蕨根为凤尾蕨科植物的根茎，又叫乌角、小角，广泛生长于热带、亚热带以及温带地区。我国是世界上蕨类植物资源最丰富的国家之一[1]。食用蕨类植物富含蛋白质、氨基酸、维生素、粗纤维和微量元素，以及酚类、黄酮类和生物碱等活性物质，具有较高的营养价值和药用价值[2]。蕨根中淀粉含量达20%～25%，但目前对其研究仅局限于基本特性测定，对分子结构和抗消化特性相关的研究较少[3-4]。研究表明，随着直链淀粉含量的增加，其淀粉糊在低温环境下越容易老化形成抗性淀粉[5]。蕨根淀粉中直链淀粉含量为25.4%，高于玉米淀粉的20.3%[6]，这为蕨根抗性淀粉的制备提供了依据。
抗性淀粉（resistant starch，RS）是一种与传统膳食纤维相似，不能被小肠消化吸收，而是在大肠中被肠道菌群发酵降解的物质。抗性淀粉能够调节肠道菌群的组成，并降解生成短链脂肪酸，对肠道起有效的保护作用[7]。此外，抗性淀粉在调节血糖水平、控制脂质代谢和预防营养疾病等方面能够发挥有益功效[8]。目前，抗性淀粉的制备方法主要有湿热法、高压灭菌法、微波法、超声波法、酸水解法以及酶解法等[9]。
近年来，微波技术由于其高效节能、安全环保等优点，在食品工业中的应用越来越广泛。微波加热能够使食品中的水分在短时间内迅速蒸发汽化，造成体积膨胀，产生膨化效应[10]。微波处理还能够有效降低淀粉分子的膨胀度、黏度以及溶解度，导致直链和支链淀粉的分支降解成短链，促进在老化阶段的结晶，提高淀粉的抗消化性[9]。与传统蒸煮食品加工方式相比，微波处理对营养素的影响更小[11-12]。目前，微波在食品中的应用主要集中于干燥以及加热杀菌等方面[13-14]，而对食品营养成分和品质的变化研究有限。
因此，本研究以蕨根淀粉为试验材料，采用微波法制备蕨根抗性淀粉，优化微波法制备抗性淀粉的工艺条件，分析微波处理条件对抗性淀粉含量的影响规律，以期为蕨根淀粉的开发利用和抗性淀粉制备提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
蕨根粉：市售；耐高温α-淀粉酶（500 U/mg～1 500 U/mg）：上海北诺生物科技有限公司；糖化酶（10万U/g）：北京奥博星生物技术有限责任公司。所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
DHG-9146A 型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；Spectrum 721 型可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；ESJ200-4 电子天平：沈阳龙腾电子有限公司；SHA-C 恒温振荡水浴锅：常州国华电器有限公司；雷磁PHS-3C 精密pH 计：上海精密科学仪器有限公司；KDC-40 低速离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司；FW100 型高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；JSM-6360LV 型扫描电镜：日本电子株式会社；WD800B 微波炉：广东格兰仕集团有限公司。
1.3 蕨根抗性淀粉的制备
蕨根淀粉采用湿法由蕨根粉中提取[15]，淀粉含量90%，符合试验要求。准确称取蕨根淀粉，与水以一定比例混合，置于微波炉中，调节至设定功率下处理一段时间，25 ℃室温条件下自然冷却，然后置于4 ℃放置24 h，取出将其在25 ℃室温下放置6 h，随后80 ℃干燥20 h，粉碎过60 目筛，即得蕨根抗性淀粉。
1.4 单因素试验设计
1.4.1 淀粉乳浓度对抗性淀粉形成的影响
