蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand-Mazz）是菊科蒲公英属的多年生草本植物，别名婆婆丁、白鼓丁、华花郎、黄花地丁等[1]，不仅富含蛋白质、脂肪酸、氨基酸、维生素及微量元素，同时含有黄酮类、酚酸类、甾醇类、多糖类等多种功效成分[2]，具有清热解毒、消肿散结、利尿通淋的功效[3]。
从蒲公英中提取总多酚、绿原酸、黄酮、多糖及有效成分混合物等已有较多研究[4-10]，但有关蒲公英菊苣酸的提取却鲜有研究。菊苣酸由咖啡酸和酒石酸缩合而成，属咖啡酸衍生物，是蒲公英中主要的标志性功效成分[11]，具有较强的自由基清除能力，能对胶原蛋白降解起保护作用，还具有抗肥胖、抗病毒和降血糖等功能[12-13]，同时能通过清除活性氧抑制炎症细胞活化，起到抗炎作用[14]。为充分利用蒲公英资源，本文对蒲公英菊苣酸的溶出特性及抗氧化活性进行研究，以期丰富蒲公英中菊苣酸成分的抗氧化理论，为进一步开发利用蒲公英资源提供参考。
1 材料与设备
1.1 材料与试剂
菊苣酸对照品（纯度≥98%）、1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海源叶生物科技有限公司；2，2＇-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐[diammonium 2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate），ABTS]：美国Sigma 公司；蒲公英干燥全草：亳州市众益堂中药材销售有限公司；乙腈（色谱纯）：赛默飞世尔科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
高速中药粉碎机（ZN-200A）：长沙市岳麓区中南制药机械厂；高效液相色谱仪（LC-20AT）：日本岛津有限公司；十万分之一天平（BT25s）：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；可见分光光度计（WFJ-7200）：尤尼柯（上海）仪器有限公司。
2 试验方法
2.1 试验流程
2.1.1 样品溶液的制备
参照文献[15]的方法并略作改动。通过预试验确定提取蒲公英菊苣酸的适宜乙醇浓度为70%，在此基础上，取蒲公英粉末6 g 置于250 mL 磨口烧瓶中，加入浓度为70%的乙醇溶液，于不同的提取温度、料液比和蒲公英粉末粒度下分别提取30、60、90、120、150、180 min 取样，冷却至室温25 ℃并经0.45 μm 微孔滤膜过滤后，用于测定菊苣酸浓度及其抗氧化活性。
2.1.2 不同条件对菊苣酸溶出的影响
2.1.2.1 蒲公英粉末粒度对菊苣酸溶出的影响
在料液比1 ∶30（g/mL）、提取温度80 ℃条件下，分别取20、40、60 目的蒲公英粉末加入浓度70%的乙醇溶液并分别提取30、60、90、120、150、180 min，取样测定菊苣酸浓度，计算菊苣酸的溶出量和平均溶出速率。
2.1.2.2 料液比对蒲公英中菊苣酸溶出的影响
在粉末粒度为60 目、提取温度80 ℃条件下，分别以料液比1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g/mL）加入浓度70%的乙醇溶液并分别提取30、60、90、120、150、180 min，取样测定菊苣酸浓度，计算菊苣酸的溶出量和平均溶出速率。
2.1.2.3 温度对蒲公英中菊苣酸溶出的影响
在料液比1 ∶30（g/mL）、粉末粒度为60 目条件下，加入浓度70%的乙醇溶液，分别以60、70、80 ℃提取30、60、90、120、150、180 min，取样测定菊苣酸浓度，计算菊苣酸的溶出量和平均溶出速率。
2.2 分析方法
2.2.1 菊苣酸测定
精密称取菊苣酸对照品0.010 59 g，加入70%乙醇溶液溶解定容至25 mL，配制成菊苣酸浓度为423.6 mg/L的菊苣酸母液。用移液管精密移取菊苣酸母液，用70%乙醇溶液定容至10 mL，配制21.18、42.36、84.72、169.44、338.88、423.60 mg/L 不同浓度梯度的标准品溶液。测定各浓度的标准品溶液对应的峰面积，绘制标准曲线。
参照文献[16]的方法并略作改动，色谱条件为色谱柱Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相A 为乙腈，流动相B 为0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～15 min，9%～12%A；15 min～16 min，12%～18%A；16 min～30 min，18%～20% A；30 min～42 min，20%～50% A；42 min～55 min，50%A；检测波长为330 nm，流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL，柱温为40 ℃。
