苦杏仁为蔷薇科植物山杏（Prunus armeniaca L.var.ansu Maxim.）、西伯利亚杏（Prunus sibirica L.）、东北杏Prunus mandshurica（Maxim.）Koehne]或杏（Prunus armeniaca L.）的干燥成熟种仁[1]。苦杏仁中脂肪和蛋白质的含量分别约为50%和27%，此外，苦杏仁还含有约4.1%总糖、约3%苦杏仁苷[2]。苦杏仁油中95%以上是亚麻酸、亚油酸等不饱和脂肪酸[3]，是一种很好的保健食用油。苦杏仁蛋白中含有17 种氨基酸，种类齐全、含量丰富，其中8 种人体必需氨基酸占总氨基酸的28.37%，接近联合国粮食及农业组织/世界卫生组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization，WHO/FAO）标准氨基酸模式。苦杏仁是一种有利于人体氨基酸营养平衡并具有保健作用的天然干果资源[4]，但由于其含有的苦杏仁苷具有毒副作用，导致苦杏仁没有得到充分的开发利用。由于苦杏仁中油脂和蛋白质的含量丰富且营养价值高，因此，将苦杏仁中的油脂和蛋白分别进行提取，可提升苦杏仁的综合利用价值。
苦杏仁提油采用的传统工艺主要包括高温压榨法和有机溶剂浸提法，新工艺主要是冷榨法和水酶法。高温压榨法出油率较高，但因在高温条件下进行，存在机械设备复杂、能耗大、饼粕中蛋白质严重变性的问题[5]，致使油料综合利用率低。有机溶剂浸出法出油率较高，但提取时间长、有机溶剂消耗量大、有机溶剂残留，破坏油脂风味，污染环境，存在危害人体健康的安全风险[6]，而且饼粕中蛋白严重变性，生物利用度低，易造成资源浪费。冷榨法提油率较低，但在中低温条件下进行，耗能较低且饼粕中蛋白质变性程度较小。水酶法成本较高，但工艺设备简单，生产过程能耗低；水为溶剂，绿色无污染；油脂得率高，油脂品质好[7]，色泽浅且副产物少，无需脱胶、脱臭等工艺处理，接近国家一级压榨油脂标准[8]；工艺条件温和可以有效地保留油脂、蛋白质等物质的营养价值和功能性质[9]，有助于进一步加工利用，满足安全、环保、可持续发展的要求[10]。根据扬长避短、绿色高效的原则将新型提油工艺进行组合应用，可兼顾油料中油脂和蛋白质的得率和品质。低温压榨法可在基本保持天然蛋白特性的基础上快速提取部分油脂，后续再基于复合非蛋白酶的水酶法提取粕中残油，可在极大程度上提取油脂的同时降低蛋白质变性度。苦杏仁的冷榨法、水酶法提油工艺已有研究，但是冷榨法和水酶法组合应用、采用非蛋白酶复合作为助剂的苦杏仁提油工艺鲜有研究。
本研究以苦杏仁为原料，采用冷榨结合水酶法对苦杏仁提油。为尽可能降低蛋白质变性度，从5 种非蛋白酶中筛选3 种酶作为复合酶。探究酶解温度、酶解pH 值、加酶量、酶解时间对苦杏仁粕油脂提取率的影响，然后运用响应面试验优化工艺参数，对比不同提油方法对苦杏仁蛋白的氨基酸组成、分子量分布、结构特性、表面微观形态的影响，以期为拓宽苦杏仁产品的应用领域、推动苦杏仁资源的增值利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
苦杏仁：河北蔚县丰润农产品加工有限公司；半纤维素酶（1 500 U/g）、α-淀粉酶（3 700 U/g）、糖化酶（100 000 U/g）、果胶酶（40 000 U/g）、纤维素酶（3 000 U/g）：北京索莱宝科技有限公司；考马斯亮蓝G-250：北京伊诺凯科技有限公司；盐酸、氢氧化钠、石油醚、乙醇、溴化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
脱皮机：潍坊市乐昊花生机械有限公司；S9S 商用智能榨油机：东莞香聚智能有限公司；L580 低速离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；ST3100 pH 计、e-G51HS07C 加热磁力搅拌器：奥豪斯仪器（常州）有限公司；DHG-9203A 电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；SHB-ⅢG 循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；RJ-TGL-16G-Ⅱ型高速台式离心机：无锡市瑞江分析仪器有限公司；Scientz-10N/C 真空冷冻干燥机：宁波新芝生物科技股份有限公司；K1100 全自动凯氏定氮仪：山东海能科学仪器有限公司；Agilent1100 高效液相色谱系统：美国安捷伦公司；F-7000 型荧光分光光度计：日立HITACHI 公司；SU8100 冷场发射扫描电子显微镜：日本株式会社日立高新技术公司；IS10 傅里叶红外光谱仪：美国Nicolet公司。
1.3 试验方法
1.3.1 冷榨法结合水酶法提取苦杏仁油的工艺流程
1.3.2 苦杏仁提油
1.3.2.1 苦杏仁脱皮
将苦杏仁放入沸水中4 min，然后迅速捞出，将水控净放入脱皮机中进行脱皮，将苦杏仁放入50 ℃烘箱中烘干至水分5%，然后手工挑选未脱掉皮和损坏霉变的苦杏仁，得到完好无损的苦杏仁，备用。
1.3.2.2 单一冷榨法提油
将脱皮苦杏仁在烘箱中预热至60 ℃，设置榨油机温度60 ℃、螺杆转速30 r/min 榨取粗油，4 000 r/min 离心20 min 除杂后，称重，计算冷榨法油脂提取率，其计算公式如下。
