黑莓（Rubus fruticosus Pollich），又称露莓，被联合国粮食及农业组织认定为第三代新型特种果，其果皮纤薄，不耐储存，且成熟的季节性很强，是一种加工型水果。黑莓一般深加工成冻果、果酱、果汁、果酒等产品[1-7]。黑莓果汁口感偏酸，其富含有机酸、维生素E、矿物质元素、氨基酸等营养素，还含有多酚、多糖、黄酮等多种活性物质，具有抗肿瘤、抗氧化、消炎、抗衰老、维持血压、血脂、血糖稳定等功效[7-8]。
玫瑰（Rosa rugose Thunb）在全球范围内广泛种植，是一种广泛分布的观赏型花卉[8]。因其生物活性显著，广泛用于各种疼痛的舒缓和治疗、消化不良、神经紧张和各类皮肤问题等方面，玫瑰花瓣提取物中含有多酚、黄酮、多糖及花色苷类物质，具有抗氧化、抗菌、调节高脂血症脂质代谢、降血糖、抗氧化、免疫调节活性、清除自由基等多种活性[9-17]。
目前市场上有少量黑莓果汁饮料品种出现，部分产品发酵技术老旧，口感不佳，且因黑莓果汁糖酸比较低，口感酸烈，产品往往需添加大量的甜味物质来调节口感[18]。黑莓与玫瑰花，颜色艳丽，将两者结合进行发酵，除了可利用玫瑰花瓣提取物的香甜感来中和黑莓的酸涩感外，还可利用其自身富含花色苷的特点，得到具有抗氧化功能性的复合发酵产物，以期为该类功能性饮料的生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑莓、玫瑰花干花瓣：市售；植物乳杆菌：陕西米先尔生物科技有限公司；无水乙醇：天津市富宇精细化工有限公司；3%过氧化氢：厦门海标科技有限公司；水杨酸、七水合硫酸亚铁、磷酸氢二钠：天津市科密欧化学试剂有限公司；乙二胺四乙酸、二水合磷酸二氢钠：成都金山化学试剂有限公司；食用小苏打：天津渤化永利化工股份有限公司；果胶酶（10 万U/g）：山东隆科特酶制剂有限公司；VC 标准品：国药集团化学试剂有限公司；甲硫氨酸、核黄素、氮蓝四唑、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）：上海麦克林生化科技有限公司；纯净水：娃哈哈集团。
1.2 仪器与设备
721 型紫外分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；TG16-WS 型台式离心机：常州朗越仪器制造有限公司；PH-030 型恒温培养箱：上海齐欣科学仪器有限公司；SW-CJ-2FD 型细菌洁净台：苏州安泰空气技术有限公司、DJ-A500 型分析天平：福州华志科学仪器有限公司；PHS-25 型pH 计：上海越平科学仪器制造有限公司。
1.3 方法
1.3.1 黑莓果汁的制备
黑莓清洗干净之后，破碎，用果胶酶进行酶解，果胶酶添加量为1.6 mL/kg，置于35 ℃水浴中酶解2 h，并于90 ℃条件下灭酶3 min，100 目（150 μm）尼龙网过滤，进行渣汁分离，获得黑莓原汁。
1.3.2 玫瑰花浆的制备
选择当年产制的玫瑰花瓣，去掉花托后冷水清洗，加入500 mL 60 ℃的热水，保温搅拌4 h，打浆后，100 目（150 μm）尼龙网过滤，进行渣汁分离，获得玫瑰花浆。
1.3.3 花色苷含量的测定
花色苷的测定采用消光系数法[19]，将发酵液稀释一定倍数，取稀释液用紫外分光光度计在300 nm～800 nm波长范围内扫描，用纯净水作参比溶液，经过多次扫描从而确定发酵液花色苷的最大吸收波长。按下式计算发酵液中花色苷含量。
式中：C 为发酵液中花色苷含量，mg/L；A 为稀释液在最大吸收波长处的吸光度；V1 为发酵液定容时的体积和稀释倍数的乘积，L；V2 为量取的发酵液的体积，L；98.2 为黑莓发酵液花色苷的平均消光系数。
1.3.4 感官评价试验
评价员对产品的外观、香气、滋味及典型性等感官特性进行检验与分析评定。参照GB/T 31121—2014《果蔬汁类及其饮料》，细化其中的感官评价标准，方便从甜度、酸度、香味、口感和色泽方面对不同的发酵工艺生产的复合型饮料进行感官评价，满分为100，感官评价标准见表1。
表1 复合饮料感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation of the compound beverage
项目 17 分～20 分13 分～16 分9 分～12 分 5 分～8 分 1 分～4 分甜度（20 分）甜度适中 稍偏甜 较甜 过甜 极甜酸度（20 分）酸度适中 稍偏酸 较酸 过酸 极酸香味（20 分）香味浓郁，协调香味稍淡，无异味香味淡，带少许杂味无香味，带少许刺激性气味无香味，气味刺鼻口感（20 分）酸甜可口，无苦涩味口感较好，无苦涩味口感一般，带有苦涩味口感差，苦涩味重苦涩感极度明显，难以下咽色泽（20 分）色泽纯正均匀色泽均匀 色泽均匀,局部带有少许杂色色泽局部不均匀，杂色明显色泽极不均匀，杂色很深
