牛骨富含大量的蛋白质、脂肪和矿物质，蛋白质和脂肪含量分别为11.50%和8.50%，钙、磷、铁、锌、铜和B 族维生素的含量丰富，含有大量胶原蛋白、多糖、氨基酸、造血物质等[1]。牛骨是多种营养素的重要来源，但价格低廉、不易储存，易造成资源浪费和环境污染。因此，加强牛骨蛋白资源的高价值利用具有重要的研究意义。
蛋白质酶解技术相对安全且条件温和。近年来多用于动物骨蛋白的开发利用[2]。超声波是一种新兴的绿色加工技术，应用于各种食品加工过程，它可以提高产品收率、强化传质、减少加工步骤、缩短加工时间。由于牛骨结构坚固，仅用蛋白酶酶解效率较低。研究发现，超声波辅助酶解可以软化蛋白质结构，提高酶解效率[3]。高强度超声能产生高剪切能和机械能，引起空化效应，通过破坏共价键导致蛋白质结构的改变，诱导限制性位点的暴露，使底物与酶充分接触，从而提高酶解速度和蛋白质水解物的抗氧化活性[4]。刘文媛等[5]采用超声波辅助水热法从牛骨中提取牛骨油，使提取率增加。Yang 等[6]利用超声波辅助双酶水解法从牛骨中提取低分子肽，并确定了最佳工艺，响应面分析表明，低分子肽最佳提取率为21.04%。超声波技术相对安全、环保、节能，且不会破坏食品的质量和营养成分。因此，超声辅助酶水解可以在蛋白质水解产物和多肽生产之间形成协同作用，从而增加氨基酸和多肽提取率。超声技术在牛骨蛋白提取中的应用还有待探索，本试验采用超声辅助酶法酶解牛骨蛋白，并通过响应面分析法对酶解工艺进行优化，采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法（headspace-solid phase micro extraction-gas chromatography/mass spectrometry，HSSPME-GC/MS）对酶解后样品的挥发性成分进行分析，以期为牛骨蛋白的充分利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜秦川牛骨：宁夏尚农生物科技产业发展有限公司；中性蛋白酶（2×105 U/g）、风味蛋白酶（5×104 U/g）、胃蛋白酶（1×104 U/g）、木瓜蛋白酶（8×105 U/g）、碱性蛋白酶（5×104 U/g）、胰蛋白酶（2×105 U/g）（均为食品级）：北京索莱宝科技有限公司；聚四氟乙烯隔膜、1，2-二氯苯、甲醛、氢氧化钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
MJ-54A 高压灭菌锅：施都凯仪器设备（上海）有限公司；FA2104 电子天平：杭州万特衡器有限公司；KQ-500TDB 超声波清洗器：江苏昆山市超声仪器有限公司；DS-Ⅱ型电热三用恒温水浴箱：余姚市亚星仪器仪表有限公司；TGL-16D 型冷冻高速离心机：常州中捷实验仪器制造有限公司；MQS-30 恒温振荡仪：上海旻泉仪器有限公司；1260 高效液相色谱仪：美国Agilent公司；XW-80A 旋涡混合仪：上海嘉鹏科技有限公司；P611 便携式酸度计：上海佑科仪器仪表有限公司。
1.3 方法
1.3.1 牛骨处理
新鲜牛骨粉碎去除可见的残余肉和骨髓，用去离子水洗涤，在0.1 MPa 高压下煮沸2.5 h，然后在50 ℃下干燥6 h。粉碎后，牛骨粉通过100 目筛分并冷冻储存。
1.3.2 牛骨粉基本成分的测定
牛骨粉的基本成分采用如下方法进行测定。
1）水分含量采用GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》进行测定。
2）灰分含量采用GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》进行测定。
3）蛋白质含量采用GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》进行测定。
4）脂质含量采用GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》进行测定。
5）磷含量采用GB 5009.87—2016《食品安全国家标准食品中磷的测定》进行测定。