1.3.2.3 冷榨法结合水酶法提油
冷榨条件同1.3.2.2，冷榨粕依次经干燥、粉碎至60 目细度后，装入酶反应器中，按料液比1 ∶4（g/mL）加蒸馏水，调节pH 值，加入一定量的酶制剂，混匀后于一定温度下酶解一定时间，结束后冷却至25 ℃，4 000 r/min 离心20 min，吸取并收集上层清油，称其质量，计算清油提取率。乳状液于-20 ℃冷冻18 h，然后于50 ℃解冻破乳2 h，解冻后将乳状液4 000 r/min 离心20 min，将乳化层破乳取上层清油与首次得到的清油合并称其质量，计算总油提取率。公式如下。
1.3.3 冷榨结合水酶法提油工艺优化
1.3.3.1 酶的筛选
称取一定量经冷榨法提油后的苦杏仁粕，分别在果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、糖化酶、α-淀粉酶5 种酶的最适pH 值以及最适温度下，以相同的料液比1 ∶4（g/mL）、加酶量（2.5%，与苦杏仁粕的质量比）、提取时间（2.5 h）进行水酶法提油试验，以清油提取率、总油提取率为指标，确定效果较好的酶制剂。
1.3.3.2 酶解温度对苦杏仁粕油脂提取率的影响
在酶解pH5.5、加酶量2.5%、酶解时间2.5 h 的酶解条件下，分别在45、50、55、60、65 ℃的温度下进行酶解试验，考察酶解温度对苦杏仁粕清油提取率、总油提取率的影响。
1.3.3.3 酶解pH 值对苦杏仁粕油脂提取率的影响
在酶解温度55 ℃、加酶量2.5%、酶解时间2.5 h的酶解条件下，分别在4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 的酶解pH 值下进行酶解试验，考察酶解pH 值对苦杏仁粕清油提取率、总油提取率的影响。
1.3.3.4 加酶量对苦杏仁粕油脂提取率的影响
在酶解温度55 ℃、酶解pH5.5、酶解时间2.5 h 的酶解条件下，分别在1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%的加酶量下进行酶解试验，考察加酶量对苦杏仁粕清油提取率、总油提取率的影响。
1.3.3.5 酶解时间对苦杏仁粕油脂提取率的影响
在酶解温度55 ℃、酶解pH5.5、加酶量2.5%的酶解条件下，分别在1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h 的酶解时间下进行酶解试验，考察酶解时间对苦杏仁粕清油提取率、总油提取率的影响。
1.3.3.6 响应面试验设计
以单因素试验为基础，综合试验结果和经济效益，选择酶解温度（A）、酶解pH 值（B）、加酶量（C）、酶解时间（D）为因素，以总油提取率（Y）为响应值，利用Design-Expert 8.0.6 软件进行Box-Behnken 中心组合试验设计和响应面分析。响应面试验设计因素水平表见表1。
表1 响应面试验设计因素水平
Table 1 Factors and levels in Box-Behnken experimental design
水平 A 酶解温度/℃ B 酶解pH 值 C 加酶量/% D 酶解时间/h-1 50 5.0 2.0 2.0 0 55 5.5 2.5 2.5 1 60 6.0 3.0 3.0
1.3.4 苦杏仁和苦杏仁粕脱苷及蛋白质提取
取苦杏仁和经过不同方法提油后得到的苦杏仁粕，40 ℃烘干后粉碎过60 目筛，以料液比1 ∶11（g/mL）加入75%乙醇溶液，在50 ℃下脱苷处理50 min，抽滤取沉淀。参照文献[11]的试验结果，将冷榨结合水酶法提油的苦杏仁粕脱苷沉淀物以料液比1 ∶25（g/mL）加入蒸馏水，苦杏仁粉脱苷沉淀物、冷榨苦杏仁粕粉脱苷沉淀物按照所含蛋白质质量与蒸馏水质量的比值与前述条件相当的原则折算蒸馏水用量，分别调节pH 值至11.0，40 ℃提取60 min。然后4 000 r/min 离心20 min，取上清液调节pH 值至4.6，静置30 min 后4 000 r/min 离心20 min，将沉淀用蒸馏水洗3 次，调节pH 值至7.0 后冷冻干燥。
1.3.5 不同提油方法对苦杏仁蛋白结构特性的影响
1.3.5.1 氨基酸组成
称取约100 mg 均匀样品于水解瓶中，加入8 mL 6 mol/L HCl，充氮气3 min，封瓶，120 ℃水解22 h，取出冷却至25 ℃，将水解管样品全部转移至容量瓶中，加4.8 mL 10 mol/L NaOH 中和，用蒸馏水定容至25 mL，双层滤纸过滤，取1 mL 澄清液15 000 r/min 离心30 min，取400 μL 上清液于液相样品瓶中。使用液相色谱仪进行色谱分析，液相色谱条件：流动相流速为1.0 mL/min，柱温为40 ℃，紫外检测器检测波长为338 nm，脯氨酸在波长262 nm 处检测；氨基酸含量以外标法定量。
1.3.5.2 分子量分布
参照耿勤[12]的方法并稍作修改，分离胶浓度为12%、浓缩胶浓度为5%。将不同方法提油后的苦杏仁蛋白样品配制成浓度为10 mg/mL 的溶液，取30 μL 蛋白溶液与10 μL 的4 倍上样缓冲液混合，沸水浴4 min，冷却至25 ℃后13 000 r/min 离心5 min，取18 μL 进行上样分析。跑样起始电压为80 V，样品进入分离胶后调节电压为120 V。考马斯亮蓝G-250 染色30 min，脱色12 h，通过凝胶成像系统拍照。与标准蛋白分子量（14.0 kDa～97.2 kDa）比较，计算不同方法提油后苦杏仁蛋白的分子量。
