牡丹属毛茛科芍药，有“花中之王”之称，自古以来是传统小吃的原料，如牡丹花粥、牡丹花饼等[1]，姚雪倩等[2]将牡丹花制作成牡丹花茶，发现其具有一定的保健功效。作为牡丹花精华的牡丹花蕊，具有降血糖、降血脂和预防心脑血管等疾病的作用[3]。目前为止，对牡丹花蕊研究主要集中在黄酮[4]、醇提物的活性[5]等方面，而对多糖研究较少。
多糖是由10 个以上单糖通过糖苷键连接而成的一种天然高分子化合物，分子量达到数万或上百万。主要包括植物多糖、动物多糖和微生物多糖等。植物多糖是生物活性多糖的主要来源，大量研究表明植物多糖具有抗肿瘤、抗病毒、降血糖、增强细胞免疫活性等功效[6]，且无毒副作用[7]。因此，开发和利用生物活性多糖具有重要意义[8]。
多糖的提取、分离和纯化是研究多糖理化性质和功能活性的基础，只有得到纯度较高的组分，才能更好地进行分析。研究表明多糖的生物活性与自身结构有密切联系，目前对丹凤牡丹花蕊水溶性多糖（wateroluble pol-ysaccharide，WSP）的研究主要集中在提取工艺、粗品的抗氧化[9]，而关于牡丹花蕊水溶性多糖的分离纯化、纯品组分的理化性质和生理活性研究鲜见报道。本文采用超声波复合酶法提取牡丹花蕊水溶性粗多糖，经过脱色、脱蛋白、柱色谱分离纯化等过程得到一种纯多糖组分。通过对多糖的糖含量、相对分子质量、官能团等特征指标及其体外抗氧化、降血糖作用进行研究，为进一步研究牡丹花蕊水溶性多糖的构效关系以及牡丹花蕊的开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
牡丹花蕊在洛阳牡丹园采摘，粉碎过60 目筛备用；浓硫酸、苯酚：天津市德恩化学试剂有限公司；无水乙醇、正己烷：天津市大茂化学试剂厂；正丁醇：西陇化工股份有限公司；氯仿：济南宝辉化工有限公司；抗坏血酸：天津市登峰化学试剂厂；水杨酸、硫酸亚铁、铁氰化钾：天津市北辰区方正试剂厂；过氧化氢：厦门安永博科技有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazide，DPPH）：上海蓝季科技发展有限公司；2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：上海恒远生物科技有限公司；三氯乙酸：湖北成丰化工有限公司；刚果红：天津市科密欧化学试剂有限公司；考马斯亮蓝G250：上海源叶生物科技有限公司；牛血清蛋白：中国食品药品检定研究院；半乳糖醛酸：上海蓝季科技发展有限公司；α-淀粉酶（104 U/g）：山东隆科特酶制剂有限公司；α-葡萄糖苷酶（50 U/mg）：上海麦克林生化科技股份有限公司。所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
T6 新世纪紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；KQ-500DE 型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；RE52CS 型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；HH-S6A 水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司；TDZ5-WS 型离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；VERTEX70 傅里叶变换红外光谱：德国BRUKER公司；TM3030Plus 扫描电子显微镜：日本日立高新技术公司；LC-10A 高效液相色谱仪：杭州瑞析科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 牡丹花蕊水溶性多糖的提取
称取10 g 脱脂原料采用超声波复合酶法提取，收集上清液65 ℃旋转蒸发至1/3，加入4 倍体积无水乙醇，静置12 h，离心（4 200 r/min，15 min）收集沉淀，用乙醇和丙酮洗涤3 次沉淀物以除去杂质，冷冻干燥并计算粗多糖得率，计算公式如下。
式中：m 为提取的粗多糖质量，g；M 为原料牡丹花蕊质量，g。