采用保留时间定性，标准曲线定量。经测定，菊苣酸浓度y（mg/L）与峰面积x 的线性方程为y=15 967x-23 908，R2=0.999 9，线性关系良好，线性范围为21.2 mg/L～423.6 mg/L。
2.2.2 抗氧化活性测定
2.2.2.1 DPPH·清除能力的测定
参照文献[17]的方法并略作改动。精确配制浓度为0.1 mmol/L 的DPPH-乙醇溶液，避光保存备用。将2.0 mL DPPH-乙醇溶液与2.0 mL 蒲公英醇提物充分混匀，避光反应30 min 后，测定517 nm 波长处吸光度Ai；以等体积无水乙醇代替蒲公英醇提物，同法操作，测定吸光度A0；以等体积的无水乙醇代替DPPH-乙醇溶液，加入蒲公英醇提物，同法操作，测定吸光度Ai0。以相同浓度的菊苣酸标准品溶液代替蒲公英醇提物，同法操作，对比蒲公英醇提物与菊苣酸标准品溶液对DPPH·清除能力的差异。每组3 次重复，取其平均值，DPPH·清除率计算公式如下。
2.2.2.2 ABTS+·清除能力的测定
参照文献[18]的方法测定。将88 μL（140 mmol/L）氧化剂过硫酸钾溶液与5 mL 7 mmol/L ABTS+·溶液混合，配制成ABTS·+母液并在室温25 ℃避光条件下静置过夜12 h～16 h，用蒸馏水将ABTS+·母液稀释，使其在734 nm 波长处吸光度为0.70±0.02，此为ABTS+·工作液，记作A（0现用现配）。取0.1 mL 蒲公英醇提物与1.4 mL ABTS+·工作液漩涡振荡混匀，于室温25 ℃避光反应6 min 后，在734 nm 波长处测定吸光度Ai。以相同浓度的菊苣酸标准品溶液代替蒲公英醇提物，同法操作，对比蒲公英醇提物与菊苣酸标准品溶液对ABTS·+清除能力的差异。每组3 次重复，取其平均值，ABTS+·清除率计算公式如下。
2.2.2.3 蒲公英菊苣酸的抗氧化活性测定
在蒲公英粉末粒度60 目、料液比1 ∶30（g/mL）、温度80 ℃条件下，测定提取30、60、90、120、150、180 min后提取液中的菊苣酸浓度，配制相同浓度的菊苣酸标准品溶液。以相同浓度的菊苣酸标准品溶液代替蒲公英醇提物，比较蒲公英醇提物与同浓度菊苣酸标准品溶液清除DPPH 自由基和ABTS+·的差异。
2.3 数据处理
采用Excel 2010 整理试验数据，应用统计分析软件SPSS 21.0 对数据进行显著性分析、相关性分析，采用Origin 2019b 软件进行数据拟合。
3 结果与分析
3.1 蒲公英粉末粒度对菊苣酸溶出的影响
不同蒲公英粉末粒度对菊苣酸溶出量和平均溶出速率的影响如图1 和图2 所示。
图1 不同蒲公英粉末粒度对菊苣酸溶出量的影响
Fig.1 Effect of different powder particle size on dissolution of cichoric acid
图2 不同蒲公英粉末粒度对菊苣酸平均溶出速率的影响
Fig.2 Effect of different powder particle size on average dissolution rate of cichoric acid
由图1、图2 可知，蒲公英菊苣酸的溶出量随提取时间延长而增加，平均溶出速率则随时间延长逐渐降低。提取时间短于60 min 时，溶出量随时间延长而快速增加，平均溶出速率快速降低；60 min 后溶出量随时间延长缓慢增加，平均溶出速率随时间延长缓慢降低。提取时间相同时，不同粒度蒲公英的菊苣酸溶出量及平均溶出速率不同，粒度越小，溶出量和平均溶出速率越大。可能一方面是由于粒度越小，乙醇溶液与其接触的表面积越大，同时菊苣酸从颗粒内部扩散至表面的距离越短，促进了菊苣酸的溶出；另一方面粒度越小，蒲公英植物组织破坏越严重，其对菊苣酸溶解和扩散阻碍越小，使菊苣酸的溶出数量越多。
3.2 料液比对蒲公英中菊苣酸溶出的影响
不同料液比对菊苣酸溶出量和平均溶出速率的影响如图3 和图4 所示。
图3 不同料液比对菊苣酸溶出量的影响
Fig.3 Effect of different solid-liquid ratio on dissolution of cichoric acid
图4 不同料液比对菊苣酸平均溶出速率的影响
Fig.4 Effect of different solid-liquid ratio on average dissolution rate of cichoric acid