1.3.5 微生物指标检测
按照GB 7101—2015《食品安全国家标准饮料》要求[20]，分别检测黑莓玫瑰复合饮料中的微生物菌落总数、大肠杆菌和致病菌。
1.3.6 抗氧化活性的测定
1.3.6.1 DPPH 自由基清除率的测定
取发酵液用纯净水稀释成不同浓度，取稀释后的样品2 mL，加入0.1 mmol/L 的DPPH 溶液混合均匀后在常温25 ℃下避光反应30 min，在其最大吸收峰517 nm 处测定试液的吸光度，以无水乙醇为参比溶液，根据下式计算发酵液的DPPH 自由基清除率[21]。
式中：Ai 为2 mL 发酵液+2 mL DPPH 溶液的吸光度；Aj 为2 mL 发酵液+2 mL 无水乙醇溶液的吸光度；Ac 为2 mL 无水乙醇+2 mL DPPH 溶液的吸光度。1.3.6.2 羟基自由基清除率的测定
取发酵液用纯净水稀释成不同浓度。取稀释后的样品1.0 mL 于试管中，依次加入2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、2 mL 6 mmol/L 水杨酸，混匀后静置10 min，加入6 mmol/L H2O2 溶液2 mL，混匀后静置30 min，测定波长510 nm 处的吸光度。按下式计算羟基自由基清除率[22-24]。
式中：Aj 为加入样品后的吸光度；A0 为空白对照液的吸光度；Ai 为不加H2O2 时样品的吸光度。
1.4 工艺优化试验
1.4.1 单因素试验
以发酵复合饮料中的花色苷含量和感官评分为主要考察指标，在适宜的稀释倍数条件下，设置单因素试验分别考察玫瑰花浆与黑莓汁料液比[20 ∶50、10 ∶50、10 ∶100、10 ∶150、10 ∶200（g/mL）]、乳酸菌添加量（0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%）、发酵温度（25、30、35、40、45 ℃）、发酵时间（24、28、32、36、40 h）、起始pH 值（3、5、7、9、11）对复合饮料花色苷含量和感官评分的影响。
1.4.2 Plackett-Berman 试验设计
在单因素试验基础上，利用Minitab 17 软件进行N=11 的Plackett-Berman 试验设计，以花色苷含量为考察值，对单因素试验中的玫瑰花浆与黑莓汁料液比、乳酸菌添加量、发酵时间、发酵温度及起始pH 值，5 个因素的显著性进行考察。每个因素取3 个水平，试验因素水平设置见表2。
表2 Plackett-Berman 试验因素水平设置
Table 2 Levels of factors in Plackett-Berman design
水平因素玫瑰花浆与黑莓汁料液比/（g/mL）起始pH 值-1 10∶100 1.0 28 30 3 0 10∶150 2.0 32 35 5 1 10∶200 3.0 36 40 7乳酸菌添加量/%发酵时间/h发酵温度/℃
1.4.3 响应面试验优化发酵工艺
根据Plackett-Berman 试验的结果，选取对发酵产物中花色苷含量影响最为显著的3 个因素，利用Design Expert 软件，设计三因素三水平的响应面试验，响应面设计的因素和水平见表3。
表3 响应面设计的因素和水平
Table 3 Factors and levels in response surface design
水平 因素A 发酵温度/℃ B 发酵时间/h C 起始pH 值-1 30 28 3 0 35 32 5 1 40 36 7
1.5 数据处理
试验数据采用Excel 365 和Minitab 17 软件进行统计分析及作图，响应面试验设计及分析采用Design Expert 8.0.6 软件。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 玫瑰花浆与黑莓汁料液比对复合饮料花色苷含量和感官评分的影响
玫瑰花浆与黑莓汁料液比对复合饮料花色苷含量和感官评分的影响见图1。
图1 玫瑰花浆与黑莓汁料液比对复合饮料花色苷含量和感官评分的影响
Fig.1 Material liquid ratio of dried rose petals to blackberry juice on anthocyanin content and sensory score of compound beverage
