链格孢霉菌是导致水果、蔬菜及冷藏食品腐败变 质的主要微生物，也是引起枸杞鲜果采后腐烂的最主要病原菌[1]。面对链格孢霉菌的侵害，杨文博等[2]研究表明乙酸乙酯部位是挖掘楼葱功能活性物质的主要极性部位，且楼葱中的多酚和类黄酮物质含量对链格孢霉菌的抑菌活性有明显影响；陈伟[3]利用马铃薯糖苷生物碱的抑菌作用有效地抑制了枸杞鲜果采后链格孢霉菌的生长；Daradka 等[4]发现皂苷、黄酮类、生物碱、酚类和类固醇等脂溶性物质含量较高的植物提取物对番茄链格孢霉菌有明显的抑制效果；Bellumori 等[5]研究表明，萜类化合物和迷迭香酸对链格孢霉菌的生长有明显抑制作用。
楼葱（Allium fisulosum L.var.viviparum Makino），葱科葱属，多年生草本植物，其含有机硫化物、黄酮类、酚类以及皂苷类等具有抑菌活性的物质[6-7]。葱属植物中的抑菌成分大部分为脂溶性物质，含硫化合物会破坏细胞膜完整性，导致细胞死亡[8-9]；皂苷与微生物膜中的甾醇形成复合物，致使细胞受损而死亡[10]；酚类物质能使生物细胞壁及细胞膜破碎、内容物扩散，使细胞内外物质与信息的传递失衡而起到抑制微生物生长的作用[11]。国内外学者对葱属植物的活性成分及药理作用已进行大量研究，邢利沙[12]通过提取大蒜脂溶性成分并探究其生物活性，表明大蒜脂溶性成分中含有烯丙基一硫化物、烯丙基二硫化物和烯丙基三硫化物等含硫化合物；Hidayah 等[13]研究表明，洋葱提取物中的酚类和黄酮类化合物含量能影响沙门氏菌和大肠杆菌的抗菌活性。楼葱与其他葱类性味相似，但其香辛味更浓郁，含大量葱蒜辣素等脂溶性物质，具有杀菌作用；但楼葱中脂溶性物质的抑菌活性鲜有报道，优化其提取条件，研究其生物活性对充分开发利用楼葱具有重要意义。
本文以楼葱假茎部位为材料，通过酶辅助有机溶剂萃取法，提取楼葱中脂溶性成分。采用正交试验对脂溶性成分的提取条件中的料液比、加酶量、酶解时间和萃取时间进行优化，以达到更高的脂溶性物质得率，并分析脂溶性提取物对枸杞源链格孢霉菌的抑制作用，为楼葱脂溶性提取物的进一步开发研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
链格孢霉菌（Alternaria alternata），从枸杞鲜果上分离；楼葱：产自宁夏银川市；果胶酶（500 U/mg）、纤维素酶（50 U/mg）：上海源叶科技生物有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）：青岛科技工业园海博生物技术有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
RE-2000A 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；HHS-4S 恒温水浴锅：上海宜昌仪器沙筛厂；BCM-1600A 超净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；SCIENTZ-100F/A 真空冷冻干燥机：宁波新芝冻干设备股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 楼葱预处理
楼葱经筛选去杂，真空冷冻干燥22 h 后，粉碎研磨过40 目筛，干燥密封，于4 ℃冰箱保存。
1.3.2 楼葱中脂溶性物质的提取
准确称取楼葱粉末5 g，加水浸泡后加入酶（纤维素酶∶果胶酶=1 ∶1，质量比）在45 ℃下酶解一定时间后，80 ℃灭酶10 min，加入200 mL 无水乙醇浸提12 h，加入饱和NaCl 盐析使油水分离，减压蒸馏去除无水乙醇，加入乙酸乙酯萃取一定时间后，分液漏斗分离乙酸乙酯，萃取3 次后合并萃取液，减压蒸馏挥发有机溶剂，最终得到绿色膏状的楼葱脂溶性提取物。称重计算其得率后于4 ℃冰箱密封保存。利用下列公式计算楼葱脂溶性提取物得率。
式中：R 为得率，%；m1 为脂溶性提取物质量，g；m2为楼葱粉末质量，g。
1.4 单因素试验
确定200 mL 无水乙醇作为提取液、酶解温度45 ℃时，分别考察不同料液比[1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL）]、加酶量（0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%）、酶解时间（30、40、50、60、70 min）、萃取时间（12、24、36、48、60 h）对提取楼葱脂溶性物质得率的影响，每次试验重复3 次。
