牛樟芝（Antrodia cinnamomea）又名牛樟菇、樟芝等，是产自我国华东地区的一类真菌[1]，无褶菌目、多孔菌科、多孔菌属[2]。牛樟芝中含有三萜类、二萜类、甾醇类、泛醌类、多糖类、琥珀酸和马来酸衍生物等有效成分[3-5]，具有抗肿瘤、抗炎、保肝护肝、抗氧化和调节免疫力等功效[6-8]。山药又名薯蓣、山芋等，为药食同源食品[9-10]，《神农本草经》中记载其具有补脾益肺、补肾益精的功效[11]。研究发现，山药中含有丰富的多糖、多酚及黄酮类化合物[12]，具有降血糖、降血脂、抗氧化、免疫调节、抗病毒等药用功效[13-16]。以牛樟芝为发酵微生物，以山药为发酵基质，利用生物发酵技术获得牛樟芝山药菌质，该菌质兼具牛樟芝和山药的生理活性成分[17-20]，以该菌质为主要原料，借助现代饮料制备技术，开发出牛樟芝山药菌质饮料，为新型菌质类饮料的研究开发提供参考。
现代社会工作压力大，生活节凑快，接触的各种辐射源较多，人体中容易产生自由基，造成机体受损。因此，以牛樟芝山药菌质为原料，探索开发一款具有一定抗氧化功效的保健饮料，具有一定的应用价值。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
牛樟芝菌种（CGMCC 9590）：信阳市药用菌工程中心保藏；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、H2O2、水杨酸、硫酸亚铁、乙醇、甲醇、硫酸镁、磷酸二氢钾、葡萄糖、维生素C 标准品（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；酵母浸粉、牛肉膏、维生素B1（生化试剂）；木糖醇、琼脂粉（均为食品级）：北京博奥星生物技术有限责任公司；铁棍山药、马铃薯、玉米粉：市售。
1.2 仪器与设备
Tu-1810 分光光度计：北京普析仪器设备公司；XFS-280 型高压灭菌锅：浙江新丰医疗公司；101-0 型电热恒温鼓风干燥箱：上海梅香仪器公司；HH-S6 型恒温水浴锅：金坛市国旺实验仪器公司；XFB-200 型中药粉碎机：湖南中城制药设备公司；SW-CJ-2D 型超净工作台：上海申安医疗器械有限公司；GJB8-20 型高压均质机：常州菌质设备公司；HY60 型恒温摇床：武汉汇诚生物科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 培养基的制备
斜面培养基：去皮马铃薯200 g/L、玉米粉30 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、硫酸镁0.5 g/L、维生素B1 0.05 g/L、琼脂粉20 g/L。
牛樟芝液体培养基：制备方法同斜面培养基，去掉琼脂粉，250 mL 三角瓶装100 mL 培养基。
山药培养基：参考文献[18]的方法，稍作修改。新鲜山药洗净、去皮，切成2 mm～3 mm 颗粒，40 ℃左右烘干至水分含量为10%左右。称取60 g 左右烘干的山药颗粒，加入60 mL 双蒸水，浸润2 h～3 h 后，121 ℃灭菌30 min，备用。
1.3.2 牛樟芝山药菌质的制备
将冰箱中保藏的牛樟芝斜面菌种置于培养箱中25 ℃左右活化24 h，随后接种到斜面培养基上，28 ℃培养至菌丝体长满斜面，接种于牛樟芝液体培养基上，静置24 h 后，置于恒温摇床上，28 ℃、200 r/min 培养7 d～8 d。
吸取培养好的牛樟芝液体菌丝球3 mL，无菌条件下接种于灭菌冷却后的山药培养基上，黑暗状态下，28 ℃、培养至发满菌后，打开发光二极管（light emitting diode）白色光源（800 lux 左右），光照培养6 d～7 d。
取出见光培养完成后的牛樟芝山药菌质，40 ℃左右烘干，用中药粉碎机粉碎，过60 目筛后保存备用。
1.3.3 牛樟芝山药菌质饮料的制备工艺
牛樟芝山药菌质粉→浸提→调配→均质→灭菌→灌装→成品
牛樟芝山药菌质浸提液的制备：按照菌质与水料液比1 ∶15（g/mL），85 ℃浸提3 h，过滤取滤液，滤渣加入等体积的水再浸提3 h 后过滤，合并2 次滤液得菌质浸提液。
调配：固定添加菌质浸提液的添加量，用不同配比的木糖醇、柠檬酸和羧甲基纤维素钠调节饮料的风味，通过单因素试验、响应面试验，借助感官评价标准确定该饮料的最佳配方。