1.3.5.3 傅里叶红外光谱
参照Shevkani 等[13]的方法，使用傅里叶红外光谱仪对不同方法提油后苦杏仁蛋白的二级结构进行测定。苦杏仁蛋白样品与KBr 经干燥处理后，将准确称取的待测样品与KBr 混合，充分研磨成均匀粉末后压成透明薄片，使用傅里叶红外光谱仪记录所有光谱，扫描条件：扫描范围为4 000 cm-1～400 cm-1、分辨率为4 cm-1、扫描次数为32 次，谱图分析采用Omnic 9.2 和Peakfit v4.12 软件进行分析。
1.3.5.4 内源荧光光谱
参照Arogundade 等[14]的方法，使用荧光分光光度计对不同方法提油后苦杏仁蛋白的三级结构进行测定。将苦杏仁蛋白溶解于0.01 mol/L、pH7.0 的磷酸盐缓冲液中，磁力搅拌2 h 后4 000 r/min 离心20 min，收集上清液。以考马斯亮蓝G-250 法测定上清液中蛋白浓度，用磷酸盐缓冲液将蛋白浓度稀释至0.1 mg/mL。采用荧光分光光度计在激发波长280 nm 下扫描波长范围为300 nm～400 nm 的发射光谱，记录荧光光谱。激发和发射狭缝宽度均设置为5 nm。
1.3.5.5 表面微观形态
使用冷场发射扫描电子显微镜（cold field emission scanning electron microscopy，cold FESEM）对不同方法提油后苦杏仁蛋白的表面微观形态进行观察。将蛋白样品充分干燥，使用冷场发射扫描电子显微镜导电胶将样品粘在样品台上，用吸耳球吹掉多余和松动的样品。样品表面镀导电金膜后，在冷场发射扫描电子显微镜内观察并记录样品的微观形貌（3 kV）。
1.3.6 数据分析
采用Excel 和Origin 2019b 软件进行基础数据处理、分析与作图。采用SPSS 26 和Design-Expert 8.0.6软件进行显著性分析并作响应面试验及相关性分析。
2 结果与分析
2.1 冷榨结合水酶法提油工艺优化
2.1.1 酶的筛选
不同非蛋白酶酶制剂对苦杏仁粕油脂提取率的影响见图1。
图1 不同非蛋白酶酶制剂对苦杏仁粕油脂提取率的影响
Fig.1 Effects of different non-protease enzyme preparations on oil extraction rate of bitter almond meal
由图1 可知，α-淀粉酶、糖化酶、半纤维素酶的酶解油脂提取率高于果胶酶和纤维素酶，与闫帅航[15]的研究结果相似。纤维素酶、半纤维素酶可降解植物细胞壁的骨架，使油脂容易游离出来[16]；糖化酶可降解脂多糖等复合体；α-淀粉酶可分解淀粉，使油脂容易释放出来[17]。所以选用α-淀粉酶、糖化酶、半纤维素酶按照质量比1 ∶1 ∶1 复配后进行下一步试验。
2.1.2 单因素试验结果与分析
2.1.2.1 酶解温度对苦杏仁粕油脂提取率的影响
图2 为酶解温度对苦杏仁粕油脂提取率的影响。
图2 酶解温度对苦杏仁粕油脂提取率的影响
Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on oil extraction rate of bitter almond meal
由图2 可知，随着酶解温度的升高，苦杏仁粕油脂提取率呈现先增加后减少的趋势，在55 ℃时出现最大值，与徐晓燕[18]的研究结果相似。这是由于随着酶解温度升高，酶的活性提高，酶解反应速率增大，更有利于油脂从细胞中释放出来；同时，酶解体系温度升高可以增大分子扩散系数，降低溶剂及油脂的黏度，加快油脂分子的扩散速度[19]。当超过酶的适宜反应温度时，酶的活性降低，影响酶的中心结构[20]，使酶失去催化活性；还可能是在高温下进行酶解使得物料中的可溶性糖减少，限制油从细胞中释放并减少水解产物[21]，从而导致油脂提取率下降。因此，冷榨结合水酶法苦杏仁粕提油的适宜酶解温度为55 ℃。
2.1.2.2 酶解pH 值对苦杏仁粕油脂提取率的影响
酶解pH 值对苦杏仁粕油脂提取率的影响如图3所示。
图3 酶解pH 值对苦杏仁粕油脂提取率的影响
Fig.3 Effect of pH value of enzymatic hydrolysis on oil extraction rate of bitter almond meal
由图3 可知，随着pH 值的增大，苦杏仁粕油脂提取率呈现先增加后减少的趋势，在pH5.5 时出现最大值。这是由于随着pH 值的增大，酶的活力升高，酶反应速度加快，当pH 值等于或接近复合酶的最佳活性pH 值时，可获得较高的油脂提取率。当酶解液pH 值大于5.5 时，体系乳化程度增加，导致稳定性和油脂提取率下降[22]。因此，冷榨结合水酶法苦杏仁粕提油的适宜酶解pH 值为5.5。
2.1.2.3 加酶量对苦杏仁粕油脂提取率的影响
图4 为加酶量对苦杏仁粕油脂提取率的影响。
图4 加酶量对苦杏仁粕油脂提取率的影响
Fig.4 Effect of enzyme addition amount on oil extraction rate of bitter almond meal