1.5 正交试验
根据单因素试验结果，以楼葱脂溶性物质得率为考察指标，对料液比、加酶量、酶解时间、萃取时间4 个因素进行考察，进行L9（34）正交试验，确定其最佳提取条件。因素水平见表1。
表1 楼葱脂溶性物质提取正交设计的因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal design for extraction of fat soluble compositions of Allium fisulosum
水平 A 料液比/D 萃取时间/h 1 1∶30 0.1 40 12 2 1∶40 0.2 50 24 3 1∶50 0.3 60 36（g/mL） B 加酶量/% C 酶解时间/min
1.6 抑菌试验
1.6.1 制备菌悬液
将保存于-80 ℃的链格孢霉菌株冻存管解冻后，从中挑取少量菌液接种于PDA 固体培养基，于28 ℃培养48 h 后，挑取长势良好的菌株转移至PDA 斜面固体培养基，于28 ℃培养36 h 后，加入无菌生理盐水振荡洗菌，调整浓度至105 cfu/mL，备用。
1.6.2 楼葱提取物抑菌圈的测定
采用滤纸片法测定楼葱提取物的抑菌圈[14]。称取0.3 g 楼葱脂溶性提取物，超声辅助溶解于30 mL 0.5%二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液中，配制成10 mg/mL 楼葱脂溶性提取物原液。将直径为6 mm 的灭菌滤纸片浸泡于楼葱脂溶性提取物原液中12 h，取出后在无菌条件下晾干备用。各取100 μL 菌种悬浮液涂布于PDA 固体培养基，在固体培养基上放置含有楼葱脂溶性物质的滤纸片4 片，同时用0.5%DMSO 设置对照组，每组待测溶液设置3 组平行，放入4 ℃冰箱扩散12 h，于28 ℃培养24 h 后，采用十字交叉法测量抑菌圈直径（D）[15]。
1.6.3 最小抑菌浓度的测定
参照Zhou 等[16]的二倍稀释法并稍作修改。称取楼葱脂溶性提取物添加到已灭菌的PDA 培养基中，摇匀，制成浓度为0、0.625、1.250、2.500、5.000 mg/mL 的培养基，加入100 μL 105 cfu/mL 菌悬液，涂布，于28 ℃培养24 h 后，以完全无菌生长的最高稀释度为最小抑菌浓度（minimal inhibit concentration，MIC）。每个浓度梯度做3 个平行。
1.7 数据处理
每个试验数据均为3 次重复试验的平均值。应用Microsoft Excel 2019 和GraphPad Prism 软件进行数据统计和方差分析，利用Origin 2019 软件作图，试验数据以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 不同因素对楼葱脂溶性物质得率的影响
2.1.1 料液比对楼葱脂溶性物质得率的影响
料液比是影响提取效率的重要因素之一，适当的料液比不仅能使提取效率提升，也可减少浪费和节省成本。料液比对楼葱脂溶性物质得率的影响见图1。
图1 不同料液比对楼葱脂溶性物质得率的影响
Fig.1 The effect of different material-liquid ratios on the yield of the fat soluble compositions of Allium fisulosum
由图1 可知，随着溶剂体积的增大，楼葱脂溶性物质得率先上升后趋于平缓。在料液比1 ∶20（g/mL）～1 ∶40（g/mL），楼葱脂溶性物质得率呈快速增长趋势，这主要是因为传质动力随着溶剂量的增加而增加[17]，楼葱脂溶性成分更容易溶出。当料液比超过1 ∶40（g/mL）后，楼葱脂溶性提取物随溶剂体积增长缓慢，说明楼葱脂溶性物质已经被充分提取，再增加溶剂其得率不会增高。实际试验过程中，提取液过少时，不利于后续的分离工作；而溶剂用量过多时，会使后续的浓缩工艺耗时长、耗能多。因此，本试验确定1 ∶40（g/mL）为最佳提取料液比。
2.1.2 加酶量对楼葱脂溶性物质得率的影响
酶可水解植物细胞壁，其存在有助于释放被束缚在细胞壁里的活性物质[11]，同时可将脂蛋白和脂多糖分解成更简单的分子，以促进更多脂溶性物质被提取出来[18]。加酶量对楼葱脂溶性物质得率的影响见图2。
