生制药有限公司；克霉唑：白云山何济公制药厂；营养琼脂培养基：北京陆桥技术股份有限公司；小鼠细胞上清肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）：南京建成生物科技有限公司；RNA-easy Isolation Reagent 裂解液、逆转录试剂盒、sybr qPCR Ma-ster Mix：南京诺唯赞生物科技股份有限公司；试剂均为分析纯。
1.2 仪器
HP7890A/5975C 型GC-MS 联用仪：美国Agilent Technologies 公司；SW-CJ-2FD 型双人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司；HF160W 型水套式二氧化碳培养箱：上海力申科学仪器有限公司；GHP-9160 型隔水式恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；201 型奥地利安图斯2010 酶标仪：奥地利安图斯公司；qPCR仪器：美国Applied Biosystems Quant Studio 公司；BSA -124S 型精密分析天平：赛多利斯科学仪器有限公司；Gentier 96E 核酸检测仪：上海双旭电子有限公司。
1.3 菌株及细胞株
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC-6538）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli，ATCC8739）、白色念珠菌（Candida albicans，ATCC10231）：上海保藏生物技术中心；RAW264.7 细胞株：中国科学院昆明动物研究所。
1.4 菌悬液的配制
无菌条件下，用接种环挑取待测菌种1～2 个单个菌落，制成菌悬液，并与0.5 麦氏比浊液比浊（约含菌1.5×108 CFU/mL）备用。
1.5 GC-MS 供试品的制备
精确称取大西洋雪松精油各20.0 mg，加正己烷溶解，配制成浓度为20.0 mg/mL 的供试品溶液，用孔径为0.22 μm 的聚醚砜针式过滤器过滤后直接进样。
1.6 方法
1.6.1 GC-MS 分析条件
色谱柱为Agilent 气相色谱柱（HP-5MS，30 m×250 μm×0.25 μm）；载气为高纯氦气；柱箱升温程序为起始柱温为57 ℃，保留1 min；程序升温10 ℃/min 至112 ℃；1 ℃/min 至140 ℃；5 ℃/min 至160 ℃；15 ℃/min至220 ℃；220 ℃后运行3 min；进样量0.2 μL，以分流比10 ∶1（体积比）分流进样；柱流量1.0 mL/min；电子轰击离子源，离子源温度230 ℃，电离能量70 eV，质量扫描范围为m/z 12～550。
1.6.2 抑菌试验
采用牛津杯扩散法进行抑菌试验[13]。在琼脂培养基表面均匀地涂布细菌或真菌溶液，再将灭菌后的牛津杯平放至培养皿内，每个皿中放3 个。配制不同浓度的硫酸庆大霉素溶液和克霉唑溶液为阳性对照组，以无菌生理盐水为阴性对照组。每个培养皿分别给以不同浓度的硫酸庆大霉素溶液、克霉唑溶液及大西洋雪松精油各200 μL。金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌于37 ℃培养箱中孵育18 h ～24 h，白色念珠菌27 ℃培养箱中孵育48 h～72 h。试验结束后，用游标卡尺十字交叉法测量抑菌圈直径，每组设3 个平行试验，结果取平均值。牛津杯抑菌直径敏感性判断标准为极敏：直径＞20 mm；高敏：15 mm＜直径≤20 mm；中敏：10 mm≤直径≤15 mm；低敏：直径＜10 mm。
1.6.3 抗炎试验
1.6.3.1 细胞培养与传代
RAW264.7 细胞复苏后，采用添加1.0%青链霉素及含有10.0%胎牛血清的RPMI-1640 培养基，于37 ℃、5.0%CO2 饱和湿度的培养箱中培养，细胞融合度达到80.0%时，用0.25%胰蛋白酶消化后进行传代，传代比例为1 ∶3。
1.6.3.2 大西洋雪松精油对细胞活性的影响