1.3.2 牡丹花蕊水溶性多糖脱色、脱蛋白
将样品采用H2O2 法脱色。脱色后的多糖溶液采用Sevage 法去蛋白[10]，将上清液65 ℃旋转蒸发，装入3 500 Da 透析袋48 h，冷冻干燥。
1.3.3 阴离子交换柱层析分离牡丹花蕊水溶性多糖及体外降血糖作用测定
采用DEAE-52 纤维素柱层析对牡丹花蕊水溶性多糖分离纯化，用0、0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl 溶液进行梯度洗脱，采用自动馏分收集器收集，用苯酚-硫酸法[11]测吸光度，得到3 个多糖馏分（WSP-1、WSP-2、WSP-3），60 ℃旋转蒸发浓缩，透析48 h，冷冻干燥。利用α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性测定样品的降糖作用，具体方法参考文献[12-13]，并按照下列公式计算抑制率。
式中：A1 为样品组（α-淀粉酶/葡萄糖苷酶和待测品）吸光度；A2 为样品空白组（不含有α-淀粉酶/葡萄糖苷酶的样品）吸光度；A3 为对照组（含有α-淀粉酶/葡萄糖苷酶，不含样品）吸光度；A4 为空白组（不含α-淀粉酶/葡萄糖苷酶和待测品）吸光度。
1.3.4 葡聚糖凝胶柱层析纯化牡丹花蕊水溶性多糖组分及纯度鉴定
采用Sephadex G-100 对降血糖作用效果好的组分进一步分离纯化，层析柱规格1.6 cm×60 cm，蒸馏水进行洗脱，自动馏分收集器收集，用苯酚-硫酸法测吸光度，绘制洗脱曲线。60 ℃旋转蒸发浓缩，透析48 h，冷冻干燥。并将样品进行紫外光谱分析。
1.3.5 理化性质测定
1.3.5.1 扫描电镜测定
取样品WSP-3 黏附在扫描电子显微镜样品盘上，用粉尘球吹走多余的样品，观察样品表面结构。
1.3.5.2 分子量测定
通过高效凝胶渗透色谱（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）[14]测定多糖分子量和纯度，色谱柱：BRT105-104-102 串联凝胶柱（8 mm×300 mm）；流动相：0.05 mol/L NaCl 溶液；流速：0.6 mL/min，柱温：40 ℃；进样量：20 μL；检测器：示差检测器RI-10A。
1.3.5.3 化学组成测定
采用苯酚-硫酸法、考马斯亮蓝法、咔唑-硫酸法分别测定总糖含量、蛋白质含量和糖醛酸含量[15-16]。
1.3.5.4 傅里叶变换红外光谱测定
将WSP-3 和KBr 按质量比1 ∶100 混合研磨，在4 000 cm-1～500 cm-1 的条件下，测定多糖的有机官能团。
1.3.5.5 刚果红试验
采用紫外分光光度计在400 nm～600 nm 波长处进行扫描，刚果红作为对照，测定在碱性条件下的最大吸收波长。
1.4 抗氧化活性分析
1.4.1 DPPH 自由基清除率测定
参考文献[17]测定DPPH 自由基清除率。
1.4.2 ·OH 清除率测定
参考文献[18]的方法测定。
1.4.3 ABTS+·清除率测定
参考文献[19]的方法测定。
1.5 数据处理分析
试验数据处理采用Excel 软件，所有结果3 次重复，以平均值±标准差表示，Origin 8.5 软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 阴离子交换柱层析分离牡丹花蕊水溶性多糖及体外降血糖作用测定结果
牡丹花蕊水溶性多糖的DEAE-52 柱层析洗脱结果见图1。
图1 牡丹花蕊水溶性多糖的DEAE-52 柱层析洗脱
Fig.1 DEAE-52 column chromatographic elution of watersoluble polysaccharides from peony pistil
DEAE-52 纤维素为阴离子交换柱层析，使用不同浓度的NaCl 溶液作为洗脱液，根据样品所带电荷的强弱将其分为不同的组分。如图1 所示，经过0、0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl 溶液洗脱，得到的3 个馏分为酸性多糖（WSP-1、WSP-2、WSP-3），回收率分别为7.3%、6.5%、11.7%。对初步纯化的样品WSP-1、WSP-2、WSP-3 进行体外降血糖实验，结果如图2 所示。