图2 不同加酶量对楼葱脂溶性物质得率的影响
Fig.2 The effect of different amounts of enzymes on the yield offat soluble compositions in Allium fisulosum
由图2 可知，楼葱脂溶性提取物得率随着加酶量的增加先上升后趋于平缓。当加酶量小于0.2%时，楼葱脂溶性物质得率随加酶量的增加而上升，这是由于酶水解楼葱细胞壁，使楼葱中脂溶性物质被释放；当加酶量超过0.2%时，随加酶量的增加，楼葱脂溶性物质的得率增长缓慢，几乎与加酶量为0.2%时持平，说明楼葱脂溶性物质已被酶解，楼葱粉末的细胞壁被破碎完全。因此，本试验确定0.2%为最佳加酶量。
2.1.3 酶解时间对楼葱脂溶性物质得率的影响
酶在最佳条件下能使楼葱充分酶解，从而释放更多活性物质，较短的酶解时间可能不足以导致细胞壁破裂，较长时间会使其挥发性物质损失导致脂溶性提取物提取率降低[19]。酶解时间对楼葱脂溶性物质得率的影响见图3。
图3 不同酶解时间对楼葱脂溶性物质得率的影响
Fig.3 The effect of different amounts of enzymes on the yield of fatsoluble compositions in Allium fisulosum
由图3 可知，随着酶解时间的延长，楼葱脂溶性物质得率呈先上升后下降趋势。当酶解时间小于50 min，楼葱脂溶性物质得率随酶解时间的延长呈上升趋势，这是由于楼葱中的活性物质随着酶解时间的延长被释放出来；50 min～60 min 增长缓慢几乎持平，这主要是由于楼葱中的有效成分在50 min 时基本被提取出来；当酶解时间超过60 min 后，楼葱脂溶性物质得率随酶解时间的延长而降低，因为过长的酶解时间可能会由于挥发物的损失进而导致楼葱脂溶性物质得率降低。因此，本试验确定50 min 为最佳酶解时间。
2.1.4 萃取时间对楼葱脂溶性物质得率的影响
萃取时间对楼葱脂溶性物质得率的影响见图4。
图4 不同萃取时间对楼葱脂溶性物质得率的影响
Fig.4 The effect of different extraction times on the yield offat soluble compositions in Allium fisulosum
由图4 可知，楼葱脂溶性物质得率随着萃取时间的延长先上升后趋于平缓。24 h 之前，楼葱脂溶性物质得率随萃取时间的延长而迅速增加，这是由于萃取过程中浓度差引起的扩散力逐渐增大，脂溶性成分快速溶出，脂溶性物质得率随即快速升高。在24 h 后，楼葱脂溶性物质得率趋于平缓，这是由于渗透压达到平衡时，脂溶性成分基本被提取完全，得率不再升高[20]。因此，本试验确定24 h 为最佳萃取时间。
2.2 正交试验结果分析
正交试验结果见表2。
表2 楼葱脂溶性物提取得率正交试验结果
Table 2 Orthogonal test table of extraction rate offat soluble compositions of Allium fisulosum
试验号 A 料液比 B 加酶量C 酶解时间D 萃取时间 得率/%1 1 1 1 1 4.73±0.31 2 1 2 2 2 5.27±0.12 3 1 3 3 3 5.67±0.12 4 2 1 2 3 5.83±0.06 5 2 2 3 1 5.79±0.32 6 2 3 1 2 6.15±0.21 7 3 1 3 2 5.74±0.12 8 3 2 1 3 6.01±0.20 9 3 3 2 1 5.89±0.21 K1 15.67 16.30 16.89 16.41 K2 17.77 17.07 16.84 17.16 K3 17.64 17.71 17.20 17.51 k1 5.223 5.433 5.630 5.470 k2 5.923 5.690 5.663 5.720 k3 5.880 5.903 5.733 5.837 R 0.700 0.470 0.103 0.367主次顺序 A＞B＞D＞C
由表2 可知，4 个因素影响顺序为A＞B＞D＞C，即料液比对楼葱脂溶性物质得率影响最大，其次是加酶量、萃取时间，最后是酶解时间。通过比较k 值可知，最优组合为A2B3C3D3，即料液比1 ∶40（g/mL）、加酶量0.3%、酶解时间60 min、萃取时间36 h，由于该条件不在正交试验9 次试验中，因此，需进一步进行验证试验。