6）钙含量采用GB 5009.92—2016《食品安全国家标准食品中钙的测定》进行测定。
每项测定进行3 组平行试验。
1.3.3 蛋白酶的筛选
选用6 种蛋白酶：中性蛋白酶、风味蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶。分别在其最适温度和pH 值条件下，以5 g/100 mL 的底物浓度和6 000 U/g 的酶用量水解牛骨蛋白，以水解度为指标，筛选出最适合牛骨酶解的蛋白酶。
1.3.4 酶解产物的制备
在100 mL 锥形瓶中加入适量牛骨粉，加入一定量的蛋白酶和去离子水。混合均匀后，将超声波清洗器的温度和功率调节到最佳，水解一段时间后于90 ℃处理10 min 灭酶，4 000 r/min 离心10 min，取其上清液，测定水解度。
1.3.5 水解度（degree of hudrolysis，DH）测定
采用甲醛滴定法[7]测定。样品组：将5 mL 牛骨蛋白水解物的上清液与60 mL 蒸馏水混合。对照组：其他条件相同，不添加牛骨蛋白水解物的上清液。将烧杯置于磁力搅拌器上，然后用0.05 mol/L 氢氧化钠（标准滴定溶液）将该溶液滴定至pH8.2，并记录氢氧化钠的消耗体积。向溶液中加入10 mL 甲醛，用0.05 mol/L 氢氧化钠溶液继续滴定至pH9.2。氢氧化钠的消耗量记为V1；对照组相应的氢氧化钠消耗量记为V2，按下式计算DH。
式中：CNaOH 为标准滴定氢氧化钠的浓度，mol/L；V1为pH8.2～pH9.2 滴定时样品组上清液消耗的0.05 mol/L 氢氧化钠的体积，mL；V2 为pH8.2～pH9.2 滴定时对照组上清液消耗0.05 mol/L 氢氧化钠的体积，mL；V 为牛骨蛋白水解产物的总体积，mL；m 为原料的质量，g；0.014 为氮的毫克当量；5 为移取酶解液体积，mL。
1.3.6 超声辅助酶解工艺单因素试验设计
1.3.6.1 料液比对酶解效果的影响
固定超声功率400 W、超声时间30 min、超声温度50 ℃，料液比分别为1 ∶4、1 ∶6、1 ∶8、1 ∶10、1 ∶12（g/mL）时，考察料液比对水解度的影响，每个水平重复3 次。
1.3.6.2 超声时间对酶解效果的影响
固定料液比1 ∶8（g/mL）、超声功率400 W、超声温度50 ℃，超声时间分别为30、60、90、120、150 min 时，考察超声时间对水解度的影响，每个水平重复3 次。
1.3.6.3 超声功率对酶解效果的影响
固定料液比1 ∶8（g/mL）、超声时间30 min、超声温度50 ℃，超声功率分别为300、350、400、450、500 W时，考察超声功率对DH 的影响，每个水平重复3 次。
1.3.6.4 超声温度对酶解效果的影响
固定料液比1 ∶8（g/mL）、超声时间30 min、超声功率400 W，超声温度分别为20、30、40、50、60 ℃时，考察超声温度对DH 的影响，每个水平重复3 次。
1.3.7 响应面优化试验设计
响应面设计参考单因素试验结果，在四因素三水平上对料液比、超声时间、超声功率、超声温度进行优化，因素及水平设计见表1。
表1 响应面法分析因素及水平
Table 1 Analysis factors and levels of response surface methodology
水平因素A 超声温度/℃D 料液比/（g/mL）-1 40 30 400 1∶6 0 50 60 450 1∶8 1 60 90 500 1∶10 B 超声时间/min C 超声功率/W
1.3.8 顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用分析
顶空固相微萃取条件：吸取2 mL 样品至15 mL 顶空瓶中，加入4 μL 内标（1，2-二氯苯，6.42 μg/mL），用旋涡混合仪混匀后用聚四氟乙烯隔膜密封顶空瓶口后在50 ℃保温20 min。并将活化好的萃取头（75 μm Carboxen/PDMS）插入顶空瓶里，50 ℃吸附20 min，然后拔出萃取头，插入气相色谱进样口，进样口温度设置为250 ℃，并在250 ℃解吸7 min。