图2 多糖对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制作用
Fig.2 Inhibition of α-amylase and α-glucosidase activity
由图2 可知，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制作用随着质量浓度的增加不断增大，这可能是由多糖与其反应机制不同造成。经计算得出WSP-3 的半抑制浓度（IC50）＜WSP-1 的半抑制浓度（IC50）＜WSP-2 的半抑制浓度（IC50）。结果表明，WSP-3 的降血糖作用强于WSP-1 和WSP-2，抗氧化活性与降血糖作用密切相关[20]。因此，选用回收率高且降血糖作用效果好的WSP-3 进行下一步纯化。
2.2 葡聚糖凝胶G-100 柱层析纯化分析结果
WSP-3 的Sephadex G-100 洗脱曲线见图3。
图3 WSP-3 的Sephadex G-100 洗脱曲线
Fig.3 Sephadex G-100 elution curve of WSP-3
如图3 所示，WSP-3 经Sephadex G-100 纯化后得到单一峰，说明该多糖纯度较高，透析后冷冻干燥回收率为47%左右。
WSP-3 组分的紫外光谱扫描结果见图4。
图4 WSP-3 组分的紫外光谱扫描
Fig.4 Ultraviolet spectral scanning of WSP-3 components
通过紫外扫描光谱可以判断溶液在200 nm～400 nm有无吸收峰，是否存在蛋白质和核酸。如图4 所示，WSP-3 组分在260 nm 和280 nm 处无明显的吸收峰，初步表明纯化出的WSP-3 可能不含有或仅含极少量核酸、蛋白质、色素等杂质，说明WSP-3 为纯度较高的单一组分。
2.3 理化性质结果分析
2.3.1 扫描电镜分析
WSP-3 扫描电镜结果见图5。
图5 WSP-3 扫描电子显微镜
Fig.5 Scanning electron microscopy of WSP-3
如图5 所示，在1 500 倍下观察牡丹花蕊水溶性多糖纯化组分显示细丝状和小螺旋的棒状结构，这有可能与多糖分子量及组分中不同分子排布有关，研究表明，具有空间构象和螺旋结构可以使多糖具有较好的活性[21]；出现聚集趋势，有可能是多糖分子中存在大量的羟基和碳氢键，分子间易形成氢键而相互缠绕在一起导致结构紧密、层次不一；有少量圆球状，表明多糖中没有蛋白质等杂质，纯化程度较高，与紫外光谱分析结果相一致。吴慧玉[22]对黄秋葵花多糖的研究表明，链的构象和形态变化导致多糖活性差异，而独特的支化构象通过吸附葡萄糖起到降血糖作用，因此形态构象也有助于研究其活性。
2.3.2 WSP-3 分子量测定结果
WSP-3 的HPGPC 色谱见图6。
图6 WSP-3 的HPGPC 色谱
Fig.6 HPGPC chromatogram of WSP-3
如图6 所示，单一的对称峰说明该组分为纯多糖且分子量均一，与图4 纯化结果相一致，说明用该方法纯化可行，以葡萄糖为对照求得校正曲线方程为y =-0.193 9x+12.27（R2=0.992 4）；经计算，WSP-3 的分子量为14 351 Da 左右。植物多糖的制备方法和来源不会对单糖组成和分子量的大小产生较大影响，但分子量的大小可以影响其生物活性，高分子量多糖结构复杂，表现出较高的生物活性，而分子量过低很难构成“活性中心”[23]，因此，高分子量的WSP-3 具有研究意义。
2.3.3 化学组成测定结果
WSP-3 化学组成见表1。
表1 WSP-3 化学组成
Table 1 Chemical composition of WSP-3
名称 总糖/% 蛋白质/% 糖醛酸/%WSP-3 82.00±0.50 0.04±0.02 6.70±0.25
如表1 所示，WSP-3 的总糖含量为82.00%，说明多糖纯度较高；蛋白质含量为0.04%，含量较低，与紫外光谱在280 nm 处无明显吸收峰的结果相一致；糖醛酸含量为6.70%。
2.3.4 傅里叶变换红外吸收光谱分析