2.3 方差分析及最优工艺试验验证
楼葱脂溶性物质得率的方差分析见表3。
表3 楼葱脂溶性物质得率的方差分析
Table 3 Variance analysis of the yield offat soluble compositions in Allium fisulosum
注：*表示差异显著（P＜0.05）。
因素 偏差平方和 自由度 F 比 F 临界值 显著性1 0.923 2 54.294 19.000 *2 0.332 2 19.529 19.000 *3 0.017 2 1.000 19.000 4 0.211 2 12.412 19.000误差 0.02 2
由表3 可知，以上4 个因素对楼葱脂溶性得率的影响顺序为料液比＞加酶量＞萃取时间＞酶解时间，此结果与极差分析结果一致。
为进一步验证最优工艺可靠性，对A2B3C3D3 和A2B3C1D2 进行对比验证，3 组平行试验验证，得率分别为（6.33±0.24）%和（6.07±0.11）%。验证试验楼葱脂溶性物质得率优于正交表中得率，所以确定最优工艺试验组合为A2B3C3D3，即料液比1 ∶40（g/mL）、加酶量0.3%、酶解时间60 min、萃取时间36 h，此时得率为（6.33±0.24）%。
2.4 楼葱脂溶性物质抑菌活性测定结果
2.4.1 抑菌圈测定结果
楼葱脂溶性物质对链格孢霉菌的抑制圈直径测定结果见表4。
表4 楼葱脂溶性提取物对链格孢霉菌的抑制效果
Table 4 Effect of the antibacterial of thefat soluble substances of Allium fisulosum against Alternaria alternata
注：-表示无抑菌效果；+表示有抑菌效果。
组别 抑菌效果 抑菌圈直径/mm 平均抑菌圈直径/mm 0.5%DMSO - 0 0平行组1 + 19.25±1.92 19.58±0.31平行组2 + 19.50±2.69平行组3 + 20.00±1.87
由表4 可知，对照组（0.5%DMSO）无抑菌圈，说明0.5%DMSO 溶剂对链格孢霉菌无抑菌作用。试验组中楼葱脂溶性物质对链格孢霉菌的平均抑菌圈直径为（19.58±0.31）mm，说明楼葱脂溶性物质对链格孢霉菌的抑制效果明显。楼葱脂溶性物质采用65 ℃和78 ℃下减压浓缩方式进行制备，其中的乙醇和乙酸乙酯溶液基本挥发完全，因此由乙醇和乙酸乙酯产生的抑菌效果可以忽略不计。
2.4.2 最小抑菌浓度（MIC）的测定结果
楼葱脂溶性物质对链格孢霉菌的最小抑菌浓度见图5。
图5 楼葱脂溶性物质对链格孢霉菌的最小抑菌浓度
Fig.5 The minimum antibacterial concentration of the fat soluble substance of Alliumfi sulosum against Alternaria alternata
由图5 可知，楼葱脂溶性物质对链格孢霉菌有明显抑制作用，并且两者呈正相关，抑菌作用随着脂溶性物质浓度的增大而增强，这与文献报道的楼葱活性物质对链格孢霉菌具有一定抑菌活性相一致[2]。当楼葱脂溶性物质浓度为0.625 mg/mL 时，培养基上菌落明显减少，表明低浓度的脂溶性物质有抑菌效果，但无法完全抑制链格孢霉菌生长；当脂溶性提取物的浓度达到1.250 mg/mL 时，培养基上无菌落生长，表明高浓度楼葱脂溶性提取物对链格孢霉菌有明显抑制效果，可完全抑制链格孢霉菌的生长。综上，楼葱脂溶性物质对枸杞源链格孢霉菌的最小抑菌浓度（MIC）为1.250 mg/mL，相比于文献，楼葱脂溶性物质的最小抑菌浓度（1.250 mg/mL）远低于大葱最小抑菌浓度（125 mg/mL）及洋葱最小抑菌浓度（250 mg/mL）[21]。
3 结论
采用正交试验优化提取楼葱脂溶性物质的最优条件为料液比1 ∶40（g/mL）、加酶量0.3%、酶解时间60 min、萃取时间36 h，此时得率为（6.33±0.24）%。抑菌试验结果表明，楼葱脂溶性物质对链格孢霉菌有较强的抑菌效果，当楼葱脂溶性物质浓度为10 mg/mL时，平均抑菌圈直径可达（19.58±0.31）mm，最小抑菌浓度为1.250 mg/mL。因此，该结果可为楼葱脂溶性物质被作为一种新型天然抑菌剂应用于果蔬采后保鲜提供参考。