由图3、图4 可知，料液比不同时，蒲公英菊苣酸的溶出量随时间延长逐渐增加，平均溶出速率则随时间延长逐渐降低。提取时间短于60 min 时，溶出量随提取时间延长快速增加，平均溶出速率随提取时间延长快速降低；60 min 后溶出量随时间延长缓慢增加，平均溶出速率随时间延长缓慢降低。不同料液比在提取时间相同时，菊苣酸的溶出量、平均溶出速率不同，料液比为1 ∶30（g/mL）时，菊苣酸的溶出量、平均溶出速率大于料液比为1 ∶25（g/mL）和1 ∶35（g/mL）。可能一方面是由于随着溶剂量的增大，颗粒中菊苣酸浓度与液相主体中菊苣酸浓度之差增大，促进了菊苣酸的溶出；另一方面则由于菊苣酸在高温下稳定性降低[19]，使得溶出的菊苣酸在溶液中被降解，该结果提示溶液中菊苣酸浓度越低，越易因高温而不稳定。
3.3 温度对蒲公英中菊苣酸溶出的影响
不同提取温度对菊苣酸溶出量和平均溶出速率的影响结果如图5 和图6 所示。
图5 不同提取温度对菊苣酸溶出量的影响
Fig.5 Effects of different extraction temperatures on dissolution of cichoric acid
图6 不同提取温度对菊苣酸平均溶出速率的影响
Fig.6 Effect of different extraction temperature on average dissolution rate of cichoric acid
由图5、图6 可知，提取温度不同时，蒲公英菊苣酸的溶出量均随提取时间延长逐渐增加，平均溶出速率随时间延长逐渐降低。提取时间短于60 min 时，溶出量随时间延长快速增加，平均溶出速率随时间延长快速降低；60 min 后溶出量随时间延长缓慢增加，平均溶出速率随时间延长缓慢降低。蒲公英菊苣酸溶出量、平均溶出速率随温度升高而增加，试验范围内，提取温度为80 ℃时蒲公英菊苣酸的溶出量、平均溶出速率最大。可能原因是温度升高，分子扩散速度加快，促进了菊苣酸的溶出，同时菊苣酸的溶出速率大于降解速率。
综合粒度、料液比和温度对蒲公英菊苣酸溶出的影响，确定适宜的提取条件为粒度60 目、料液比1 ∶30（g/mL）、温度80 ℃。
3.4 蒲公英菊苣酸的抗氧化活性测定结果
以菊苣酸浓度为横坐标，分别以DPPH·、ABTS·+清除率为纵坐标，结果如图7、图8 所示。
图7 蒲公英醇提物及菊苣酸标准品溶液对DPPH 自由基的清除率
Fig.7 Scavenging rate of dandelion ethanol extract and cichoric acid standard solution on DPPH free radical
图8 蒲公英醇提物及菊苣酸标准品溶液对ABTS+·的清除率
Fig.8 Scavenging rate of dandelion ethanol extract and cichoric acid standard solution on ABTS+·
由图7、图8 可知，相同菊苣酸浓度的蒲公英醇提物和菊苣酸标准品溶液对DPPH·、ABTS+·均具有清除效果，菊苣酸标准品溶液对DPPH·、ABTS+·的清除率随浓度增加线性增加，提取180 min 时取样所得的蒲公英醇提物，其对DPPH·、ABTS+·的清除率分别达到95.47%和88.27%，其中菊苣酸对DPPH·和ABTS·+的清除率分别为77.86%和35.03%，结果表明蒲公英醇提物不仅能有效清除DPPH·和ABTS·+，而且蒲公英中的菊苣酸清除DPPH·的效果明显优于清除ABTS·+。
将菊苣酸含量与抗氧化活性作相关性分析，结果如表1 所示。
表1 菊苣酸含量与抗氧化活性的相关性分析
Table 1 Correlation Analysis between cichoric acid content and antioxidant activity
注：**表示差异极显著（P＜0.01）。
指标 菊苣酸含量 DPPH 自由基清除率 ABTS+·清除率菊苣酸含量 1.00 DPPH·清除率 0.890** 1.00 ABTS+·清除率 0.903** 0.747** 1.00
由表1 可知，菊苣酸含量与DPPH·清除率和ABTS+·清除率之间均极显著正相关（P＜0.01），相关系数分别为0.890 和0.903。孟创鸽等[20]研究菊苣中菊苣酸含量与抗氧化能力间的关系及谢惠枫[21]研究菊苣酸含量与紫锥菊抗氧化性能比较分析中，同样发现菊苣酸含量与DPPH·、ABTS·+清除能力间呈显著正相关。试验结果表明，菊苣酸含量与DPPH·、ABTS+·清除能力之间关系密切，呈现明显的量效关系。
4 结论
蒲公英菊苣酸的溶出特性不受蒲公英粉末粒度、料液比、提取温度影响，当提取时间短于60 min 时，溶出量快速增加，平均溶出速率快速降低；当提取时间长于60 min 时，溶出量缓慢增加，平均溶出速率缓慢降低。
菊苣酸溶出量和平均溶出速率受蒲公英粉末粒度、料液比、温度等影响，溶出量、平均溶出速率随蒲公英粉末粒度降低而增加，随提取温度升高而增加，随料液比增加而先增加后降低，适宜的蒲公英菊苣酸提取条件为蒲公英粉末粒度60 目、温度80 ℃、料液比1 ∶30（g/mL）。