准确称取20 g 蕨根淀粉5 份，分别配成20%、30%、40%、50%、60%的淀粉乳溶液，置于320 W 微波功率下处理2 min，25 ℃室温下自然冷却。4 ℃下回生24 h，取出后于25 ℃室温下放置6 h，80 ℃干燥20 h，粉碎过CQ20 号筛，收集筛下物备用分析。
1.4.2 微波功率对抗性淀粉形成的影响
准确称取20 g 蕨根淀粉5 份，配成30%的淀粉乳溶液，分别在160、320、480、640、800 W 功率的微波下处理2 min，25 ℃室温下自然冷却。4 ℃下回生24 h，后续处理同1.4.1。
1.4.3 微波时间对抗性淀粉形成的影响
准确称取20 g 蕨根淀粉5 份，配成30%的淀粉乳溶液，随后置于320 W 功率的微波下分别处理1、2、3、4、5 min，25 ℃室温下自然冷却。4 ℃下回生24 h，后续处理同1.4.1。
1.4.4 回生温度对抗性淀粉形成的影响
准确称取20 g 蕨根淀粉4 份，配成30%的淀粉乳溶液，随后置于320 W 微波功率下处理2 min，25 ℃室温下自然冷却后，分别置于-30、-10、4、25 ℃下回生24 h，后续处理同1.4.1。
1.4.5 回生时间对抗性淀粉形成的影响
准确称取20 g 蕨根淀粉5 份，配成30%的淀粉乳溶液，随后置于320 W 微波功率下处理2 min，25 ℃室温下自然冷却后置于4 ℃下分别回生4、12、20、24、36 h，后续处理同1.4.1。
1.5 Box-Behnken 试验设计
在单因素试验的基础上，选取微波时间、微波功率、淀粉乳浓度为试验因素，以蕨根抗性淀粉含量为响应指标，设计Box-Behnken 试验。因素水平编码见表1。每个试验组合重复试验2 次，取其平均值作为含量结果。
表1 Box-Behnken 设计因素及水平
Table 1 Box-Behnken design factors and levels
水平 因素X1 微波时间/min X2 微波功率/W X3 淀粉乳浓度/%-1 1 160 20 0 2 320 30 1 3 480 40
1.6 抗性淀粉含量的测定
采用TSA 法测定抗性淀粉含量[16]。称取0.5 g 干燥样品于45 mL 离心管中，并加入10 mL 磷酸盐缓冲液（pH6.4）和1 mL 耐高温α-淀粉酶溶液，涡旋振荡使其充分混匀，随后置于90 ℃下恒温振荡（220 r/min、30 min）。取出后冷却至25 ℃室温，4 000 r/min 离心20 min，弃去上清液。随后向离心管中加入20 mL 蒸馏水，涡旋振荡使沉淀被充分洗涤，4 000 r/min 离心20 min，弃上清液。向离心管中加入6 mL 2 mol/L KOH溶液，25 ℃室温下振荡30 min，促进沉淀溶解，再用2 mol/L HCl 溶液调节pH 值至中性。加入5 mL 醋酸盐缓冲液（pH4.5）和1 mL 糖化酶，60 ℃水浴反应1 h。取出后冷却至25 ℃，4 000 r/min 离心20 min，收集上清液并置于50 mL 容量瓶中。随后用20 mL 蒸馏水洗涤沉淀，4 000 r/min 离心20 min，收集上清液，合并上清液，定容至50 mL 并充分混匀。从容量瓶中移取1 mL定容溶液于20 mL 刻度试管，并加蒸馏水1 mL、3，5-二硝基水杨酸1.5 mL，在沸水浴中加热反应5 min，冷却至室温25 ℃，加水定容至20 mL，并于540 nm 处测定吸光度。按同样的方法制备空白对照进行测定。RS 含量计算公式如下。
式中：A1 为样品中还原糖含量，mg；A0 为空白对照中还原糖含量，mg；V0 为定容体积，mL；V1 为测定时取用液的体积，mL；M 为样品绝对干重，g；0.9 为淀粉与葡萄糖的转换系数。
1.7 形貌观察
取少量蕨根原淀粉、抗性淀粉样品均匀分散在双面胶上，固定在样品台并进行喷金处理，将处理后样品保存于干燥器中。测试时将样品置于扫描电子显微镜下观察，拍摄具有代表性颗粒形貌照片。