气相色谱条件：TR-35 MS 色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为高纯氦气；不分流进样；升温程序为35 ℃保持3 min 后，以2.5 ℃/min 的速率上升到70 ℃，再以8 ℃/min 的速率上升到150 ℃，最后以20 ℃/min升到230 ℃，保持7 min。
质谱条件：检测器的温度设置为280 ℃；离子源的温度设置为200 ℃；电子能量70 eV；传输线的温度设置为250 ℃；质量扫描范围为m/z 30～500。
1.4 数据处理
利用Excel 对进行单因素数据分析；用Design-Expert 10 软件进行响应面优化试验，并进行数据分析；采用OriginPro 2019 b 绘图，SPSS 20.0 进行数据处理及显著性检验，P＜0.05 表示差异显著，试验重复3 次。
2 结果与分析
2.1 牛骨粉基本组成成分测定结果
牛骨粉的成分含量见表2。
表2 牛骨粉的成分含量
Table 2 Composition content of bovine bone meal
蛋白质/% 水分/% 脂质/% 灰分/% 钙/% 磷/%24.40 5.46 4.26 46.95 16.17 2.76
从表2 可以看出，牛骨加工成骨粉后仍含有丰富的营养资源，其中蛋白质占总量的24.40%；钙占总量的16.17%，因此牛骨具有很大的开发利用价值。
2.2 不同蛋白酶对牛骨酶解液的影响
不同酶的水解度如表3 所示。
表3 不同蛋白酶对牛骨酶解液的影响
Table 3 Effect of different proteases on enzymatic hydrolysis of bovine bone
种类 pH 值 温度/℃ 时间/h 水解度/% 酶解液状态风味蛋白酶 7.0 50 2 11.15 淡黄，较浑浊，有骨香味中性蛋白酶 7.0 50 2 11.52 淡黄色透明，较浑浊，有骨香味胃蛋白酶 2.0 37 2 8.64 无色透明，澄清，有酸涩味木瓜蛋白酶 6.5 60 2 9.35 无色透明，较澄清，有骨香味碱性蛋白酶 9.0 43 2 9.45 淡黄，浑浊，有苦味胰蛋白酶 8.0 37 2 9.13 无色透明，浑浊，有苦味
从表3 可以看出，中性蛋白酶水解度最大，其次为风味蛋白酶。另外，中性蛋白酶属于内切酶，常用于水解动植物蛋白质、生产调味品和食品营养强化剂。风味蛋白酶可以将低水解产物中的苦味肽链完全降解为氨基酸，可以用来水解蛋白质，改善水解产物的风味。因此，选择中性蛋白酶和风味蛋白酶2 种蛋白酶复配，作为后续酶解牛骨的蛋白酶。
2.3 超声辅助双酶法制备牛骨酶解液的工艺优化
2.3.1 单因素试验结果
2.3.1.1 料液比对水解度的影响
料液比对水解度的影响见图1。
图1 料液比对水解度的影响
Fig.1 Effect of material-liquid ratio on enzymatic hydrolysis
从图1 可以看出，当料液比为1 ∶8（g/mL）时，水解度为最大值21.01%。当溶剂体积继续增加，水解度降低。当溶剂体积过低时，蛋白酶与底物的接触充分；当溶剂体积过大时，底物与酶之间的接触较少，可用于酶切的位置减少，导致水解度迅速下降，所以选择适宜料液比能使产物分子的扩散增快并且催化速度提高[8]。因此，选择料液比1 ∶6、1 ∶8、1 ∶10（g/mL）进行后续响应面优化试验。
2.3.1.2 超声时间对水解度的影响
超声时间对水解度的影响见图2。
图2 超声时间对水解度的影响
Fig.2 Effect of ultrasonic time on enzymatic hydrolysis
从图2 可以看出，当超声时间为60 min 时，水解度为最大值20.82%。随着超声时间的延长，整个酶解反应体系趋于均匀，蛋白质的空间构象产生正变化，埋入蛋白质中的酶切位点暴露出来，促进底物与酶的结合[9]。但是如果超声时间过长，酶解产物会转化为其他副产物。此外，超声时间过长会产生热效应和剪切力，破坏某些底物蛋白质的活性部分，提高酶解反应系统的温度，超过酶的最佳反应温度，抑制酶活性，降低酶解反应速率；酶解时间过短，酶解反应不足。因此，选择超声时间30、60、90 min 进行后续响应面优化试验。