均质、灭菌和灌装：利用高压均质机对调配好的饮料进行均质，采用沸水浴灭菌法对饮料进行灭菌，采用高压蒸汽灭菌过的玻璃瓶对饮料进行灌装。具体方法参考文献[21-23]中的方法操作。
1.3.4 饮料质量指标检测
1.3.4.1 感官指标
邀请10 名食品专业人员对调配后饮料的感官品质进行综合评分，取其评分的平均值。牛樟芝山药菌质饮料感官评价标准见表1。
表1 牛樟芝山药菌质饮料感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standard of Antrodia cinnamomeayam fungi substance beverage
指标 评价标准 分数色泽（20） 呈亮黄色，色泽均匀纯正，颜色明亮 15～20色泽较深或者较浅，较为均匀，较为明亮 8～14色泽很深或者很浅，不均匀，颜色暗淡 0～7组织状态（20） 清澈，无沉淀，无杂质 15～20较为清澈，少量沉淀和杂质 8～14浑浊，有大量杂质 0～7香气（30） 有菌质特有香味，香气明显 21～30有菌质特有香味，香气不明显 11～20有异味 0～10味道（30） 酸甜可口，风味协调 21～30酸甜适中，风味不协调 11～20太酸或者太甜，异味明显 0～10
1.3.4.2 微生物指标检测
调配好的菌质饮料的菌落总数和大肠杆菌菌群分别参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》和GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》测定[24-25]。
1.3.5 单因素试验
以牛樟芝山药菌质添加量3%、木糖醇添加量3%、柠檬酸添加量0.7%、羧甲基纤维素钠（carbox-ymethyl cellulose，CMC-Na）添加量0.3%为固定调配参数，以感官评分为指标，进行单因素试验，考察牛樟芝山药菌质添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、木糖醇添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、柠檬酸添加量（0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%）、CMC-Na 添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）对饮料感官评分的影响。所有试验平行3 次，取平均值。
1.3.6 配方优化的响应面试验
在单因素试验的基础上，进行响应面试验，以牛樟芝山药菌质饮料感官评分为指标，确定菌质添加量（A）、木糖醇添加量（B）、柠檬酸添加量（C）、CMC-Na添加量（D）的最佳配比。响应面优化试验因素水平见表2。
表2 响应面优化试验因素水平
Table 2 Factors and levels of response surface methodology
水平因素A 菌质添加量/%D CMC-Na添加量/%-1 3 2 0.5 0.1 0 B 木糖醇添加量/%C 柠檬酸添加量/%4 3 0.7 0.2 1 5 4 0.9 0.3
1.3.7 抗氧化试验
1.3.7.1 DPPH 自由基清除率测定
参考郭雪峰等[26]的方法，以VC 为阳性对照，采用分光光度法测定不同质量浓度饮料的DPPH 自由基清除率，重复3 次，取平均值。
1.3.7.2 羟基自由基清除率测定
参考魏梦涛等[27]的方法，以VC 为阳性对照，采用分光光度法测定不同质量浓度饮料的羟基自由基清除率，重复3 次，取平均值。
1.3.8 数据处理
采用Design-Expert 8.0.6、SPSS 26.0、Excel 2007 等软件对相关数据进行绘图和统计分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
单因素试验结果见图1。
图1 单因素试验结果
Fig.1 Single-factor test results
由图1A 可知，随着牛樟芝山药菌质添加量的增加，饮料的感官评分迅速上升，分析原因可能是菌质添加量的增加对饮料色香味方面产生了有益的影响，当菌质添加量达到4%时，饮料的感官评分达到最大值。随着菌质添加量的继续增加，饮料的感官评分开始下降，分析原因可能是菌质添加量过大，对饮料的澄清度及色泽产生了消极的影响，且不同菌质添加量对饮料的整体感官评分影响显著（P＜0.05）。因此，选择3%、4%、5%进行后续试验。