由图1 可知，当复合饮料中黑莓汁含量逐渐增加，花色苷含量也逐渐增加，当料液比到达10 ∶150（g/mL）时，花色苷含量开始降低。感官评分结果表明，当玫瑰花浆含量较多时，复合饮料中花香味较浓郁，未体现出黑莓饮料特有的果香；随着黑莓汁比例的上升，复合饮料的酸甜感和清新感逐渐增强，但黑莓汁添加量过多，口感偏酸，不利于复合饮料的整体感官品质。因此选择玫瑰花浆与黑莓汁料液比为10 ∶150（g/mL）进行后续试验。
2.1.2 乳酸菌添加量对复合饮料花色苷含量和感官评分的影响
乳酸菌添加量对复合饮料花色苷含量和感官评分的影响见图2。
图2 乳酸菌添加量对复合饮料花色苷含量和感官评分的影响
Fig.2 Effect of lactic acid bacteria addition on anthocyanin content and sensory score of compound beverage
由图2 可知，感官评分呈先上升后下降的趋势，乳酸菌添加量对花色苷含量有较明显的影响。在乳酸菌添加量为2.0%时，花色苷含量达到最大值；随着添加量逐渐增大，复合饮料的感官评分逐渐下降，可能是因为接种量过多，菌种生长太快，酸度增加，导致产品的感官评分降低。因此选择乳酸菌添加量为2.0%进行后续试验。
2.1.3 发酵温度对复合饮料花色苷含量和感官评分的影响
发酵温度对复合饮料花色苷含量和感官评分的影响见图3。
图3 发酵温度对复合饮料花色苷含量和感官评分的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on anthocyanin content and sensory score of compound beverage
由图3 可知，不同发酵温度对复合饮料中花色苷含量影响明显，温度较低时，菌种未活化，发酵不充分；当温度为35 ℃时，花色苷含量达到最大；当温度继续上升，不利于菌种的发酵，花色苷含量不升反降。感官评分受温度影响不大，在发酵温度35 ℃时，达到最优。因此选择发酵温度为35 ℃进行后续试验。
2.1.4 发酵时间对复合饮料花色苷含量和感官评分的影响
发酵时间对复合饮料花色苷含量和感官评分的影响见图4。
由图4 可知，发酵时间对复合饮料的花色苷含量和感官评分影响明显，发酵36 h 时，感官评分最高，但在32 h 时，花色苷含量最高，有可能是随着发酵时间的延长，部分物质被分解所致。当发酵时间较短时，发酵不充分，饮料的口感不协调；当发酵时间过长，产品的风味和口感均呈现下降的趋势。因此选择发酵时间32 h进行后续试验。
图4 发酵时间对复合饮料花色苷含量和感官评分的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on anthocyanin content and sensory score of compound beverage
2.1.5 起始pH 值对复合饮料花色苷含量和感官评分的影响
起始pH 值对复合饮料花色苷含量和感官评分的影响见图5。
图5 起始pH 值对复合饮料花色苷含量和感官评分的影响
Fig.5 Effect of initial pH value on anthocyanin content and sensory score of compound beverage
乳酸菌适合在微酸的环境下生长繁殖，期间发酵速度很迅速；而花色苷在pH3～5 最稳定。由图5 可知，在pH5 的条件下进行发酵，复合饮料中花色苷含量最高，随着pH 值的增加，酵母的生长受到抑制，体系环境也不利于花色苷稳定，含量减少。感官评价方面，随着pH 值增加，体系酸度降低，饮料整体的口感苦涩，甚至气味难闻，评分明显降低。在单因素试验时选点跨度较大，在后续响应面试验时选点更精确，因此在花色苷稳定区间内选取较适宜的中位数pH4.5 作为发酵起始pH 值进行后续试验。
2.2 Plackett-Berman 试验结果
运用Minitab 17 软件分别计算各因素的效应，并对各因素效应进行t 检验，选择置信度大于95%的因素作为显著因素作进一步考察。Plackett-Berman 试验设计及结果见表4，Plackett-Berman 试验设计的各因素的系数和显著性评价见表5。
表4 Plackett-Berman 试验设计及结果
Table 4 Plackett-Berman design and results