2.3.1.3 超声功率对水解度的影响
超声功率对水解度的影响见图3。
图3 超声功率对水解度的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic power on enzymatic hydrolysis
从图3 可以看出，随着超声功率的增加，水解度先升高后降低，当超声功率为450 W 时达到最高值21.63%。当超声与酶解反应耦合时，底物蛋白质的空间结构发生改变，增加了底物和酶的结合位点，有效提高酶解效果，打破肽键，提高水解度。随着超声功率的增加，介质中的传质速度加快，反应体系的传质过程加快，水解度增加。此外，超声和液体的相互作用会产生大量泡沫，破泡后会产生局部瞬时压力[10]，有利于牛骨小肽和氨基酸的溶解。随着超声功率的不断增加（大于450 W），超声空化效应会破坏蛋白质分子的构象，导致酶活力降低，水解度迅速降低[11]，这与蓝尉冰等[12]的研究结果一致。考虑到能耗和生产周期等因素，因此，选择超声功率400、450、500 W 进行后续响应面优化试验。
2.3.1.4 超声温度对水解度的影响
超声温度对水解度的影响见图4。
图4 超声温度对水解度的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on enzymatic hydrolysis
由图4 可知，当超声温度低于50 ℃时，水解度不断增加。当超声温度达到50 ℃时，水解度为最大值20.64%。当超声温度高于50 ℃时，水解度逐渐降低。反应温度升高，溶质扩散速度加快，有利于酶与牛骨粉的接触，因此更有利于反应[13]。当超声温度超过50 ℃时，超声空化效应产生的自由基会破坏酶的活性中心，导致反应速率降低[14]，水解度降低。因此，选择超声温度40、50、60 ℃进行后续响应面优化试验。
2.3.2 响应面分析及回归模型
根据单因素试验结果，选择超声温度、超声时间、超声功率、料液比作为自变量，进行响应面试验，中心组合设计及结果如表4 所示。
表4 中心组合设计及结果
Table 4 Center combination design and results
序号 A 超声温度/℃B 超声时间/h C 超声功率/W D 料液比/（g/mL） DH/%1 50 90 400 1∶8 18.11 2 40 30 450 1∶8 18.07 3 50 60 500 1∶6 18.87 4 50 30 450 1∶10 18.34 5 40 60 400 1∶8 17.67 6 60 30 450 1∶8 18.52 7 50 90 450 1∶6 18.38 8 60 60 450 1∶10 18.09 9 50 60 400 1∶10 18.14 10 40 90 450 1∶8 18.03 11 50 30 500 1∶8 18.82 12 50 60 400 1∶6 18.70 13 50 60 500 1∶10 18.38 14 60 60 500 1∶8 18.45 15 60 60 450 1∶6 18.71 16 50 90 450 1∶10 18.03 17 50 60 450 1∶8 20.68 18 50 60 450 1∶8 20.29 19 50 60 450 1∶8 20.77 20 50 30 400 1∶8 18.52 21 50 60 450 1∶8 20.61 22 50 60 450 1∶8 20.93 23 60 90 450 1:8 18.15 24 40 60 450 1∶10 17.84 25 40 60 450 1∶6 18.05 26 50 90 500 1∶8 18.41 27 40 60 500 1∶8 18.38 28 50 30 450 1∶6 18.93 29 60 60 400 1∶8 18.41
对数据中多项式进行回归拟合得到二次回归方程为
响应面结果分析见表5。
表5 回归系数模型及方差分析
Table 5 Regression coefficient model and variance analysis