由图4 可知，随着加酶量的增加，苦杏仁粕油脂提取率呈现先增加后减少的趋势，在加酶量为2.5%时出现最大值，与王丽媛等[23]的研究结果相似。这是由于随着加酶量的增加，酶与反应底物分子碰撞的概率变大，对细胞结构破坏增大，对脂蛋白、脂多糖等复合体酶解更充分，从而促进油脂释放；底物与酶的反应达到饱和时，加酶量过多使酶分子间产生竞争性抑制作用，降低酶的作用效率，致使油脂提取率降低。此外，过量的酶会附着在苦杏仁表面，影响油脂的释放；同时，加酶量过多易使酶解体系发生深度水解，水解产物提高蛋白质的乳化性，使油脂分子再度被蛋白质包裹，产生的乳化现象使油脂的分离难度增加，油脂提取率降低[24]。因此，冷榨结合水酶法苦杏仁粕提油的适宜加酶量为2.5%。
2.1.2.4 酶解时间对苦杏仁粕油脂提取率的影响
酶解时间对苦杏仁粕油脂提取率的影响如图5所示。
图5 酶解时间对苦杏仁粕油脂提取率的影响
Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on oil extraction rate of bitter almond meal
由图5 可知，随着酶解时间的延长，苦杏仁粕油脂提取率呈现先增加后减少的趋势，在酶解时间为2.5 h时出现最大值。这是由于随着酶解时间的延长，酶与原料接触更充分，细胞壁和复合物等逐步被打破，油脂提取率不断提高；但酶解时间继续延长，会使酶长时间处于温度较高的环境下，使其活性降低甚至失活，还可能会加重油脂发生乳化现象[25]，导致油脂提取率下降。因此，冷榨结合水酶法苦杏仁粕提油的适宜酶解时间为2.5 h。
2.1.3 响应面分析
2.1.3.1 响应面试验设计与结果
根据Box-Behnken 响应面设计原理，在单因素试验基础上，以酶解温度（A）、酶解pH 值（B）、加酶量（C）、酶解时间（D）为自变量，以苦杏仁粕总油提取率（Y）为响应值，采用Design-Expert 8.0.6 软件对各因素间交互作用进行分析，确定苦杏仁冷榨结合水酶法提油最佳工艺。响应面试验设计与结果见表2。
表2 响应面试验设计与结果
Table 2 Response surface experimental design and results
编号 A 酶解温度/℃Y 苦杏仁粕总油提取率/%1 55 5.5 2.5 2.5 73.03 2 60 5.5 2.5 2.0 42.69 3 55 5.5 3.0 3.0 61.32 4 55 5.5 2.5 2.5 72.72 5 55 5.5 2.5 2.5 71.12 6 60 5.5 3.0 2.5 56.74 7 50 5.5 3.0 2.5 39.34 8 60 5.0 2.5 2.5 37.14 9 50 5.5 2.0 2.5 34.09 10 60 6.0 2.5 2.5 45.12 11 55 5.5 2.5 2.5 67.37 12 55 5.5 2.0 2.0 44.77 13 55 5.5 2.0 3.0 56.53 14 55 6.0 2.0 2.5 61.32 15 60 5.5 2.0 2.5 44.26 16 50 5.5 2.5 2.0 33.89 17 55 5.0 2.0 2.5 28.93 18 55 5.5 2.5 2.5 68.23 19 55 6.0 3.0 2.5 61.88 20 55 6.0 2.5 3.0 66.21 B 酶解pH 值C 加酶量/%D 酶解时间/h
续表2 响应面试验设计与结果
Continue table 2 Response surface experimental design and results
编号 A 酶解温度/℃B 酶解pH 值C 加酶量/%D 酶解时间/h Y 苦杏仁粕总油提取率/%21 50 5.0 2.5 2.5 12.74 22 55 6.0 2.5 2.0 56.84 23 50 6.0 2.5 2.5 49.61 24 55 5.5 3.0 2.0 56.52 25 55 5.0 2.5 2.0 34.97 26 50 5.5 2.5 3.0 36.74 27 55 5.0 3.0 2.5 45.60 28 60 5.5 2.5 3.0 60.93 29 55 5.0 2.5 3.0 41.71
2.1.3.2 数据模型建立与回归分析
根据表2 的响应面试验结果对数据进行回归分析，得到苦杏仁粕总油提取率的二次多项回归模型：
回归方程的方差分析结果如表3 所示。
表3 响应面试验交互作用分析
Table 3 Analysis of interactions of the response surface experiment