试验序号玫瑰花浆与黑莓汁料液比乳酸菌添加量发酵温度发酵时间起始pH 值花色苷含量/（mg/L）1 1 1 1 -1 1 117.07 2 -1 -1 -1 -1 -1 149.85 3 1 1 -1 1 -1 159.22 4 1-1 -1 -1 1 93.66 5 -1 -1 1 1 1 112.39 6 1 -1 1 1 -1 163.90 7 -1 1 1 -1 1 107.71 8 -1 1 1 1 -1 163.90 9 -1 1 -1 -1 -1 135.80 10 1 1 -1 1 1 117.07 11 -1 -1 -1 1 1 98.34 12 1 -1 1 -1 -1 149.85
表5 Plackett-Berman 试验设计的各因素的系数和显著性评价
Table 5 Coefficient and significance of each factor in Plackett-Berman design
注：**表示差异极显著，p＜0.01；*表示差异显著，p＜0.05。
自变量 效应 系数 系数标准误 T 值 p 值 显著性常量 118.84 1.77 67.00 0.000玫瑰花浆与黑莓汁料液比4.97 2.48 1.77 1.40 0.211乳酸菌添加量 4.97 2.48 1.77 1.40 0.211发酵温度 9.22 4.61 1.77 2.60 0.041 *发酵时间 9.22 4.61 1.77 2.60 0.041 *起始pH 值 -41.86 -20.93 1.77 -11.80 0.000 **
由表5 可以看出，对花色苷含量有极显著影响的因素为起始pH 值（p＜0.01），有显著影响的为发酵温度和发酵时间（p＜0.05）；由T 值可判断出，玫瑰花浆与黑莓汁料液比、乳酸菌添加量、发酵温度、发酵时间与花色苷含量呈正效应，在其水平范围内与花色苷含量呈正相关；起始pH 值与花色苷含量呈负效应，在其水平范围内与花色苷含量呈负相关。因此选定起始pH 值、发酵温度、发酵时间为变量因素进行后续响应面优化试验。
2.3 响应面优化试验
根据Plackett-Berman 试验结果，选定起始pH 值、发酵温度、发酵时间为变量因素，运用Design Expert 8.0.6 软件，单因素试验中的花色苷含量最大值为中心点，设计三因素三水平的响应面试验，试验设计及结果见表6。
表6 显著因素最优水平响应面设计及结果
Table 6 Response surface design for significant factors and results
序号 A 发酵温度 B 发酵时间 C 起始pH 值 花色苷含量/（mg/L）1 0-1 1 86.666 7 158.993 3 0 0 0 158.32 2 0 0 0 4 1 -1 0 118.886 5 0 1 1 92.899 6 -1 0 1 73.356 7 1 0-1 145.394 91.38 9 -1 1 0 100.892 10 0 0 0 157.23 11 0 0 0 158.367 12 1 1 0 122.987 13 0 0 0 158.997 14 0 -1 -1 142.899 15 -1 -1 0 99.632 16 0 1 -1 140.978 17 -1 0 -1 128.246 8 1 0 1
利用Design Expert 8.0.6 软件进行多元回归拟合，得到试验因素和花色苷含量的二次多项回归方程为Y =158.381 40+9.565 13A+1.20 904B-26.651 91C+0.710 250AB+0.219 000AC+2.038 32BC-27.024 41A2-20.757 74B2-21.762 99C2。
响应面试验方差分析结果见表7。
表7 响应面试验方差分析
Table 7 ANOVA for response surface design
注：**表示差异极显著，p＜0.01；*表示差异显著，p＜0.05。
来源 平方和 自由度 均方 F 值 p 值 显著性模型 14 122.38 9 1 569.15 1 141.03 ＜0.000 1 **A 发酵温度 731.93 1 731.93 532.23 ＜0.000 1 **B 发酵时间 11.69 1 11.69 8.50 0.022 5 *C 起始pH 值5 682.60 1 5 682.60 4 132.16 ＜0.000 1 **AB 2.02 1 2.02 1.47 0.265 1 AC 0.19 1 0.19 0.14 0.719 8 BC 16.62 1 16.62 12.08 0.010 3 *A2 3 075.03 1 3 075.03 2 236.04 ＜0.000 1 **B2 1 814.25 1 1 814.25 1 319.25 ＜0.000 1 **C2 1 994.22 1 1 994.22 1 450.12 ＜0.000 1 **残差 9.63 7 1.38失拟 7.54 3 2.51 4.83 0.081 2 不显著纯误差 2.08 4 0.52总和 14 132.00 16