取对数生长期的RAW264.7 细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后，用RPMI-1640 培养基重悬，以1×104 个/孔接种于96 孔板中，培养24 h 后，设置正常组（PBS，有细胞）、空白组（无细胞）、试验组（有细胞）[添加不同浓度的大西洋雪松精油（30、60、120、240、480 μg/mL）]，每组设置3 个复孔。正常组加入含PBS 的完全培养基100 μL，空白组均加入完全培养基100 μL，各试验组加入含相应雪松精油的完全培养基100 μL，培养48 h后，弃去上清液，每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，继续孵育4 h，加入150 μL DMSO 后，使用酶标仪于490 nm 波长处测定各孔的OD 值，计算存活率[14]。
1.6.3.3 大西洋雪松精油对LPS 诱导RAW264.7 细胞释放炎症因子的影响
取对数生长期的RAW264.7 细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，用完全培养基重悬细胞，以1×104 个/孔接种于96 孔板中，每孔加入细胞悬液90 μL，将细胞随机分为对照组（PBS）、模型组（LPS）、试验组（LPS+不同浓度雪松精油），每组设置6 个复孔，放置培养箱培养24 h 后，除对照组外，其余各组均加入浓度为10 μg/mL LPS 刺激4 h 后，对照组和模型组给予PBS 缓冲溶液10 μL，试验组分别给予浓度为7.5、15.0、30.0 μg/mL 的雪松精油各10 μL，培养24 h 后，收集细胞上清液采用酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[15]检测TNF-α 的含量，根据试剂盒说明书进行操作。收集下层细胞，用Trizol 液提取各组待检测细胞的总RNA，用核酸检测仪检测RNA 的完整性和质量。使用iScript cDNA 合成试剂快速将提取的RNA 逆转录为cDNA。将cDNA+引物+sybr qPCR Master Mix 共同加入8 连管制成20 μL 溶液。实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（real time quantitative poymerase chain reaction，qPCR）条件为94 ℃预变性15 min，94 ℃变性30 s，72 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，变性退火延伸40 个循环，72 ℃末端延伸5 min，16 ℃降温2 min。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列：TNF-α，F，5’-AATGGCCTCCCTCTCATCAGTT-3’；R5’-CGAATTTTGAGAAGATGATCTGAGTGT-3’；iNOS，F，5’-CCACCTTGGAGTTCACCCAGTTG-3’；R5’-GCAAGACCAGAGGCAGCACATC-3’A；GAPDH，F，5’-ATACGGCTACAGCAACAGGG-3’，R5’-GCCTCTCTTGCTCAGTGTCC-3’A。
1.7 数据处理
通过GC-MS 对大西洋雪松精油进行定性和相对定量分析。其中定量过程采用峰面积归一化法[16]计算各组分的相对含量；定性过程利用计算机检索NIST11.L标准谱库对各组分的质谱数据进行检索[17]，并结合相关文献查阅确定其化学结构式。本文仅对相似度达80%以上组分进行探讨。有效数据使用SPSS 22.0 分析软件进行统计学处理，以平均值±标准差表示，符合正态分布的数据采用One-way ANOVA 分析。P＜0.05 及P＜0.01 为结果存在统计学差异，根据数据处理结果，使用GraphPad Prism5 软件制图。
2 结果与分析
2.1 大西洋雪松精油的分析与鉴定
大西洋雪松精油的总离子流图见图1。
图1 大西洋雪松精油成分总离子流图
Fig.1 Total ion flow diagram of components in essential oils from Cedrus atlantica
所得各组分的相对百分含量采用峰面积归一化法计算，分析结果见表1。
表1 大西洋雪松精油化学成分分析
Table 1 Chemical component analysis of essential oils from Cedrus atlantica