1.8 数据处理与分析
所有数据均为2 次试验结果的平均值，P＜0.05 表示数据间具有显著差异。使用软件Minitab18 分析数据的差异显著，软件Microsoft Excel 2019 进行图形的绘制，软件Design-Expert 11 进行Box-Behnken 试验设计及分析。
2 结果与分析
2.1 淀粉乳浓度对抗性淀粉形成的影响结果
淀粉乳浓度对抗性淀粉含量的影响结果如图1所示。
图1 淀粉乳浓度对抗性淀粉形成的影响
Fig.1 Effect of starch milk concentration on resistant starch formation
由图1 可以看出，随着蕨根淀粉乳浓度的增加，抗性淀粉含量整体呈下降趋势。分析当淀粉乳浓度过高时，体系中水分含量较少，淀粉颗粒无法充分吸水膨胀，糊化难度增加。淀粉糊黏度过高时，直链淀粉分子在淀粉颗粒中触碰的机遇小，进而抑制淀粉颗粒形成有序的排列和结晶[17]。此外，微波处理中的加热过程使淀粉乳中的水分降低，淀粉浓度进一步增大，也将影响抗性淀粉的形成。因此，低浓度的淀粉乳有利于抗性淀粉的生成。迟治平等[18]的研究也表明，过高浓度的淀粉乳溶液会影响其膨胀和糊化过程，从而限制高粱抗性淀粉的形成。因此，选择淀粉乳浓度为30%进行后续试验。
2.2 微波功率对抗性淀粉形成的影响结果
微波功率对抗性淀粉形成的影响如图2 所示。
图2 微波功率对抗性淀粉形成的影响
Fig.2 Effect of microwave power on resistant starch formation
由图2 可以看出，微波功率对蕨根抗性淀粉含量有明显影响，随着微波功率的增加，蕨根抗性淀粉含量逐渐降低。在微波处理的热效应下，淀粉乳中的水分子发生剧烈振荡，淀粉颗粒急剧膨胀，淀粉分子中的氢键断裂，螺旋卷曲伸长展开，从而使淀粉颗粒的结晶结构受到破坏，导致直链淀粉分子溢出。过度的微波处理也会使得支链淀粉和直链淀粉发生过度降解，产生一些分子量相对较小的颗粒，难以重排形成抗性淀粉结晶[18]，从而影响抗性淀粉含量。此外，随着微波功率的增加，淀粉糊中水分蒸发的速度加快，使淀粉乳浓度急剧增大，不利于抗性淀粉形成。连喜军等[19]的研究也表明微波能够使淀粉分子中的支链和直链分子降解，从而影响抗性淀粉的形成。因此，选择微波功率320 W 进行后续试验。
2.3 微波时间对抗性淀粉形成的影响
微波时间对抗性淀粉含量的影响如图3 所示。
图3 微波时间对抗性淀粉形成的影响
Fig.3 Effect of microwave time on resistant starch formation
由图3 可知，随着微波时间的延长，蕨根抗性淀粉含量逐渐降低。微波处理时间过长或过短均不利于蕨根抗性淀粉的形成。微波处理时间过短，淀粉分子中的直链淀粉分子不能完全游离出来，不利于直链淀粉分子相互接近，从而降低了抗性淀粉含量；微波处理时间过长，可能会造成淀粉分子发生过度降解，产生大量无益于抗性淀粉形成的小分子或短链分子，从而使抗性淀粉含量降低[20]。此外，随着微波时间的延长，体系温度会逐渐上升，部分水分快速挥发使得淀粉乳浓度升高，也不利于蕨根抗性淀粉的形成。因此，微波时间选择2 min 进行后续试验。
2.4 回生温度对抗性淀粉形成的影响
回生温度对蕨根抗性淀粉含量影响如图4 所示。
图4 回生温度对抗性淀粉形成的影响
Fig.4 Effect of regeneration temperature on resistant starch formation
