刺梨作为新兴水果在四川大凉山盛产，因其果实风味独特，且具有良好的药食两用价值而被人们广泛关注[1]。刺梨的活性物质含量丰富，鲜果中维生素C 含量为841.58 mg/100 g～3 541.13 mg/100 g[2]。雷波脐橙和盐源苹果也是大凉山地理标志性水果，总酚含量较高。由于刺梨适口性差，味酸涩且苦[3]，不宜直接食用，常与其他水果复配成营养高、味道佳的产品。有研究表明，不同水果的复配可能出现协同或者拮抗的抗氧化作用[4]。例如，汤晓等[5]研究水果混合后的黄酮抗氧化活性，结果表明多数水果混合后的抗氧化活性呈拮抗作用，而抗氧化活性较强的水果混合后相互作用却以协同及加合为主。邹仕昱等[6]以桑葚、蓝莓和红薯为原料，研究单一农产品提取物的抗氧化活性，以及两两农产品提取物按照一定质量比混合后的抗氧化活性，结果表明水溶性和脂溶性农产品组合后协同抗氧化效果最好，即红薯与蓝莓复配后协同抗氧化效果最好。
本研究通过测定刺梨与脐橙、苹果复配后，其对DPPH 自由基、·O2-和·OH 的清除能力，以探究刺梨与不同水果协同抗氧化效果，以期为刺梨的合理搭配提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
野生刺梨、雷波脐橙、盐源苹果：产自四川凉山；福林酚溶液、芦丁标准品、没食子酸标准品、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）标准品：合肥博美生物科技有限责任公司；无水乙醇、无水碳酸钠、2，6 -二氯靛酚、Al（NO3）3、二水合草酸、NaNO2：成都市科隆化学品有限公司；双氧水、维生素C 标准品、氢氧化钠：成都金山化学试剂有限公司；FeSO4：天津市恒兴化学试剂制造有限公司。以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
KDC-1044 低速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；KH3200B 超声波清洗机：昆山禾创超声仪器有限公司；FA2004 万分之一天平：常州市幸运电子设备有限公司；HMC-15A 恒温水浴锅：常州诺基仪器有限公司；902GP 冰箱：赛默飞世尔科技有限公司；UV754紫外分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；LGJ-10C 冷冻干燥机：澳柯玛股份有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 原料预处理
将新鲜的刺梨剪去尖刺、去头剪尾除去果核；新鲜脐橙剥去外壳，扯下囊瓣，去掉果核；新鲜苹果去掉果核，洗净，避光晾干表面水分，切成小块，放入-80 ℃超低温冰箱速冻24 h，送入冷冻干燥机冻干48 h。冻干后粉碎，过40 目筛，用自封袋分装，放入-80 ℃超低温冰箱保存[6]。
1.3.2 原料样品的制备
刺梨与苹果、刺梨与脐橙、脐橙与苹果按照质量比1 ∶9、3 ∶7、5 ∶5、7 ∶3、9 ∶1 复配，复配后水果总质量为1 g。再加入30 mL 55%乙醇溶液，以50 ℃、40 kHz的超声条件提取50 min 后过滤，将全部滤液用55%乙醇溶液定容至50 mL，备用[7]。
1.3.3 总酚含量的测定
采用Folin-Denis 法[8]，分别精密量取样液1 mL，置于25 mL 试管中，先加入福林酚试剂2.5 mL，充分摇匀5 min 后，加入7%Na2CO3 溶液5 mL，用超纯水定容至25 mL 容量瓶中。70 ℃水浴反应40 min，在765 nm波长处，测定样液吸光度，以没食子酸质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得回归方程y=0.127 5x+0.062 5（R2=0.999 6），计算出具体样液中总酚含量。总酚含量以标准品的毫克数等量每百克干物质量样品原料表示。
1.3.4 总黄酮含量的测定