红外光谱可以反映多糖分子中的官能团和原子振动，且多糖含有很强的红外吸收峰，因此，可采用红外光谱分析官能团的振动类型。WSP-3 傅里叶变换红外吸收光谱见图7。
图7 WSP-3 傅里叶变换红外吸收光谱
Fig.7 WSP-3 Fourier transform infrared absorption spectrum
如图7 所示，在3 391.07 cm-1 附近出现宽而强的吸收峰，表明存在-OH；在2 931.62 cm-1 处出现较弱的吸收峰，表明是由C-H 不对称伸缩振动引起，以上2 个吸收峰均为糖类化合物的特征吸收峰。在1 615.55 cm-1和1 415.54 cm-1 附近的特征吸收峰分别是由C=O 非对称、C-H 变角伸缩振动引起，表明WSP-3 存在糖醛酸且是一种酸性多糖，与前面测定的糖醛酸含量结果相一致；在1 651 cm-1 和1 555 cm-1 附近没有N-H 吸收峰，说明WSP-3 蛋白含量较低，与化学组成结果相符。在1 094.15 cm-1 附近可能为C-O-H、O-H 的变角振动峰引起，推测为吡喃糖[24]。在637.99 cm-1 存在弱的吸收峰，表明存在α-糖苷键[25]。以上结果表明，WSP-3 可能为α-构型吡喃糖的酸性多糖，这与DEAE-52 纤维素离子交换层析中的层析结果相符合。
2.3.5 刚果红试验分析
WSP-3 刚果红试验结果见图8。
图8 WSP-3 刚果红试验结果
Fig.8 WSP-3 Congo red test results
在碱性溶液中刚果红可与三螺旋结构的多糖形成稳定化合物，在可见光范围内通过发生最大波长红移来判断是否含有三螺旋结构。相关文献指出多糖以螺旋的形式存在，将发挥重要的功能活性，其中三螺旋结构存在β-1，3-分支残基，可提高抗氧化活性[26]。如图8 所示，当NaOH 浓度达到0.1 mol/L 时，波长达到最大，产生最大红移，表明分子间的作用力发生了变化，因此可推测WSP-3 具有三螺旋结构。
2.4 抗氧化活性结果分析
WSP-3 的抗氧化活性测定结果见图9。
图9 WSP-3 的抗氧化活性
Fig.9 Antioxidant activity of WSP-3
多糖抗氧化活性是多种因素共同作用的结果，包括蛋白质、单糖组成、糖醛酸含量和分子量。如图9 所示，WSP-3 的DPPH 自由基清除率、·OH 清除率和ABTS+·清除率均随着质量浓度的增加不断增大，虽远小于同等浓度的VC，但均具有良好的抗氧化活性，其中DPPH 自由基、·OH、ABTS+自由基的IC50 分别为3.38、3.05、3.39 μg/mL。这可能与多糖中的分子量、活性基团数量、β 残基和糖苷键有关，还可能与单糖组成（葡萄糖醛酸、半乳糖和葡萄糖）相关[27]。高分子量的多糖空间结构更稳定，有利于维持生物活性，且分子量越大抗氧化活性越好[28]。据文献[29]报道，糖醛酸含量与抗氧化活性呈正相关，由于多糖中的糖醛酸具有亲电基团会激发多糖分子端基的氢原子，提高供氢能力，终止自由基的链反应，达到抗氧化效果；而薛依涵[9]研究表明，牡丹花蕊多糖主要由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等组成，且提取方式并不影响单糖组成[21]，因此WSP-3 抗氧化活性也与该组分相关，这与本研究结果相吻合。以上结果说明，多糖抗氧化活性不仅与降血糖效果有关，还与分子组成等因素密切相关。
3 结论
通过超声复合酶法提取牡丹花蕊水溶性粗多糖，经过脱色、脱蛋白处理后，再经阴离子DEAE-52 柱层析、Sephadex G-100 葡聚糖凝胶色谱分离纯化得到纯度较高的WSP-3 单一组分。理化结构性质研究表明：WSP-3 是具有三螺旋构象的均一酸性多糖，含有α-糖苷键，分子量为14 351 Da。抗氧化活性结果表明：WSP-3 有良好的体外降血糖功效和DPPH 自由基、·OH 和ABTS+·清除能力，这有可能与分子量、单糖组成、糖链构型和糖苷键有关，DPPH 自由基、·OH、ABTS+·的IC50分别为3.38、3.05、3.39 μg/mL。
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