注：**表示差异极显著（p＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 p 值 显著性模型 6 268.26 14 447.73 101.73 ＜0.000 1 **A 539.62 1 539.62 122.61 ＜0.000 1 **B 1 630.77 1 1 630.77 370.54 ＜0.0001 **C 221.02 1 221.02 50.22 ＜0.000 1 **D 240.84 1 240.84 54.72 ＜0.000 1 **AB 208.66 1 208.66 47.41 ＜0.000 1 **AC 13.07 1 13.07 2.97 0.106 9 AD 59.21 1 59.21 13.45 0.002 5 **BC 64.88 1 64.88 14.74 0.001 8 **BD 1.73 1 1.73 0.39 0.540 9 CD 12.11 1 12.11 2.75 0.119 4 A2 2 550.97 1 2 550.97 579.62 ＜0.000 1 **B2 1 223.44 1 1 223.44 277.99 ＜0.000 1 **C2 372.68 1 372.68 84.68 ＜0.000 1 **D2 350.65 1 350.65 79.67 ＜0.000 1 **残差 61.62 14 4.40失拟差 34.95 10 3.50 0.52 0.814 2纯误差 26.66 4 6.67总和 6 329.87 28
由表3 可知，苦杏仁粕总油提取率回归方程的拟合度达到了极显著水平（p＜0.01），失拟项不显著（p＞0.05），拟合的模型方程效果较好，该模型成立有效。该回归方程的决定系数R2＝0.990 3，表明模型拟合良好；模型可调整确定系数R2Adj＝0.980 5，说明数据可靠性较高。模型中各因素对苦杏仁粕总油提取率的影响程度由大到小依次为酶解pH 值＞酶解温度＞酶解时间＞加酶量。A、B、C、D、A2、B2、C2、D2、AB、AD、BC 影响均极显著（p＜0.01）。
2.1.3.3 响应面交互作用分析
等高线及响应面的陡峭程度，可以反映两自变量之间交互作用对响应值的影响，当等高线呈圆形且响应面坡度较平缓时，表示两因素交互作用不显著，当等高线呈椭圆形且响应面坡度较陡时，表示两因素交互作用影响显著。图6～图11 为不同因素交互作用的响应面及等高线。
图6 酶解温度与酶解pH 值对苦杏仁粕总油提取率的影响
Fig.6 Effects of enzymatic hydrolysis temperature and pH value on the total oil extraction rate of bitter almond meal
图7 酶解温度与加酶量对苦杏仁粕总油提取率的影响
Fig.7 Effects of enzymatic hydrolysis temperature and enzyme addition amount on total oil extraction rate of bitter almond meal
图8 酶解温度与酶解时间对苦杏仁粕总油提取率的影响
Fig.8 Effects of enzymolysis temperature and enzymolysis time on total oil extraction rate of bitter almond meal
图9 酶解pH 值与加酶量对苦杏仁粕总油提取率的影响
Fig.9 Effects of enzymatic hydrolysis pH value and enzyme addition amount on total oil extraction rate of bitter almond meal
图10 酶解pH 值与酶解时间对苦杏仁粕总油提取率的影响
Fig.10 Effects of enzymatic hydrolysis pH value and enzymatic hydrolysis time on the total oil extraction rate of bitter almond meal
图11 加酶量与酶解时间对苦杏仁粕总油提取率的影响
Fig.11 Effects of enzyme dosage and enzymatic hydrolysis time on total oil extraction rate of bitter almond meal
由图6～图11 可知，AB（酶解温度-酶解pH 值）、AD（酶解温度-酶解时间）、BC（酶解pH 值-加酶量）交互作用的等高线呈椭圆形，响应面较陡，对苦杏仁粕总油提取率影响极显著；AC、BD 交互作用的等高线呈扁圆形、CD 交互作用的响应面坡度较平缓，对苦杏仁粕总油提取率影响不显著。从响应面可知，在低水平条件下，随着每个因素的增大，响应值增大，当响应值增大到极值后，又逐渐减小。
2.1.3.4 提油工艺条件的确定及验证试验
通过Design-Expert 8.0.6 软件对回归方程进一步优化，得出苦杏仁粕提油最优酶解工艺条件：酶解温度55 ℃、酶解pH5.8、加酶量2.5%、酶解时间2.6 h，此条件下苦杏仁粕总油提取率预测值为73.50%。根据实际情况对酶解的工艺条件进行修整：酶解温度55 ℃、酶解pH6.0、加酶量2.5%、酶解时间2.6 h，为检验结果的可靠性，采用修整条件进行5 次平行验证试验，得到苦杏仁粕总油提取率平均值为73.46%，与理论预测值接近，说明该方程与实际情况拟合很好。
2.2 不同提油方法对苦杏仁油脂提取率的影响
表4 为不同提油方法对苦杏仁油脂提取率的影响。
表4 不同提油方法对苦杏仁油脂提取率的影响
Table 4 Effects of different oil extraction methods on extraction yield of bitter almond oil
?