采用NaNO2-Al（NO3）3 比色法[9]，以芦丁作为对照，吸取2 mL 提取液，加入0.4 mL 5%NaNO2 溶液，摇匀后放置6 min，加入0.6 mL 10%Al（NO3）3 溶液，摇匀后放置6 min，然后加入4 mL 4%NaOH 溶液，用55%乙醇溶液定容至10 mL，摇匀放置15 min 后于波长510 nm处测吸光度，重复3 次，以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得回归方程y=0.008 7x+0.002 6（R2=0.999 3），计算出具体样液中总黄酮含量。
1.3.5 维生素C 含量的测定
参照GB 5009.86—2016《食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定》中2，6-二氯靛酚法测定维生素C含量[10]，称取样品1 g 放入预冷研钵中，加入10 mL 20 g/L草酸溶液迅速捣成匀浆，将样品转移至烧杯中，用草酸溶液将脐橙、苹果样品转移到100 mL 容量瓶并稀释至刻度线摇匀后过滤，取10 mL 溶液标定。将刺梨溶液转移到500 mL 容量瓶并稀释至刻度线摇匀后过滤，取10 mL 溶液测定。用已测定的2，6-二氯靛酚溶液滴定至出现微红色且30 s 内不褪色为止，记下滴定液的用量。同时，以10 mL 20 g/L 草酸溶液作为空白，按同样方法进行滴定，重复3 次。按下式计算维生素C 含量。
式中：Y 为维生素C 含量，mg/100 g；V 为待测液总体积，mL；V1 为样品消耗体积，mL；V0 为空白试剂消耗体积，mL；VS 为滴定所取体积，mL；m 为样品质量，g；ρ 为2，6-二氯靛酚溶液的滴定度，mg/mL。
1.3.6 抗氧化活性的测定
1.3.6.1 DPPH 自由基清除率测定
准确称取20 mg DPPH，用无水乙醇定容到250 mL容量瓶中，得到浓度为20mmol/L 的DPPH 溶液。取2mL样液及2 mL 的20 mmol/L DPPH 混匀后反应30 min，测定波长517 nm 下吸光度的变化，对照溶剂用无水乙醇代替，按下式计算DPPH·清除率[11]。
式中：M 为DPPH·清除率，%；Ai 为DPPH 试剂与样液的吸光度；Aj为无水乙醇与样液的吸光度；Ac 为DPPH 试剂与无水乙醇的吸光度。
1.3.6.2 羟基自由基（·OH）清除率测定
由于·OH 氧化水杨酸能产生在510 nm 处有特征吸收的2，3-二羟基苯甲酸，通过测定水杨酸捕获·OH所得到的产物确定·OH 的清除率。在25 mL 试管中加入3 mL 2 mmol/L FeSO4、3 mL 1 mmol/L H2O2，摇匀，接着加入3 mL 6 mmol/L 水杨酸，摇匀，于37 ℃水浴加热15 min 后取出，测其吸光度A0。然后分别加入1 mL不同浓度的样液，摇匀，继续水浴加热15 min，取出测其吸光度AX。按下式计算·OH 清除率[11]。
式中：N 为·OH 清除率，%；A0 为空白的吸光度；AX为样品的吸光度。
1.3.6.3 超氧阴离子自由基（·O2－）清除率测定
取0.05 mol/L、pH8.2 的Tris-HCl 缓冲液4.5 mL，置于25 ℃水浴中预热20 min，取出加入1 mL 不同种类的样液和0.4 mL 25 mmol/L 的邻苯三酚溶液，混匀后于25 ℃水浴中反应5 min，加入1.0 mL 8 mol/L HCl 终止反应，以Tris-HCl 缓冲液作参比，在299 nm 处测定吸光度，计算·O2-清除率。空白对照组以l mL 55%乙醇溶液代替样品。每个处理均做3 个重复，按下式计算·O2-清除率[11]。
式中：F 为超氧阴离子自由基清除率，%；A0 为空白组的吸光度；A1 为加入样品的吸光度。
1.4 数据处理
1.4.1 中效原理
数据分析根据Chou[12]的方法，中位效应方程如下。
式中：fa 为试验中受影响的部分，即本试验的清除率；fu 为试验中未受影响的部分，fu=1-fa；D 为受试水果浓度；Dm 为产生中位效应所需浓度（本试验以IC50表示）；m 为剂量-效应曲线的系数。
1.4.2 联合指数（combination index，CI）