蒲公英醇提物能有效清除DPPH·和ABTS·+，其中菊苣酸是重要的抗氧化活性成分，对DPPH·和ABTS·+的清除率随菊苣酸浓度增加呈线性增加，其清除DPPH·的效果明显优于清除ABTS+·。
[1] 许先猛,董文宾,卢军,等.蒲公英的化学成分和功能特性的研究进展[J].食品安全质量检测学报,2018,9(7):1623-1627.XU Xianmeng,DONG Wenbin,LU Jun,et al.Research progress on the chemical compositions and functional properties of dandelion[J].Journal of Food Safety&Quality,2018,9(7):1623-1627.
[2] 孟然,薛志忠,鲁雪林,等.蒲公英的功效成分与药理作用研究进展[J].江苏农业科学,2021,49(9):36-43.MENG Ran,XUE Zhizhong,LU Xuelin,et al.Research progress on active components and pharmacological effects of Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz[J].Jiangsu Agricultural Sciences,2021,49(9):36-43.
[3] 聂文佳,徐帅师,张咏梅.蒲公英有效成分及其药理作用研究进展[J].辽宁中医药大学学报,2020,22(7):140-145.NIE Wenjia,XU Shuaishi,ZHANG Yongmei.Advances in the study of effective components and pharmacological action of dandelion[J].Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,2020,22(7):140-145.
[4] 王鹏,郭丽,徐连杰,等.超声波辅助提取蒲公英茶中多酚工艺优化及抗氧化特性研究[J].食品科技,2015,40(6):251-257.WANG Peng,GUO Li,XU Lianjie,et al.Optimization of ultrasonicassisted extraction and antioxidant properties on polyphenols from dandelion tea[J]. Food Science and Technology, 2015, 40(6): 251-257.
[5] 袁河.蒲公英中黄酮类化合物的提取纯化及应用研究[D].长沙:湖南农业大学,2015.YUAN He. Study on extraction, purification and application of the flavonoids from dandelion[D]. Changsha: Hunan Agricultural University,2015.
[6] 王鹏,郭丽,李杨.不同浸提方式对蒲公英提取液抗氧化活性的影响[J].食品科技,2018,43(2):253-258.WANG Peng, GUO Li, LI Yang. Effects of different leaching methods on antioxidant activity of dandelion extract[J].Food Science and Technology,2018,43(2):253-258.
[7] 倪悦,徐达,孙强,等.蒲公英绿原酸的酶法提取及其在卷烟中的应用[J].安徽农业科学,2016,44(17):107-110,226.NI Yue, XU Da, SUN Qiang, et al. Enzymatic extraction of chlorogenic acid from dandelion and its application in cigarette[J].Journal of Anhui Agricultural Sciences,2016,44(17):107-110,226.
[8] 张丹,王昌利,卜雕雕,等.Box-Behnken 响应面法优化蒲公英酚酸提取工艺[J].中南药学,2019,17(5):667-671.ZHANG Dan, WANG Changli, BU Diaodiao, et al. Optimization of extraction technology of phenolic acids from dandelion by Box-Behnken response surface methodology[J].Central South Pharmacy,2019,17(5):667-671.