由图1B 可知，随着木糖醇添加量的增加，饮料的感官评分开始上升，分析原因可能是随着甜度增大，饮料的甜味越来越明显。在木糖醇添加量为3%时，饮料的感官评分达到最大值。随着木糖醇添加量的继续增加，饮料的感官评分开始下降，分析原因可能是饮料酸甜失衡所致，且不同木糖醇添加量对饮料的整体感官评分影响显著（P＜0.05）。因此，选择2%、3%、4%进行后续试验。
由图1C 可知，随着柠檬酸添加量的增加，饮料的感官评分呈上升趋势，分析可能是随着饮料酸度的增加，饮料呈现出酸甜适口的口感，导致其感官评分上升。当柠檬酸添加量达到0.7%时，饮料的感官评分达到最大值。随着柠檬酸添加量的继续增大，饮料的感官评分开始下降，分析原因可能是饮料酸甜失衡，且不同柠檬酸添加量对饮料的整体感官评分影响显著（P＜0.05）。因此，选择0.5%、0.7%、0.9%进行后续试验。
由图1D 可知，随着饮料中CMC-Na 添加量的增加，饮料的感官评分开始上升，分析可能是随着CMCNa 添加量的增加，饮料的澄清度提高，导致其感官评分的提升。当其添加量达到0.2%时，饮料的感官评分达到最大值。随其添加量的继续增加，饮料的感官评分开始下降，分析可能是随着CMC-Na 添加量的继续增加，影响了饮料整体的香味、色泽及澄清度，导致其感官评分下降，且不同CMC-Na 添加量对饮料的整体感官评分影响显著（P＜0.05）。因此，选择0.1%、0.2%、0.3%进行后续试验。
2.2 响应面试验结果
响应面试验方案及结果见表3。
表3 响应面分析方案及试验结果
Table 3 Response surface design arrangement and experimental results
试验号 A 菌质添加量B 木糖醇添加量C 柠檬酸添加量D CMC-Na添加量感官评分1 1 0 0 1 83.2 2 0 0 0 0 87.3 3 -1 -1 0 0 78.5 4 0 0 0 0 88.5 5 0 -1 -1 0 81.2 6 -1 0 0 1 84.2 7 0 0 0 0 87.8 8 1 -1 0 0 80.4 9 0 0 -1 1 84.3 10 -1 1 0 0 82.1 11 1 1 0 0 85.2 12 1 0 0 -1 82.6 13 1 0 1 0 80.4 14 -1 0 1 0 77.6 15 0 -1 1 0 76.2 16 0 1 1 0 81.3 17 0 0 0 0 88.2 18 0 1 0 1 84.6 19 -1 0 0 -1 82.1 20 0 1 0 -1 82.5
续表3 响应面分析方案及试验结果
Continue table 3 Response surface design arrangement and experimental results
试验号 A 菌质添加量B 木糖醇添加量C 柠檬酸添加量D CMC-Na添加量感官评分21 0 -1 0 -1 77.3 22 0 0 -1 -1 80.6 23 0 0 1 1 81.1 24 0 -1 0 1 84.1 25 -1 0 -1 0 82.6 26 0 0 0 0 87.5 27 0 1 -1 0 84.3 28 1 0 -1 0 82.4 29 0 0 1 -1 76.8
运用Design-Expert 8.0.6 软件对表3 中的试验结果进行多元回归拟合，建立二次多项式回归模型。获得不同因素对饮料感官评分的回归方程：Y=87.86+0.59A+1.86B-1.83C+1.63D+0.3AB+0.75AC-0.38AD+0.5BC-1.18BD+0.15CD-2.75A2-3.20B2-4.31C2-2.49D2。对回归模型进行方差分析，结果如表4 所示。
表4 方差分析
Table 4 Variance analysis
注：*表示差异显著（P＜0.05）；**表示差异极显著（P＜0.01）。