由表4 可知，冷榨法对苦杏仁油脂提取率为36.14%，将冷榨法提油后的苦杏仁粕进行水酶法提油工艺优化后，冷榨结合水酶法对苦杏仁油脂提取率为84.24%，较冷榨法油脂提取率高48.1%。由此可见，冷榨结合水酶法提取苦杏仁油是一种反应条件温和且油脂提取率高的方法。
2.3 不同提油方法处理对苦杏仁蛋白结构特性的影响
2.3.1 氨基酸组成
表5 为不同方法提油后苦杏仁蛋白氨基酸组成及含量。
表5 不同方法提油后苦杏仁蛋白氨基酸组成及含量
Table 5 Contents of amino acids in bitter almond cakes from different oil extraction operations
含量项目未提油/% 冷榨法/% 冷榨结合水酶法/%天冬氨酸 8.23 7.91 8.18谷氨酸 18.92 18.40 18.14丝氨酸 3.00 2.80 2.85组氨酸 1.79 1.63 1.70甘氨酸 3.80 3.61 3.55苏氨酸 2.10 1.90 1.85精氨酸 7.65 7.49 7.50丙氨酸 3.64 3.43 3.54酪氨酸 2.19 2.26 2.32半胱氨酸 0.38 0.42 0.32缬氨酸 3.84 3.65 3.72蛋氨酸 0.30 0.74 0.56苯丙氨酸 4.42 4.27 4.39异亮氨酸 3.25 3.10 3.21亮氨酸 5.60 5.27 5.34赖氨酸 2.08 1.87 1.67脯氨酸 2.70 3.37 3.40总氨基酸含量（total amino acids，TAA）73.90 72.10 72.25必需氨基酸含量（essential amino acid，EAA）21.59 20.79 20.75非必需氨基酸含量（nonessential amino acid，NEAA）52.31 51.32 51.50必需氨基酸/非必需氨基酸（EAA/NEAA）41.28 40.51 40.30必需氨基酸/总氨基酸（EAA/TAA）29.22 28.83 28.72
由表5 可知，不同方法提油后苦杏仁蛋白中均含有17 种氨基酸，总氨基酸含量为72.10%～73.90%。其中7 种人体必需氨基酸（色氨酸除外）含量为20.75%～21.59%，占总氨基酸含量的28.72%～29.22%，与徐克芹[26]的研究结果相似。苦杏仁蛋白氨基酸组成中谷氨酸含量最高，为18.14%～18.92%，谷氨酸对脑震荡、神经损伤、癫痫等神经性疾病具有一定的营养补充作用，能缓解肝性脑病患者出现的神经改变症状[27]。不同方法提油后苦杏仁粕蛋白的氨基酸组成与含量的变化极小可能是由冷榨时的挤压作用和水酶法时弱酸性的酶解环境造成。本试验中不同方法提油后苦杏仁粕蛋白的氨基酸组成与苦杏仁蛋白的氨基酸组成差异不明显，表明不同提油方法对苦杏仁蛋白氨基酸组成的影响极小。
苦杏仁蛋白中必需氨基酸组成是评价苦杏仁蛋白营养成分的重要评判标准，当所含必需氨基酸能够被人体全部吸收时，其营养价值才能达到最高。表6为不同方法提油后苦杏仁蛋白必需氨基酸组成与WHO/FAO 建议值的对比。
表6 不同方法提油后苦杏仁蛋白必需氨基酸组成与WHO/FAO建议值的对比
Table 6 Comparison of the essential amino acid composition of protein in bitter almond cakes from different oil extraction operations with reference to WHO/FAO recommended values
氨基酸种类必需氨基酸（EAA）含量/% WHO/FAO 的标准模式/%氨基酸评分未提油冷榨法冷榨结合水酶法 未提油 冷榨法 冷榨结合水酶法亮氨酸 7.58 7.31 7.39 7.00 108.27 104.37 105.60赖氨酸 2.81 2.60 2.31 5.50 51.10 47.24 42.07缬氨酸 5.20 5.06 5.15 5.00 103.97 101.16 103.09异亮氨酸 4.40 4.29 4.44 4.00 110.11 107.34 111.10苏氨酸 2.85 2.64 2.57 4.00 71.13 65.89 64.17组氨酸 2.43 2.26 2.35 1.70 142.80 133.23 138.01苯丙氨酸+酪氨酸8.95 9.05 9.28 6.00 149.13 150.86 154.75蛋氨酸+半胱氨酸0.92 1.60 1.22 3.60 25.61 44.41 33.87总氨基酸 35.13 34.81 34.72 35.00 100.38 99.45 99.20