[1] 王晓,徐小迪,陈勇,等.宁夏枸杞鲜果采后病原菌的分离、鉴定及水杨酸的抑病效果研究[J].食品安全质量检测学报,2018,9(22):5837-5842.WANG Xiao, XU Xiaodi, CHEN Yong, et al. Isolation and identification of postharvest pathogens in fresh wolfberry from Ningxia and the inhibitory effect of salicylic acid[J]. Journal of Food Safety ＆Quality,2018,9(22):5837-5842.
[2] 杨文博,张强,刘慧,等.楼葱不同极性提取液对水果采后病原菌的抑菌活性[J].保鲜与加工,2021,21(6):12-18.YANG Wenbo,ZHANG Qiang,LIU Hui,et al.Antimicrobial activity of different polar extracts of storeyonion (Allium cepa Linn. var.proliferum regel) on postharvest pathogens of fruits[J]. Storage and Process,2021,21(6):12-18.
[3] 陈伟.马铃薯糖苷生物碱对枸杞鲜果采后诱导抗病性及保鲜作用研究[D].兰州:甘肃农业大学,2018.CHEN Wei.Study on induced resistance to postharvest disease and its fresh-keeping effect of potato glycoalkaloids on Lycium barbarum L.fresh fruits[D].Lanzhou:Gansu Agricultural University,2018.
[4] DARADKA H M, SALEEM A, OBAID W A. Antifungal effect of different plant extracts against phytopathogenic fungi Alternaria alternata and Fusarium oxysporum isolated from tomato plant[J].Journal of Pharmaceutical Research International,2021:188-197.
[5] BELLUMORI M, INNOCENTI M, CONGIU F, et al. Within-plant variation in Rosmarinus officinalis L.terpenes and phenols and their antimicrobial activity against the rosemary phytopathogens Alternaria alternata and Pseudomonas viridiflava[J].Molecules(Basel,Switzerland),2021,26(11):3425.
[6] 方海田,刘慧燕,张光弟,等.宁夏3 种葱属蔬菜的挥发性成分比较分析[J].中国调味品,2018,43(11):145-149.FANG Haitian, LIU Huiyan, ZHANG Guangdi, et al. Comparative analysis of volatile components in three alliaceous vegetables in ningxia[J].China Condiment,2018,43(11):145-149.
[7] 方海田,杨亚丽,李金娜,等.同心红葱主要营养成分及抗氧化活性分析[J].现代食品,2018(19):116-119.FANG Haitian,YANG Yali,LI Jinna,et al.Comparison of nutrition composition and antioxidant activity of several Allium fistulosum L.var.viviparummakino in Tongxin County[J].Modern Food,2018(19):116-119.