注：*表示差异显著（P＜0.05）；**表示差异极显著（P＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型 24.71 13 1.90 95.44 ＜0.000 1 **A 超声温度 0.44 1 0.44 21.95 0.000 3 **B 超声时间 0.36 1 0.36 18.28 0.000 7 **C 超声功率 0.26 1 0.26 12.96 0.002 6 **D 料液比 0.66 1 0.66 33.28 ＜0.000 1 **AB 0.027 1 0.027 1.37 0.260 5 AC 0.11 1 0.11 5.64 0.031 4 *AD 0.042 1 0.042 2.11 0.166 9 BD 0.014 1 0.014 0.72 0.408 5 CD 1.225 1 1.225 0.062 0.807 5 A2 12.09 1 12.09 607.04 ＜0.000 1 **B2 8.17 1 8.17 410.52 ＜0.000 1 **C2 7.20 1 7.20 361.78 ＜0.000 1 **D2 7.90 1 7.90 396.92 ＜0.000 1 **残差 0.30 15 0.020失拟项 0.074 11 6.723 0.12 0.997 6纯误差 0.22 4 0.056总方差 25.00 28
由表5 可知，4 个因素对水解度均具有极显著性影响。模型P＜0.000 1，说明响应面回归模型极显著；失拟项P=0.997 6＞0.05，表明失拟项不显著，确定系数R2=0.988 1，表明有98.81%的响应值变化是来自于所选因素的变化；模型修正决定系数R2Adj=0.977 7，说明模型能解释响应值变化的97.77%；综上，该模型的可信度和拟合度均较高。因此该模型的回归方程可以预测超声辅助双酶法酶解牛骨的最佳工艺。
A、B、C、D 4 个因素对结果影响极显著（P＜0.01），AC 对结果影响显著（P＜0.05），AB、AD、BD、CD 对结果影响不显著（P＞0.05）。由F 值可以得到4 个因素对水解度影响大小顺序为D 料液比＞A 超声温度＞B 超声时间＞C 超声功率。综上所述，回归方程对实际试验的拟合程度高，可以应用于实际过程。
各因素与水解度之间相互作用响应面图见图5。
图5 超声辅助酶解不同条件的响应面
Fig.5 Response surface diagram of ultrasonic-assisted enzymatic hydrolysis under different conditions
通过响应面分析，4 个影响因素的最佳组合为超声温度50.73 ℃、超声时间57.48 min、超声功率453.12 W、料液比1 ∶7.78（g/mL），预测水解度为20.69%。为了检验模型预测的准确性，优化试验工艺为超声温度51 ℃、超声时间60 min、超声功率450 W、料液比1 ∶8（g/mL）。实测水解度为20.73%，与预测值基本接近，表明该模型具有可行性。
2.4 顶空固相微萃取-气相色谱-质谱分析
采用响应面试验优化后的酶解条件进行提取，对得到的样品进行挥发性成分含量分析，结果见表6。
表6 样品的挥发性成分含量
Table 6 Content of volatile components in the sample
类别 挥发性成分 保留时间/min 含量/（μg/kg）醛类 己醛 4.89 143.48壬醛 13.39 3.22苯甲醛 16.06 14.08 2-壬醛 16.51 2.55苯乙醛 18.33 1.19醇类 1-戊烯-3-醇 7.16 13.16 3-甲基-1-丁醇 8.48 43.05 1-戊醇 9.65 43.66正己醇 12.48 190.39氧化芳樟醇 14.69 59.99 1-辛烯-3-醇 14.94 10.65 1-庚醇 15.06 18.83
续表6 样品的挥发性成分含量
Continue table 6 Content of volatile components in the sample