由表6 可知，不同方法提油后苦杏仁蛋白中必需氨基酸的总含量为34.72%～35.13%，均接近或高于WHO/FAO 标准氨基酸模式，氨基酸评分达到99.20～100.38，其中，7 种必需氨基酸中的苏氨酸、赖氨酸含量低于WHO/FAO 标准氨基酸模式，其余必需氨基酸含量均高于WHO/FAO 标准氨基酸模式，因此，苦杏仁蛋白是一种优质的食用蛋白质。
2.3.2 分子量分布
图12 为不同方法提油后苦杏仁蛋白的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）图谱。
图12 不同方法提油后苦杏仁蛋白的SDS-PAGE 电泳图谱
Fig.12 SDS-PAGE of bitter almond protein from different oil extraction operations
由图12 可知，不同方法提油后苦杏仁蛋白的平均分子量在20 kDa～80 kDa 之间，苦杏仁蛋白主要有4 个亚基条带，其分子量大小分别为41、37、29、22 kDa，其中分子量为41、37、22 kDa 的含量较多，这与张帆[28]的研究结果一致。冷榨结合水酶法提油蛋白的55 kDa 附近亚基条带着色变浅，而33 kDa 附近亚基条带着色变深，这可能是酶解在弱酸性环境下进行，导致苦杏仁蛋白中较大的亚基解离成较小的亚基，这与盖晴晴[29]的研究结果一致。不同提油方法得到的苦杏仁粕蛋白在亚基组成上与未提油苦杏仁蛋白没有明显的差异，表明不同提油方法对苦杏仁蛋白亚基组成变性度极低。
2.3.3 傅里叶红外光谱
图13 为不同方法提油后苦杏仁蛋白的红外光谱。
图13 不同方法提油后苦杏仁蛋白红外光谱
Fig.13 FTIR spectra of bitter almond protein from different oil extraction operations
红外图谱主要有几组特征吸收谱带，在3 500 cm-1～3 200 cm-1 的吸收带反映了O-H 和N-H 伸缩振动，在2 980 cm-1～2 850 cm-1 的吸收带反映了C-H 伸缩，在1 700 cm-1～1 600 cm-1 的吸收带为酰胺Ⅰ带，主要反映C=O 伸缩振动，最常用于分析蛋白质的二级结构。在1 580 cm-1～1 480 cm-1 的吸收带为酰胺Ⅱ带，反映了NH 变形振动或C-N 伸缩振动[30]。由图13 可知，不同方法提油后苦杏仁蛋白均显现出基本一致的吸收峰，在特征吸收谱带均出现了典型的酰胺带振动，表明提油后没有新的官能团产生。
通过分析波数范围在1 700 cm-1～1 600 cm-1 的酰胺Ⅰ带得到苦杏仁蛋白二级结构含量。通过基线校正、傅里叶去卷积以及高斯曲线拟合，计算苦杏仁蛋白二级结构的相对含量，其结果如表7 所示。
表7 不同方法提油后苦杏仁蛋白二级结构的相对含量
Table 7 Relative content of the secondary structures of bitter almond protein from different oil extraction operations
注：同列不同小写字母表示差异显著，p＜0.05。
样品 β-折叠/% 无规卷曲/% α-螺旋/% β-转角/%未提油苦杏仁蛋白40.05±0.72b 14.58±0.00a 15.88±0.19a 29.49±0.53a冷榨法提油苦杏仁蛋白43.88±0.59a 14.98±0.24a 16.12±0.18a 25.01±0.66b冷榨结合水酶法提油苦杏仁蛋白40.11±1.31b 14.51±1.44a 15.32±0.67a 30.06±1.52a