序号 保留时间/min 化合物 化学式 CAS 号 相对含量/%1 6.797 4-乙酰基-1-甲基-1-环己烯 C9H14O 006090-09-1 0.99 2 14.674 1，3-二甲基茚满 C13H19BO 004175-53-5 1.17 3 15.374 α-古巴烯 C15H24 003856-25-5 0.88 4 15.541 长叶烯 C15H24 000475-20-7 0.73 5 16.574 3，5，5，9-四甲基-5，6，7，8，9，9a-六氢-1H-苯并[a]环庚烯 C15H24 060909-27-5 0.66 6 17.840 （+）-长叶环烯 C15H24 001137-12-8 20.29 7 18.951 8，9-脱氢新异叶长烯 C15H22 067517-14-0 0.62 8 19.463 （-）-α-古芸烯 C15H24 000489-40-7 12.90 9 19.618 α-雪松烯 C15H24 000469-61-4 2.89 10 21.007 （+）-香橙烯 C15H24 000489-39-4 31.56 11 22.318 δ-杜松烯 C15H24 000483-76-1 4.20 12 22.54 3a-甲基-3，3a、4，5-四氢-2H-环戊二烯并[a]萘-3-醇 C14H16O 071805-91-9 2.03 13 23.151 1，1，2，2，3，3，-六甲基茚满 C15H22 091324-94-6 0.66 14 23.506 A-二去氢菖蒲烯 C15H20 021391-99-1 1.08 15 27.073 [1R-（1α，3aβ，4α，8aβ，9S*）-十氢-1，5，5，8a-四甲基-1，4-甲烷七氮烯-9-醇 C15H26O 000465-24-7 0.38 16 29.650 1，2，3，4，4a，7-六氢-1，6-二甲基-4-（1-甲基乙基）-萘 C15H24 016728-99-7 0.88 17 32.016 （+）-白千层醇 C15H26O 000552-02-3 1.03 18 38.793 乙基-四甲基环戊二烯 C11H18 057693-77-3 4.63
由图1 和表1 可知，大西洋雪松精油中共检出30个峰，鉴定出18 种化合物，占总峰面积的87.58%；其中萜烯类化合物占83.26%。检出化合物中含量较高的物质为（+）-香橙烯（31.56%）、长叶环烯（20.29%）、（-）-α-古芸烯（12.90%）、乙基-四甲基环戊二烯（4.63%）、δ-杜松烯（4.20%）、α-雪松烯（2.89%）、3a-甲基-3，3a、4，5-四氢-2H-环戊二烯并[a]萘-3-醇（2.03%）。
大西洋雪松精油中可鉴别的化学结构式见图2。
图2 大西洋雪松精油中可鉴别的化学结构式
Fig.2 Identifiable chemical structure of essential oils from Cedrus atlantica
2.2 大西洋雪松精油的体外抑菌活性
大西洋雪松精油对供试菌株的抑菌活性分析见表2。
表2 大西洋雪松精油对供试菌株的抑菌活性分析
Table 2 Antibacterial activity of essential oils from Cedrus atlantica
注：-表示未进行此项试验；#表示中敏；##表示高敏；###表示极敏。
组别 浓度/（μg/mL）抑菌圈直径/mm金黄色葡萄球菌大肠埃希式菌 白色念珠菌硫酸庆大霉素 80 30.12±0.32### 26.23±0.64### -40 27.62±0.33### 23.48±0.78### -20 24.98±0.51### 20.31±0.44### -10 19.45±0.23## 15.93±0.28## -5 12.31±0.20# 11.47±0.25# -克霉唑 100 - - 20.56±0.20###50 - - 19.90±0.51##25 - - 16.56±0.32##12.5 - - 13.16±0.78#6.25 - - 10.18±0.44#大西洋雪松精油 - 10.40±1.40# 9.44±0.45 9.78±0.52生理盐水 - 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00
由表2 可知，大西洋雪松精油对金黄色葡萄球菌（[10.40±1.40）mm]、大肠埃希菌（[9.44±0.45）mm]、白色念珠菌（[9.78±0.52）mm]均有一定的抑菌作用，但仅对金黄色葡萄球菌的抑制效果达到中度敏感，对另外两株供试菌的抑菌效果均为低度敏感。