[9] 王英超,王蕾,金红,等.超声微波协同萃取法提取菊苣酸条件研究[J].食品研究与开发,2015,36(15):28-31.WANG Yingchao, WANG Lei, JIN Hong, et al. Study on extraction conditions of ultrasonic microwave synergistic extraction method of cichoric acid[J].Food Research and Development,2015,36(15):28-31.
[10] 宋歆睿.蒲公英主要活性成分的提取富集及初步活性评估[D].哈尔滨:东北林业大学,2020.SONG Xinrui.Extraction and enrichment of main active components of dandelion and preliminary activity evaluation[D].Harbin:Northeast Forestry University,2020.
[11] 国家药典委员会.中华人民共和国药典-四部:2020 年版[M].北京:中国医药科技出版社,2020.China Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(PRC)-part four:2020 edition[M].Beijing:China Medical Science and Technology Press,2020.
[12] SAAD E M,MADBOULY A, AYOUB N, et al. Preparation and application of molecularly imprinted polymer for isolation of chicoric acid from Chicorium intybus L.medicinal plant[J].Analytica Chimica Acta,2015,877:80-89.
[13] LIU Q,LIU F,ZHANG L L, et al. Comparison of chicoric acid, and its metabolites caffeic acid and caftaric acid: In vitro protection of biological macromolecules and inflammatory responses in BV2 microglial cells[J].Food Science and Human Wellness,2017,6(4):155-166.
[14] XUE Y S, ZHANG S M, DU M, et al. Dandelion extract suppresses reactive oxidative species and inflammasome in intestinal epithelial cells[J].Journal of Functional Foods,2017,29:10-18.
[15] 高振鹏.猕猴桃中多酚的提取条件优化及其动力学模型构建[D].南京:南京农业大学,2014.GAO Zhenpeng. Optimization of extraction technology of kiwi fruit polyphenols and construction of kinetic model[D].Nanjing:Nanjing Agricultural University,2014.
[16] 李超,董自波,蒋金来,等.HPLC 法测定蒲公英中菊苣酸、咖啡酸与绿原酸[J].中草药,2015,46(23):3577-3580.LI Chao,DONG Zibo,JIANG Jinlai,et al.Determination of cichoric acid,caffeic acid,and chlorogenic acid in taraxaci herba by HPLC[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs,2015,46(23):3577-3580.
[17] 许瑞如,张秀玲,李晨,等.微波提取桔梗根多酚工艺优化及抗氧化特性研究[J].食品与发酵工业,2020,46(4):187-196.XU Ruiru, ZHANG Xiuling, LI Chen, et al. Optimization of microwave-assisted extraction polyphenols from Platycodon grandiflorum roots and study of its antioxidant properties[J]. Food and Fermentation Industries,2020,46(4):187-196.
[18] 李斌,雷月,孟宪军,等.响应面试验优化超声波辅助提取蓝靛果多酚工艺及其抗氧化活性[J].食品科学,2015,36(22):33-39.LI Bin,LEI Yue,MENG Xianjun,et al.Optimization of ultrasonicassisted extraction of polyphenols from haskap berries(Lonicera caerulea L.) using response surface methodology and their antioxidant capacity[J].Food Science,2015,36(22):33-39.
[19] 甘婧,李光辉,封雨晴,等.外界环境和食品体系对菊苣酸稳定性的影响[J].食品科学,2015,36(15):24-28.GAN Jing, LI Guanghui, FENG Yuqing, et al. Stability of cichoric acid influenced by different physical factors and food environments[J].Food Science,2015,36(15):24-28.
[20] 孟创鸽,傅虹飞,陈香维,等.菊苣中菊苣酸的提取及抗氧化活性研究[J].食品安全质量检测学报,2015,6(11):4460-4467.MENG Chuangge,FU Hongfei,CHEN Xiangwei,et al.Study on extraction and antioxidant activity of cichoric acid from Cichorium lntybus L[J]. Journal of Food Safety & Quality, 2015, 6(11): 4460-4467.
[21] 谢惠枫. 不同倍性紫锥菊多酚物质含量及抗氧化活性比较研究[D].广州:华南农业大学,2019.XIE Huifeng.Comparative study on polyphenol contents and antioxidant activities of different ploidy Echinacea purpurea(L.)moench[D].Guangzhou:South China Agricultural University,2019.