由表7 可知，目前公认的酰胺I 带二级结构的区域指α-螺旋（1 660 cm-1～1 650 cm-1）、无规则卷曲（1 650 cm-1～1 640 cm-1）、β-折叠（1 640 cm-1～1 600 cm-1）、β-转角（1 700 cm-1～1 660 cm-1）[31]。未提油苦杏仁蛋白二级结构的主要组成为β-折叠结构，占二级结构总量的40.05%；冷榨法提油苦杏仁蛋白与未提油苦杏仁蛋白相比，α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲含量均有所增加、β-转角含量降低，表明蛋白质分子间的相互作用会导致蛋白组分的改变，在蛋白质受机械高压作用时，由于疏水残基的暴露导致部分展开分子间的残基相互交联作用形成β-折叠结构[32]；冷榨结合水酶法提油苦杏仁蛋白与未提油苦杏仁蛋白相比，β-折叠和β-转角含量略微增加、α-螺旋和无规则卷曲含量略微减小，总体差异不明显。可能是较低温度和较短时间的冷榨法提油导致部分蛋白可逆变性，经过水酶法的酶解反应后，由于水分子作用导致蛋白复性。综上，不同提油方法会对蛋白二级结构造成影响，与未提油蛋白相比，冷榨法提油对苦杏仁蛋白二级结构影响较大，冷榨结合水酶法提油对苦杏仁蛋白二级结构影响不明显。
2.3.4 内源荧光光谱
苦杏仁蛋白中色氨酸残基的内源荧光对微环境极性的变化特别敏感，因此使用荧光光谱方法检测不同提油方法对苦杏仁蛋白三级结构的影响。图14 为不同提油方法的苦杏仁蛋白的荧光光谱。
图14 不同方法提油后苦杏仁蛋白的荧光光谱
Fig.14 Fluorescence spectra of bitter almond proteins from different oil extraction methods
由图14 可知，在280 nm 的激发波长下3 种蛋白最大吸收波长在330 nm～332 nm 无明显差异。与未提油蛋白相对比，提油处理后苦杏仁蛋白的最大吸收波长向长波方向发生了轻微红移，表明部分色氨酸残基暴露于蛋白质分子表面，色氨酸残基所处环境从蛋白质分子内部非极性环境向极性环境转化[33]。3 种蛋白的最大荧光强度无明显差异，最大荧光强度大小依次是冷榨法提油蛋白＞冷榨结合水酶法提油蛋白＞未提油蛋白。与未提油蛋白相比，提油处理后苦杏仁蛋白的最大荧光强度增大，表明蛋白质折叠结构展开，原本被致密结构包裹的发色氨基酸被暴露出来。冷榨结合水酶法提油蛋白的最大吸收波长和最大荧光强度小于冷榨法提油蛋白，但是与未提油蛋白相近，可能是因为酶解反应使蛋白结构展开，更多色氨酸残基暴露于表面，活性基团的暴露增强了分子间相互作用，造成分子的再聚集，进一步导致更多色氨酸残基被包埋于疏水区域，从而引起最大吸收波长和最大荧光强度的下降[34]。综上，不同提油方法会对蛋白三级结构造成影响，与未提油蛋白相比，冷榨法提油对苦杏仁蛋白三级结构影响较大，冷榨结合水酶法提油对苦杏仁蛋白三级结构影响不明显，可能是因为水酶法提油过程中蛋白质发生了一定程度的复性。
2.3.5 表面微观形态
通过冷场发射扫描电子显微镜观察不同方法提油后苦杏仁蛋白的表面微观形态特征，结果如图15 所示。
图15 不同方法提油后苦杏仁蛋白的冷场发射扫描电子显微镜图
Fig.15 Cold field emission scanning electron microscopy of bitter almond proteins from different oil extraction operations
由图15 可知，未提油处理的苦杏仁蛋白呈现大量块状聚集和堆积，蛋白表面粗糙且致密紧实，是因为未提油处理的苦杏仁蛋白中油脂与蛋白质大量结合；冷榨法提油处理的苦杏仁蛋白呈现较大块聚集，蛋白表面较粗糙且有少量孔洞结构，是因为冷榨法高压处理去除部分油脂，减少了油脂和蛋白的相互作用；冷榨结合水酶法提油处理的苦杏仁蛋白呈现大小不一的块状或片状较分散排列，蛋白表面形状清晰且呈现大量孔洞结构[35]，可能是因为经过冷榨和水酶法提油处理后的蛋白脱除了蛋白网状结构内的脂肪，显示出蛋白质的骨架结构。
3 结论
苦杏仁冷榨结合水酶法提油的最佳工艺条件为酶解温度55 ℃、酶解pH6.0、加酶量2.5%、酶解时间2.6 h，该条件下苦杏仁粕总油提取率为73.46%。不同提油方法对苦杏仁蛋白的氨基酸组成和分子量分布差异不明显。不同提油方法会对苦杏仁蛋白二、三级结构造成影响，与未提油蛋白相对比，冷榨法提油对苦杏仁蛋白二、三级结构影响较大，冷榨结合水酶法提油对苦杏仁蛋白二、三级结构影响不明显。不同提油方法的苦杏仁蛋白的表面微观形态存在差异，未提油蛋白的微观形态呈现大量块状聚集堆积、蛋白表面粗糙且致密紧实，冷榨法提油蛋白的微观形态呈现较大块聚集、蛋白表面较粗糙且有少量孔洞结构，冷榨结合水酶法提油蛋白的微观形态呈现大小不一的块状或片状较分散排列、蛋白表面形状清晰且呈现大量孔洞结构。冷榨结合水酶法提油既绿色安全又有助于保持油脂和蛋白质的天然特性，有助于拓宽苦杏仁的应用范围、推动苦杏仁资源的增值利用。
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