[8] PETROPOULOS S,et al.Antimicrobial and antioxidant properties of various Greek garlic genotypes[J].Food Chemistry,2018,245:7-12.
[9] CHEN C.Broad-spectrum antimicrobial activity,chemical composition and mechanism of action of garlic (Allium sativum) extracts[J].Food Control,2018,86:117-125.
[10] GOULD G W.New methods of food preservation[M].Boston:Springer US,1995.
[11] BOULILA A. Enzyme-assisted extraction of bioactive compounds from bay leaves (Laurus nobilis L.)[J]. Industrial Crops and Products,2015,74:485-493.
[12] 邢利沙.大蒜脂溶性成分及其生物活性的研究[D].天津:天津大学,2015.XING Lisha. Studies on the liposoluble constituents of garlic and their bioactivities[D].Tianjin:Tianjin University,2015.
[13] HIDAYAH R, PURWANTI S, JAMILAH J. Anti-bacterial activity of Dayak onions extract (Eleutherine palmifolia) against Salmonella spp and Escherichia coli[J]. IOP Conference Series: Earth and Environmental Science,2021,788(1):012069.
[14] 李亚蕾,罗瑞明.沙葱提取物抗菌效果的研究[J].安徽农业科学,2008,36(33):14596-14597,14618.LI Yalei, LUO Ruiming. Study on antibacterial effect of extracts from Allium mongolicum regel[J].Journal of Anhui Agricultural Sciences,2008,36(33):14596-14597,14618.
[15] 郭俊花,张增帅,马欣,等.11 种食药同源植物提取物对果蔬常见腐败菌的抑菌活性研究[J].天然产物研究与开发,2019,31(12):2025-2031.GUO Junhua, ZHANG Zengshuai, MA Xin, et al. Study on the antimicrobial effect of 11 kinds of edible and medicinal plant extracts on common spoilage microorganisms in fruits and vegetables[J].Natural Product Research and Development,2019,31(12):2025-2031.
[16] ZHOU Y Y,LI C,FENG B,et al.UPLC-ESI-MS/MS based identification and antioxidant, antibacterial, cytotoxic activities of aqueous extracts from storey onion(Allium cepa L.var.proliferum Regel)[J].Food Research International,2020,130:108969.
[17] 易宇文,岳琪峰,刘阳,等.不同植物提取液对泡菜生花酵母的抑制作用探究[J].食品工业,2019,40(8):191-195.YI Yuwen,YUE Qifeng,LIU Yang,et al.Study on the inhibitory effect of different plant extracts on flowering yeast of pickles[J]. The Food Industry,2019,40(8):191-195.
[18] LI F,et al.Optimization of enzymatic pretreatment for n-hexane extraction of oil from Silybum marianum seeds using response surface methodology[J].Food and Bioproducts Processing,2012,90(2):87-94.
[19] 张耕,周银波,张长弓,等.酶解对鲜葱白中含硫化合物的影响[J].中国医院药学杂志,2010,30(21):1826-1828.ZHANG Geng, ZHOU Yinbo, ZHANG Changgong, et al. Studies on the impact of enzymolysis on the sulfur compounds of fistular onion stalk[J].Chinese Journal of Hospital Pharmacy,2010,30(21):1826-1828.
[20] 解修超,刘军生,罗阳兰,等.白及花脂溶性成分提取工艺优化及其生物活性分析[J].食品工业科技,2019,40(4):200-206.XIE Xiuchao, LIU Junsheng, LUO Yanglan, et al. Optimization of extraction process of liposoluble components in Bletilla striata flower and its biological activity[J].Science and Technology of Food Industry,2019,40(4):200-206.
[21] 周燕燕.百合科红葱水提物化学成分及体外活性研究[D].西安:西北大学,2020.ZHOU Yanyan.Study on the chemical compositions and in vitro activities of aqueous extracts from Liliaceae storey onion[D].Xi'an:Northwest University,2020.