类别 挥发性成分 保留时间/min 含量/（μg/kg）醇类 芳樟醇 16.98 27.26正辛醇 17.19 7.68（E）-2 辛烯-1-醇 18.20 4.45 1-壬醇 19.03 1.36己醇 21.72 17.06苯甲醇 22.10 1.02苯乙醇 22.64 4.48庚醇 23.25 2.04酮类 2-庚酮 7.48 113.88 3-羟基-2-丁酮 10.17 1.21 2-壬酮 13.32 6.79苯乙酮 18.52 1.68烃类 甲苯 3.96 30.85 2,3-二甲基-戊烷 5.67 1.10苯乙烯 9.19 7.65酸类 2-辛酸 14.31 3.58醋酸 14.58 5.15 3-甲基丁酸 18.97 3.18戊酸 20.06 5.89辛酸 24.70 0.89苯甲酸 28.99 2.01杂环化合物 2-戊基呋喃 8.33 14.2吡咯 15.91 5.36 2-乙酰噻唑 1.63 1.78苄腈 8.43 9.29苯酚 1.31 1.62
由表6 可知，样品中风味成分的种类为38 种。醛类是酶解产物中的主要挥发性物质之一。在样品中检测到5 种醛，醛类物质含量占总挥发性物质的19.92%，样品中检测到的醛类有己醛、壬醛、苯甲醛、2-壬醛、苯乙醛。醛类主要来自氨基酸降解反应或脂肪氧化反应。通常有6 个～9 个碳的醛类具有水果味、清淡味和脂肪味，阈值低，与其他物质具有重叠的风味效应，并对整体的风味特征有贡献[15]。己醛具有原生味、鲜味和类醛味的特点，当相对含量较高时，会有青草味和脂肪味。苯甲醛有强烈的坚果味和鱼味[16]。壬醛有油脂和甜橙的气味[17]。
醇类是牛骨酶解液中含量最丰富的挥发性物质，大多数醇化合物是由脂质氧化分解形成的[18]。醇类有独特的风味，如花、香、果和甜味。有的醇类物质阈值较低，这可能对牛骨酶解物风味具有积极作用[19]。样品中共检测到15 种醇类化合物。其中，1-辛烯-3-醇能加强酶解产物的脂肪风味[20]。芳樟醇具有类似于铃兰的甜味和花香，可以改善酶解产物的腥味。样品中共检测到4 种酮类化合物，相对含量较低。酮的阈值比醛类高，但酮类物质有花香、清香和水果香，对酶解产物的风味形成有益。
烃类化合物的阈值相对较高，对酶解产物的整体风味几乎没有影响[21]，这主要是由于脂肪酸烷氧基的裂解，当存在支链烷烃、芳香烃和烯烃时，它们可能有助于酶解产物的风味[22]。试验中共检测到3 种烃类化合物。此外，样品中还检测到少量酸类。然而，酸的阈值非常高，对酶解产物的风味几乎没有影响。
样品中共检测到5 种杂环化合物，主要是呋喃、吡啶和噻唑。它们的阈值非常低，这对酶解产物的风味有很大贡献[23]。呋喃有强烈的肉类风味，是典型的风味物质。杂环化合物主要由糖分解和美拉德反应产生，主要有豆香味、甜味、焦糖等[24]。例如，2-戊基呋喃的味道类似于火腿[25]。样品中的杂环化合物虽然含量很小，但杂环化合物阈值很低，因此它们也有助于提高酶解产物的风味。
3 结论
本文以水解度为指标，从6 种蛋白酶中筛选出中性蛋白酶、风味蛋白酶水解牛骨粉；以单因素试验为基础，用响应面分析法优化超声辅助双酶水解牛骨粉的工艺条件。结果显示，牛骨粉最佳酶解条件为料液比1 ∶8（g/mL）、超声时间60 min、超声功率450 W、超声温度51 ℃，在此条件下水解度为20.73%。采用HSSPME-GC/MS 测定出样品的挥发性风味成分有38种，其中，醛类5 种、醇类15 种、酮类4 种、烃类3 种、酸类6 种和杂环化合物5 种，含量分别为醛类164.52 μg/kg、醇类445.08 μg/kg、酮类123.56 μg/kg、烃类39.6 μg/kg、酸类20.7 μg/kg 和杂环化合物32.25 μg/kg，醛类物质和醇类物质含量最多，为牛骨酶解样品挥发性物质的主要贡献者。本文采用超声波辅助技术提高了牛骨酶解的程度，增加了牛骨蛋白的产量，大大缩短了提取时间，且通过超声辅助双酶酶解的样品具有丰富的挥发性风味。本试验为提高牛骨资源利用率及其应用领域提供了基础数据和参考依据。
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