将中位效应方程应用到两种物质的联合使用，利用CI 来量化两种物质的相互作用，公式如下。
式中：D1、D2 为联合使用时产生清除率X 两物质各自所需剂量；Dx1、Dx2 为联合使用的两物质单独使用产生清除率X 时所需的剂量。CI=1、CI＜1 和CI＞1 分别为受试物具有加合作用、协同作用、拮抗作用[13]。
2 结果与分析
2.1 3 种水果活性成分含量及抗氧化活性分析
3 种水果中的主要活性成分含量和抗氧化能力见表1 和表2。
表1 3 种水果中的主要活性成分含量
Table 1 Content of main active ingredients in the three fruits
样品名称 总酚含量/（mg/100 g）总黄酮含量/（mg/100 g）维生素C 含量/（mg/100 g）刺梨脐橙苹果922.44±7.30 57.42±1.06 64.41±0.08 283.43±3.14 17.67±0.37 6.70±0.22 971.95±5.14 44.41±0.74 3.61±0.04
表2 3 种水果自由基清除能力
Table 2 Free radicals-scavenging ability of the three fruits
样品名称 DPPH·清除试验IC50 值/（mg/mg）·O2-清除试验IC50 值/（mg/mg）·OH 清除试验IC50 值/（mg/mg）刺梨脐橙苹果0.10 0.13 0.31 0.48 18.19 10.04 0.06 1.74 4.89
由表1 可知，刺梨维生素C 含量为971.95 mg/100 g，总酚含量为922.44 mg/100 g，总黄酮含量为283.43 mg/100 g，均远高于脐橙和苹果。由表2 可知，在清除DPPH·和·OH 试验中，脐橙对两种自由基的IC50 值分别0.13 mg/mg 和1.74 mg/mg，低于苹果对两种自由基的IC50 值。然而脐橙清除·O2-的IC50 值为18.19 mg/mg，大于苹果清除·O2-的IC50 值（10.04 mg/mg）。分析其原因，可能是苹果在DPPH·清除试验和·OH 清除试验中总酚发挥的作用更强，而在·O2-清除试验中总黄酮和维生素C 贡献率更高[14]。
2.2 水果提取物抗氧化活性和相互作用分析
2.2.1 不同水果质量比体外抗氧化能力
不同水果质量比体外抗氧化能力见图1～图3。
图1 水果不同质量比下对·O2-的清除能力
Fig.1 The scavenging ability of different mass ratios on·O2-radic
图2 水果不同质量比下对羟基自由基的清除能力
Fig.2 Hydroxyl radicals-scavenging abilities of pairwise complexes of the three fruits at different mass ratios
图3 水果不同质量比下对DPPH 自由基的清除能力
Fig.3 DPPH scavenging abilities of pairwise complexes of the three fruits at different mass ratios
由图1～图3 可知，尽管刺梨的抗氧化活性物质含量远高于脐橙和苹果，但体外抗氧化能力并不是随着刺梨的质量增加而一直增加。这可能是由于3 种水果的抗氧化活性物质种类多样，当质量比达到一定时，其中的物质刚好达到较佳的协同率。Schaich 等[15]研究表明对DPPH·的清除有快速和慢速氢原子转移两种形式，其中维生素C 电子反应快于多酚，当其复配比例合适时，可将抗氧化能力提高。此外，Arts 等[16]研究·O2-的清除机理有电子转移法、氢原子转移法或自由基与某些芳香族化合物发生反应，不同的抗氧化物质对不同机理的自由基清除能力贡献率不一样，当抗氧化物质复合比例合适时可提高抗氧化能力。由图1 可知，当3 组水果质量比为1 ∶1 时，其对·O2-的清除能力均最强。同时3 种抗氧化试验表明有刺梨参与复配的试验组抗氧化能力明显强于脐橙苹果复配组，这与唐煜括等[17]试验结果一致，即抗氧化物质浓度与抗氧化活性之间存在较高的相关性。