由图4 可知，随着回生温度的升高，抗性淀粉的含量整体先上升后下降。蕨根淀粉糊在4 ℃时，回生速率最快，蕨根抗性淀粉含量最高。在淀粉的回生过程中，适当的温度能够促进抗性淀粉的形成。在较低的温度下有利于淀粉分子的自动取向，分子之间的相互靠拢形成更多的晶核，晶核不断地生长成为更大的晶体，从而提高抗性淀粉含量[21]。而随着温度的升高，体系中的水分损失，淀粉糊黏度变大，也会导致抗性淀粉的含量下降。李一博等[22]的研究也表明高温会阻碍淀粉晶体的生长，从而使得蚕豆抗性淀粉的含量迅速下降。因此，回生温度选择4 ℃进行后续试验。
2.5 回生时间对抗性淀粉形成的影响结果
回生时间对抗性淀粉形成的影响如图5 所示。
图5 回生时间对抗性淀粉形成的影响
Fig.5 Effect of regeneration time on resistant starch formation
由图5 可知，随着回生时间的延长，蕨根抗性淀粉的含量逐渐增大。抗性淀粉的形成是直链淀粉分子的重新结晶过程，随着回生时间的延长，抗性淀粉的含量快速增加；当回生24 h 后，蕨根抗性淀粉的含量变化幅度较小，抗性淀粉的含量达到8%左右。这可能是因为晶核的形成需要一定时间，随着回生时间的延长，淀粉晶体充分形成，抗性淀粉含量增加[22]；当回生时间达到20 h 时，绝大部分的支链淀粉已经完成了结晶过程，所以延长回生时间对抗性淀粉形成的影响不再明显。综合考虑，选取24 h 为最佳回生时间。
2.6 微波法制备蕨根抗性淀粉工艺的优化
2.6.1 数学模型的建立
在单因素试验基础上，在确定回生温度为4 ℃，回生时间为24 h 的条件下，以微波时间（X1）、微波功率（X2）以及淀粉乳浓度（X3）为自变量，以蕨根抗性淀粉含量为响应值，设计三因素三水平试验，试验方案及结果如表2 所示。
表2 响应面试验方案及结果
Table 2 Design and results for response surface test
试验号 X1 微波时间 X2 微波功率 X3 淀粉乳浓度 Y RS 含量/%1 -1 -1 0 2.67±0.38 2 1 -1 0 12.69±0.10 3 -1 1 0 10.54±0.15 4 1 1 0 6.33±0.57 5 -1 0 -1 11.28±0.11 6 1 0 -1 12.08±0.07 7 -1 0 1 11.62±0.32 8 1 0 1 8.55±0.53 9 0 -1 -1 7.57±0.23 10 0 1 -1 11.90±0.14 11 0 -1 1 8.31±0.57 12 0 1 1 5.37±0.40 13 0 0 0 9.55±0.19 14 0 0 0 8.13±0.50 15 0 0 0 10.12±0.52 16 0 0 0 9.40±0.32 17 0 0 0 9.84±0.13
对表2 试验结果进行多元回归拟合，得到蕨根抗性淀粉含量对微波时间（X1）、微波功率（X2）、淀粉乳浓度（X3）的二次多项式回归模型如下。
回归模型方差分析见表3。
表3 回归模型方差分析结果
Table 3 ANOVA results using the regression model
注：*表示差异显著（P＜0.05）；**表示差异极显著（P＜0.01）。
变异来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型 100.358 9 11.151 6.87 0.009 **X1 1.566 1 1.566 0.97 0.358 X2 1.051 1 1.051 0.65 0.447 X3 10.080 1 10.080 6.21 0.041 *X1X2 50.623 1 50.623 31.21 0.001 **X1X3 3.744 1 3.744 2.31 0.172 X2X3 13.213 1 13.213 8.15 0.025 *X12 1.630 1 1.630 1.01 0.349 X22 16.386 1 16.386 10.1 0.016 *X32 3.058 1 3.058 1.89 0.212残差 11.355 7 1.622失拟 9.008 3 3.002 5.12 0.074纯误差 2.347 4 0.587总和 111.713 16