由表7 可知，回归方程模型p 值＜0.000 1，R2 值为0.998 7，R2Adj 值为0.998 4，说明模型能解释99.84%的变化，能很切合地反映实际情况，试验方法有效；失拟项p 值为0.081 2，大于0.05，失拟不显著，证明模型与试验值的差异较小，证明该方程能准确预测试验结果。由方差分析结果可知，3 个因素对响应值的影响顺序为起始pH 值＞发酵温度＞发酵时间。复合饮料中花色苷含量与A、C、A2、B2、C2 具有极显著相关性（p＜0.01）；与B、BC 具有显著相关性（p＜0.05）；发酵时间和发酵温度交互项、发酵温度和起始pH 值交互项对花色苷含量影响不显著（p＞0.05）。
通过响应面三维图及等高线图可预测和检验自变量的响应值和自变量之间的关系[21]。各因素交互作用对花色苷含量的响应面及等高线见图6。
图6 各因素交互作用对花色苷含量的响应面及等高线
Fig.6 Response surface and contour line of interaction of various factors on anthocyanin content
由图6 可知，发酵时间和发酵温度的等高线趋于圆形，故发酵时间和发酵温度的交互作用不明显；发酵温度和起始pH 值的等高线呈椭圆形，说明发酵温度和起始pH 值具有一定的交互作用；发酵时间和起始pH 值的交互等高线椭圆状较明显，说明发酵时间和起始pH 值交互作用较明显。
经系统分析得到复合饮料的最佳发酵工艺条件为发酵温度36.85 ℃、发酵时间32.06 h、起始pH 值4.56、玫瑰花浆与黑莓汁料液比10 ∶150（g/mL）、乳酸菌添加量2.0%，该条件下制备的发酵饮料的花色苷含量预测值为163.08 mg/L；为方便操作，将最佳发酵工艺条件调整为发酵温度37 ℃、发酵时间32 h、起始pH值4.5、玫瑰花浆与黑莓汁料液比10 ∶150（g/mL）、乳酸菌添加量2.0%。在此优化发酵工艺条件下进行复合饮料的制备，平行进行3 次试验，验证试验产品中花色苷含量为（160.23±2.35）mg/L，与预测值的绝对百分比偏差为1.78%，与预测值较为吻合，证明利用响应面法可以有效地优化黑莓玫瑰复合饮料的发酵工艺。
2.4 复合饮料品质分析
感官评价结果显示，最佳发酵工艺条件下制备的复合饮料色泽均匀，呈深紫红色，澄清透明，无分层现象，酸甜爽口，具有独特的黑莓和玫瑰风味。菌落总数小于1 CFU/mL，大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌未检出。
2.5 复合饮料抗氧化活性检测结果
复合饮料的DPPH 自由基及羟基自由基清除率见图7。
图7 复合饮料的DPPH·及·OH 清除率
Fig.7 DPPH·and·OH scavenging rates of compound beverage
由图7A 可知，在样品体积不超过0.13 mL 时，复合饮料和对照物VC 的DPPH 自由基清除率随样品体积的增加而提升；超过0.13 mL 后，样品体积增加对自由基清除率的提升作用不明显；当样品体积达到0.21 mL时，清除率分别达到95.21%和96.54%，复合饮料的DPPH 自由基清除率略低于对照物VC。由图7B 可知，在样品体积不超过0.15 mL 时，复合饮料和对照物VC的羟基自由基清除率随样品体积的增加而提升；超过0.15 mL 后，样品体积增加对自由基清除率的提升作用不明显；当样品体积达到0.21 mL 时，清除率分别达到95.84%和97.04%，复合饮料的羟基自由基清除率略低于对照物VC。综上，此复合饮料具有一定的DPPH 自由基及羟基自由基清除效果。
3 结论
通过响应面分析试验，得到黑莓玫瑰复合饮料的最佳发酵工艺条件为发酵温度37 ℃、发酵时间32 h、发酵起始pH 值4.5、玫瑰花浆与黑莓汁料液比10 ∶150（g/mL）、乳酸菌添加量2.0%，在此条件下，复合饮料的花色苷含量为160.23 mg/L；制备的复合饮料色泽均匀，呈深紫红色，澄清透明，无分层现象，酸甜爽口，具有独特的黑莓和玫瑰风味；DPPH 自由基及羟基自由基清除率为95.21%和95.84%，具有一定的体外抗氧化活性。本研究有利于黑莓玫瑰复合功能饮料的发酵工艺创新，为以后的研究开发提供依据。
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