2.2.2 不同水果复配体系自由基清除效果相互作用分析
2.2.2.1 超氧阴离子自由基（·O2-）清除效果相互作用分析
不同水果复配体系·O2-清除效果相互作用见图4～图6。
图4 刺梨和脐橙复配对·O2-清除率的联合指数
Fig.4 Combination index for the complex of roxburgh rose fruit and navel orange in·O2-scavenging rate
图5 刺梨和苹果复配对·O2-清除率的联合指数
Fig.5 Combination index for the complex of roxburgh rose fruit and apple in·O2-scavenging rate
图6 脐橙和苹果对·O2-清除率的联合指数
Fig.6 Combination index for the complex of navel orange and apple in·O2-scavenging rate
由图4～图6 可知，超氧阴离子自由基清除率测定试验中，刺梨-脐橙和刺梨-苹果的复配组CI 值均小于1，表明上述复配体系皆为协同作用[18]。但在脐橙-苹果复配组的超氧阴离子自由基清除率测定试验中只有9 ∶1 和1 ∶1 两种质量比的CI 小于1，说明脐橙-苹果复配组对·O2-的清除协同效果不佳。
2.2.2.2 羟基自由基清除效果相互作用分析
不同水果复配体系羟基自由基清除效果相互作用见图7～图9。
图7 刺梨和脐橙复配对·OH 清除率的联合指数
Fig.7 Combination index for the complex of roxburgh rose fruit and navel orange in·OH scavenging rate
图8 刺梨和苹果复配对·OH 清除率的联合指数
Fig.8 Combination index for the complex of roxburgh rose fruit and apple in·OH scavenging rate
图9 脐橙和苹果对·OH 清除率的联合指数
Fig.9 Combination index for the complex of navel orange and apple in·OH scavenging rate
由图7～图9 可知，刺梨-苹果复配组中仅有质量比1 ∶9 时表现为拮抗作用，而脐橙-苹果复配后对·OH清除作用的协同效果不佳。
2.2.2.3 DPPH 自由基清除效果相互作用分析
不同水果复配体系DPPH 自由基清除效果相互作用见图10～图12。
图10 刺梨和脐橙复配对DPPH·清除率的联合指数
Fig.10 Combination index for the complex of roxburgh rose fruit and navel orange in DPPH·scavenging rate
图11 刺梨和苹果复配对DPPH·清除率的联合指数
Fig.11 Combination index for the complex of roxburgh rose fruit and apple in DPPH·scavenging rate
图12 脐橙和苹果对DPPH·清除率的联合指数
Fig.12 Combination index for the complex of navel orange and apple in DPPH·scavenging rate
由图10～图12 可知，脐橙-苹果的复配组CI 均大于1，表现出较强的拮抗作用，而刺梨参与的试验组仅刺梨-苹果质量比为9 ∶1 时表现为拮抗作用。
综合3 种抗氧化试验结果可以看出3 种复配物在清除·O2-时协同效果最好，此外，刺梨参与复配的试验组抗氧化能力、协同效果均高于其他组。
3 讨论
3.1 不同质量比提取物抗氧化相互作用差异