模型P=0.009＜0.01，差异极显著，表明所建立的回归二次模型有效，可用来分析和预测微波法制备蕨根抗性淀粉的含量。X3、X22、X2X3 对蕨根抗性淀粉含量差异显著（P＜0.05）；X1X2 差异极显著（P＜0.01）。根据F 值可知，影响蕨根抗性淀粉含量的大小顺序为X3＞X1＞X2，即淀粉乳浓度影响最大，微波时间影响次之，微波功率影响最小。
2.6.2 响应面分析
响应面如图6 所示。
图6 微波功率与微波时间、淀粉乳浓度交互作用响应面
Fig.6 Response surface diagram for the interaction of microwave power，microwave time and starch milk concentration
由图6 可以看出，当淀粉乳浓度X3=0 时，蕨根抗性淀粉含量随着微波功率的增大呈先升高后下降的趋势；微波功率较低时，随着微波时间的延长，蕨根抗性淀粉含量不断提高；在微波功率较高时，随着微波时间的延长，蕨根抗性淀粉含量呈现下降趋势。
对回归模型分析，得到蕨根抗性淀粉最大响应值对应的3 个因素的参数为微波时间1 min、微波功率480 W、淀粉乳浓度20%，蕨根抗性淀粉的最大含量为14.21%。对优化参数进行验证试验，在最佳制备条件下制备蕨根抗性淀粉的含量为13.95%，与理论值偏差0.26%，说明所采用的优化方式得到的蕨根抗性淀粉的制备工艺参数可靠，建立的预测模型在实际中具有一定的可行性。
2.7 蕨根抗性淀粉颗粒形貌
蕨根淀粉和蕨根抗性淀粉的颗粒形貌如图7 所示。
图7 蕨根淀粉和蕨根抗性淀粉的颗粒形貌
Fig.7 Granular morphology of fern root starch and fern root resistant starch
由图7 可知，蕨根淀粉颗粒表面光滑，大小均匀，呈椭圆或鹅卵石形，粒径为10.23 μm～26.14 μm；中等含量（RS=7.57%）的蕨根抗性淀粉颗粒存有部分形态光滑完整的淀粉颗粒，一部分形成不规则团聚物；高含量（RS=12.69%）的蕨根抗性淀粉颗粒形状消失，形成了表面不规则束状物或堆积在一起的团状物，大小在5 μm～150 μm 之间。这主要是由于蕨根淀粉经过微波处理后发生糊化，内部的氢键等结构被破坏，淀粉分子充分吸水胀裂，颗粒形状遭到破坏。随后经过糊化回生，再次聚集形成不规则团聚块状[23]。通过比较原蕨根淀粉、中等含量蕨根抗性淀粉、高含量蕨根抗性淀粉扫描电镜照片，可以看出不同抗性淀粉含量的淀粉颗粒形貌差异明显。随着抗性淀粉含量的增加，直链淀粉重结晶程度更高，颗粒更加不规则。这与迟治平等[18]的研究结果相似，经过微波处理后，淀粉颗粒内部分子发生迁移与重排，表面形态发生变化，且处理后的淀粉比表面积增大，稳定性更高，抗消化性增强。
3 结论
本研究采用微波法制备蕨根抗性淀粉，分别研究淀粉乳浓度、微波功率、微波时间、回生温度以及回生时间对蕨根抗性淀粉含量的影响，并通过Box-Behnken 试验得到制备抗性淀粉的数学模型，确定最佳制备工艺为微波功率480 W、淀粉乳浓度20%、微波处理1 min、回升温度4 ℃、回升时间24 h，该条件下蕨根抗性淀粉含量可达14.21%。通过对样品的表面形态观察可得，经过微波处理后，淀粉粒形态转化为不规则的块状堆颗粒，且抗性淀粉含量越高，样品的不规则程度越大。该研究为蕨根淀粉改性提供新思路，拓宽微波技术的应用领域，为蕨根精深加工以及开发相关功能性产品提供理论依据。
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