来源 偏差平方和 自由度 均分平方和 F 值 P 值 显著性模型 311.61 14 22.26 22.20 ＜0.000 1 **A 菌质添加量 4.20 1 4.20 4.19 0.059 9 B 木糖醇添加量 41.44 1 41.44 41.34 ＜0.000 1 **C 柠檬酸添加量 40.33 1 40.33 40.23 ＜0.000 1 **D CMC-Na 添加量 32.01 1 32.01 31.93 ＜0.000 1 **AB 0.36 1 0.36 0.36 0.558 6 AC 2.25 1 2.25 2.24 0.156 3 AD 0.56 1 0.56 0.56 0.466 2 BC 1.00 1 1.00 1.00 0.334 9 BD 5.52 1 5.52 5.51 0.034 2 *CD 0.090 1 0.090 0.090 0.768 9 A2 49.08 1 48.96 48.96 ＜0.000 1 **B2 66.46 1 66.46 66.29 ＜0.000 1 **C2 120.68 1 120.68 120.38 ＜0.000 1 **D2 40.16 1 40.16 40.06 ＜0.000 1 **残差 14.03 14 1.00失拟项 13.06 10 1.31 5.38 0.059 7 不显著纯误差 0.97 4 0.24总和 325.64 28
由表4 可知，回归模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），说明建立的回归模型有意义。木糖醇添加量、柠檬酸添加量和CMC-Na 添加量对饮料的感官评价均具有极显著的影响（P＜0.01），菌质添加量影响不显著（P＞0.05）。结合F 值可知，对饮料感官评分影响大小依次为木糖醇添加量＞柠檬酸添加量＞CMC-Na 添加量＞菌质添加量。通过响应面分析得知，获得的饮料最佳配比是牛樟芝山药菌质添加量4.08%、木糖醇添加量3.23%、柠檬酸添加量0.66%、CMC-Na 添加量0.23%，此时，获得的理论最大值为88.483 8。
2.3 验证试验
按照回归模型最佳配方，选择同一批评价员与评价方法，做3 次重复试验，获得的饮料感官评分平均值为89.6，与预测值相对误差较小，这说明模型拟合度较好，预测准确。在该配方下，牛樟芝山药菌质饮料呈亮黄色，具有明显的牛樟芝山药菌质特殊香味，透明度较好，酸甜可口。
2.4 微生物指标测定结果
按照相关检测方法对饮料相关微生物指标进行检测，结果发现致病菌未检出，细菌总数≤10 CFU/mL，大肠杆菌菌群＜5 MPN/100 mL。
2.5 饮料抗氧化测定结果
2.5.1 饮料的DPPH 自由基清除能力
以VC 为阳性对照，对饮料的DPPH 自由基清除率进行测定，结果如图2 所示。
图2 饮料对DPPH 自由基清除率
Fig.2 Beverage scavenging rate of DPPH free radicals
由图2 可知，当VC 的质量浓度为1.00 mg/mL 时，其对DPPH 自由基清除率为92.09%，随着质量浓度继续增加，各组清除率数据不再具有显著差异（P＞0.05）。而牛樟芝山药菌质质量浓度达到8.00 mg/mL 时，其对DPPH 自由基清除率达到89.32%，随着质量浓度继续增大，各组清除率不再具有显著差异（P＞0.05）。上述结果表明，牛樟芝山药菌质饮料对DPPH 自由基具有一定的清除作用。
2.5.2 饮料的羟基自由基清除率
以VC 为阳性对照，对饮料的羟基自由基清除能力进行测定，结果如图3 所示。
图3 饮料对羟基自由基清除率
Fig.3 Beverage scavenging rate of hydroxyl free radicals
由图3 可知，当VC 的质量浓度为1.00 mg/mL 时，其对羟基自由基清除率为81.40%，随着质量浓度继续增加，各组·OH 清除率数据不再具有显著差异（P＞0.05）。而牛樟芝山药菌质质量浓度达到8.00 mg/mL 时，其对羟基自由基清除率达到81.96%，随着质量浓度继续增大，各组·OH 清除率不再具有显著差异（P＞0.05）。上述结果表明，牛樟芝山药菌质饮料对羟基自由基具有一定的清除能力。
3 结论与展望
本研究在单因素试验的基础上，通过响应面试验进一步优化了饮料最佳配方，最佳配方为牛樟芝山药菌质添加量4.08%、木糖醇添加量3.23%、柠檬酸添加量0.66%、CMC-Na 添加量0.23%，该饮料对DPPH 自由基和羟基自由基具有一定的清除能力。
后续，借助高效液相色谱、傅里叶转换红外光谱、质谱等物理化学分析检测手段对牛樟芝山药菌质的生理活性成分进行分析检测，以进一步了解菌质中的主要成分，为饮料后续的开发提供参考。同时，将以果蝇、小鼠为模型生物，进一步验证牛樟芝山药菌质的生理功能，以进一步探究饮料的保健功效。
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