2.3 大西洋雪松精油对RAW264.7 细胞活性的影响
大西洋雪松精油对RAW264.7 细胞活性的作用结果见图3。
图3 大西洋雪松精油对RAW264.7 细胞存活率的影响
Fig.3 Effect of essential oils from Cedrus atlantica on the survival rate of RAW264.7 cells
由图3 可知，大西洋雪松浓度高于120 μg/mL 后会显著抑制RAW264.7 细胞的增殖活性，因此低于60 μg/mL 浓度的给药剂量相对安全。
2.4 大西洋雪松精油对LPS 诱导RAW264.7 细胞炎症的影响
大西洋雪松精油对LPS 诱导RAW264.7 细胞炎症的影响见图4～图6。
图4 大西洋雪松精油对LPS 诱导RAW264.7 细胞释放TNF-α的影响
Fig.4 Effect of essential oils from Cedrus atlantica on the release of TNF-α in RAW264.7 cells induced by LPS
图5 大西洋雪松精油对LPS 诱导RAW264.7 细胞TNF-α mRNA 表达量的影响
Fig.5 Effect of essential oils from Cedrus atlantica on the expression of TNF-α mRNA in RAW264.7 cells induced by LPS
图6 大西洋雪松精油对LPS 诱导RAW264.7 细胞iNOS mRNA表达量的影响
Fig.6 Effect of essential oils from Cedrus atlantica on the expression of iNOS mRNA in RAW264.7 cells induced by LPS
由图4～图6 可知，与对照组比较，模型组上清液中TNF-α 含量和细胞中TNF-α、iNOS mRNA 表达量均极显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，大西洋雪松精油中、高剂量组TNF-α 的分泌水平和高剂量组TNF-α mRNA 表达量明显上升（P＜0.05 或P＜0.01），而各剂量组的iNOS mRNA 表达量呈剂量依赖性降低（P＜0.01）。
3 讨论与结论
根据文献报道，雪松醇属于倍半萜烯醇，具有广泛的药理特性，包括镇静、抗菌、抗炎和细胞毒性活性，同时具有淡淡的木香，是一种安全的香料，可作为调味剂或佐剂，并已普遍用作化妆品、食品和药品中的调味成分[18]。此外，长叶环烯、（-）-α-古芸烯、δ-杜松烯、（+）-α-长叶蒎烯、顺罗汉柏烯等成分具有一定的抗菌和抗氧化活性，可用于化妆品和口腔卫生用品的防腐剂和抗菌剂，以及天然药物的制备[19-20]。TNF-α 是由巨噬细胞分泌的促进炎症反应的关键细胞因子，可以诱导其自身及周围细胞损伤，形成促进炎症反应的“正反馈”，导致炎症加重[21]。而作为炎症反应中的重要信号传递分子，NO 由活化巨噬细胞的iNOS 基因异常表达产生。当LPS 刺激巨噬细胞时iNOS mRNA 表达上调，产生大量NO 与过氧阴离子氧化形成氧化亚硝酸盐，引起组织损伤。
本研究通过GC-MS 检测到大西洋雪松精油的主要成分为（+）-香橙烯（31.56%）、长叶环烯（20.29%）、（-）-α-古芸烯（12.90%）、乙基-四甲基环戊二烯（4.63%）、δ-杜松烯（4.20%）、α-雪松烯（2.89%）、3a-甲基-3，3a、4，5-四氢-2H-环戊二烯并[a]萘-3-醇（2.03%）等萜烯类化合物和醇类化合物；体外抗菌试验发现，大西洋雪松精油对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、白色念珠菌均有抑制作用，但敏感度仅为中度或低度。在一定浓度下大西洋雪松精油对LPS 诱导的炎症因子TNF-α 含量有明显影响，对于引起氧化损伤的氧化应激酶iNOS 却有极显著的抑制作用，说明雪松精油发挥抗炎作用的机制有可能与抑制氧化酶的活性有关，但关键的抗炎作用机制还有待进一步验证。综上所述，大西洋雪松精油中含有多种生理活性成分，具有较大的开发、应用潜力。
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