同样的复配组合不同质量比，在相同体外抗氧化试验中CI 并不相同，抗氧化能力也不相同。在清除羟基自由基的体外抗氧化试验中，刺梨-苹果质量比为1 ∶9时CI 为1.96，表现为较强的拮抗作用，而质量比为7 ∶3时CI 为0.69，表现为协同作用。这可能是由抗氧化物质的浓度不同导致。例如Chen 等[19]在刺梨中发现一种具有抗氧化活性的物质RRTP1-1，此种抗氧化物在200 mg/kg 或400 mg/kg 的浓度下会显著提高超氧化物歧化酶等抗氧化酶的活性，可提高对DPPH·、·OH 和·O2-的清除率。也有研究表明各种极性抗氧化剂与混合生育酚的质量比不同，会导致抗氧化剂相互作用和整体抗氧化能力的改变。例如将抗坏血酸与α-生育酚的质量比从1 ∶1 增加到5 ∶1，会导致抗氧化效果从协同转向拮抗[20]。汤晓等[21]研究发现黄酮类化合物之间的相互作用，与氧化还原反应中氧化剂的比例有关。因此尽管同样的复配组合，刺梨、脐橙和苹果的极性与非极性的抗氧化活性物质不一样，导致不同质量比混合会产生拮抗或者协同作用。
3.2 不同质量比提取物抗氧化协同或拮抗原因分析
刺梨、脐橙和苹果以不同质量比复配，对不同的自由基清除表现出协同或拮抗作用，究其原因可能有如下几点。
第一，再生作用。由于不同水果抗氧化物质的结构和性质存在差异，复配后的抗氧化能力也有差异，可能会出现一种抗氧化剂再生另一种抗氧化剂的情况，因此出现协同作用。有研究表明刺梨中黄酮种类多样，槲皮素和儿茶素是其黄酮的主要成分[22]。赵谋明等[23]在脐橙果肉中检测出15 种酚类物质，其中儿茶素、绿原酸、芦丁含量较高。张蕊芬等[24]研究不同种类苹果多酚含量时发现苹果酚类物质中原花青素B2 和绿原酸含量较为丰富，刺梨维生素C 含量高，可再生多酚类物质，从而可再生维生素E。有研究表明槲皮素、抗坏血酸、儿茶素按照一定比例混合可协同增效[25]。因此，本试验的协同效果可能是酚酸类与维生素之间发生循环再生。
第二，分子结构之间的相互作用可以提高抗氧化能力。黄酮之间会有不同程度的增效或拮抗，可能与黄酮分子之间的氢键缔合有关[26]，但黄酮之间相互作用结果复杂多样。例如，槲皮素与异槲皮苷、槲皮素与表儿茶素组合均呈现较强拮抗作用，而当这3 种黄酮共存后，却呈现协同作用。这与本试验中两两复配却出现3 种不同作用形式的结果一致。此外，黄酮类化合物还具有抑制维生素C 被氧化成脱氧抗坏血酸的作用从而达到协同抗氧化的效果。这是由于黄酮类化合物结构中B 环含有3'，4'-羟基基团，且Y-吡喃酮环上含有3-羟基-4-羰基基团的化合物，其对维生素C具有显著的保护作用，以此达到协同增效的效果[27]。
第三，偶联氧化作用，根据抗氧化机理中的单电子伴随质转移机制，电离电势越低，电子越容易被抽离，抗氧化作用越容易产生，而不同抗氧化剂复配可降低抗氧化剂之间的电位落差，更易发生反应，因此达到了协同抗氧化的效果。研究发现茶多酚与多种抗氧化剂之间存在协同抗氧化作用，如维生素E、维生素C 等，而它们之间的协同抗氧化作用均通过偶联氧化降低电位落差实现[28]。因此，刺梨、脐橙和苹果中均含有维生素C，且多酚含量较高，复配时也可能通过偶联氧化作用产生协同效果。
4 结论
本研究采用联合指数法有效地评价了不同复配组合以及不同质量比的抗氧化相互作用。研究发现在超氧阴离子自由基、羟基自由基和DPPH 自由基体外抗氧化试验中，相同复配物的相同质量比会出现不同的抗氧化相互作用，这是由于3 种试验的清除机理存在差异。此外，相同复配组合不同质量比在同一体外抗氧化试验下也会存在不同的抗氧化相互作用结果，这是由于不同抗氧化物质的浓度和极性与非极性抗氧化物质的比例会对抗氧化试验结果产生一定的影响。其中，刺梨的抗氧化能力最强，苹果和脐橙在不同体外抗氧化试验下的能力强弱要具体分析。3 种水果两两复配后大多数为协同作用，少数为拮抗作用。超氧阴离子自由基体外抗氧化试验的协同效果最好。刺梨-苹果以1 ∶1 的质量比复配在超氧阴离子自由基体外抗氧化试验中协同率最高，而脐橙-苹果复配组的超氧阴离子体外抗氧化试验在3 ∶7 质量比下有最高的拮抗作用。刺梨-苹果和刺梨-脐橙复配组在3 种体外抗氧化试验中几乎都表现出较好的协同效果，而在脐橙-苹果的复配组合中，部分质量比表现出拮抗作用。
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