酵母菌参与蛋白质水解、脂类降解、乳糖降解以及乳酸和柠檬酸同化作用，对干酪的风味形成具有很重要的作用[1]。目前对切达干酪风味的研究主要集中在不同的奶源、工艺及生产环境方面[2-6]，其中微生物对干酪风味物质形成的影响已成为国内外研究的热点，乳酸菌对干酪风味的影响已进行了较为深入研究，酵母菌的研究还主要集中在对菌种分离株进行属种鉴定，缺乏发酵特性方面的系统性研究，关于酵母菌和风味形成相关性的研究还未见相关报道。
切达干酪（cheddar）是世界上产量最大的干酪[7]，随着人们对西餐消费的增加，切达干酪逐渐进入我国市场，在制作三明治或者汉堡包时使用。其成熟期从几个月到2 年不等[8]，经长时间发酵成熟而形成不能被国人普遍接受和喜爱的特有风味[9]。如何缩短其成熟期使其口味更适合我国消费者，是切达干酪生产面临的主要问题。因此，应用我国传统发酵乳制品的优良益生酵母菌改善切达干酪的风味，对于增加切达干酪市场份额、丰富干酪市场具有重要的经济及文化意义。
本试验前期采集少数民族居住地区生产的发酵乳制品，进行益生酵母菌筛选。然后将筛选得到的2 株益生性能良好的酵母菌PC1 和PC2 应用于切达干酪加工中，应用顶空固相微萃取技术结合气相色谱与质谱联用技术（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME/GC-MS）研究成熟15、30 d 和45 d 的切达干酪样品中的挥发性代谢物，探究体系中干酪风味物质代谢成分的变化，以便生产出新型的具有特殊风味的切达干酪，进而拓宽微生物菌种的应用领域。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酵母菌PC1、酵母菌PC2：内蒙古农业大学职业技术学院食品微生物实验室提供；正构烷烃（C6～C30，色谱纯）：美国Sigma-Aldrich 公司；乳酸菌、粉状凝乳酶（120 000 U/mg～150 000 U/mg）：丹麦科汉森有限公司。
1.2 仪器与设备
PHS-3G 型pH 仪：上海雷磁有限公司；725 型光栅分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；6890N（59731）气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent 公司；751 μm CAR／PDMS 萃取头：美国Supelco 公司；SY-2-4 电热恒温水浴锅：泰斯特仪器有限公司；LG10-2.4A离心分离机：北京京立离心机有限公司；DHG-9203A电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；122-5532DB-WAX 毛细管柱（0.25 μm，30 m×0.25 mm）：安捷伦科技有限公司。
1.3 益生干酪的制作
牛乳（2.9%蛋白质，3.5%脂肪）→过滤（4 层纱布）→灭菌（63 ℃，30 min）→冷却（32 ℃）→接种切达干酪发酵剂（50 U 乳酸菌）→添加0.002%氯化钙（配制成2%溶液）→添加凝乳酶（0.002%～0.004%，溶于1%NaCl 溶液）→凝乳→接种酵母菌（PC1 和PC2）→切割→排乳清→堆酿→压榨→包装→成熟
以不添加酵母菌作空白对照（记作C）。干酪成品用无菌油纸包装存放于10 ℃恒温箱中，湿度保持在50%～55%。在第15、30、45 天从恒温箱中采集样品，并将其保存在-80 ℃低温冰箱用于后续试验分析。
1.4 风味物质的测定
1.4.1 固相微萃取测定
参考文献[10]的方法，分别取2.0 g 成熟0、10、20 d和30 d 的切达干酪样品放入15 mL 萃取瓶中，置于60 ℃水浴中并保持30 min，将老化好的萃取针头插入到萃取瓶中进行萃取，萃取完成后，取出纤维头插入到气相色谱（汽化室）中进行气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）分析，每个样品重复进行3 次。
1.4.2 气相色谱（gas chromatography，GC）条件
色谱柱升温程序：起始柱温40 ℃，保持4 min 后，以4 ℃/min 速度升到100 ℃，保持2 min，然后以6 ℃/min升到150 ℃，最后以5 ℃/min 升到230 ℃，保持5 min。进样口温度设为250 ℃，不分流进样。采用122-5532 DB-WAX毛细管柱（0.25 μm，30 m×0.25 mm），流速为1 mL/min，载气为氦气。
1.4.3 质谱条件
电离能量为70 eV，离子源温度为230 ℃，接口温度为250 ℃，四极杆温度为150 ℃，检测器温度为280 ℃，扫描模式为全扫描，质量检测范围为20 amu～350 amu。
1.4.4 理化指标的测定
水分含量的测定参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》[11]的方法进行。脂肪含量的测定参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》[12]的方法进行。干酪的蛋白质含量测定参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[13]中的凯氏定氮法进行。
pH 值的测定：将5 g 干酪样品研磨，与10 mL 无二氧化碳的蒸馏水混合，然后使用已校准的pH 仪进行测定。
1.5 数据处理
采用方差分析软件对理化性质（水分、pH 值、蛋白质、脂肪和风味）数据进行显著性分析，P＜0.05 认为存在显著差异；并采用Origin 软件对挥发性化合物进行主成分分析（principal component analysis，PCA）、相关性分析和聚类分析。
2 结果与分析
2.1 理化指标的变化
对添加PC1 和PC2 菌株的切达干酪，测定其成熟15、30 d 和45 d 时的理化指标，结果见表1。
表1 切达干酪成熟期间理化指标
Table 1 Characteristic physicochemical indexes during cheddar cheeses ripening
注：不同大写字母表示在同一成熟时间不同菌株样品之间存在显著差异（P＜0.05）；不同小写字母表示同一菌株中不同成熟时间的样品之间存在显著差异（P＜0.05）。
项目 水分/% pH 值 蛋白质/% 脂肪/%15 d C 43.53±0.12Ba 4.92±0.03Aa 32.82±0.03Ac 20.24±0.03Aa PC1 43.88±0.56Aa 4.83±0.05Ba 31.75±0.05Bc 18.76±0.04Aa PC2 43.43±0.15Ca 4.80±0.03Cb 31.68±0.05Bc 19.34±0.02Aa 30 d C 41.89±0.04Ab 4.89±0.03Ab 34.97±0.05Ab 19.96±0.03Ab PC1 41.08±0.06Ab 4.78±0.02Bc 33.15±0.04Bb 17.86±0.02Cb PC2 40.63±0.05Abc 4.72±0.01Cc 32.89±0.02Bb 18.64±0.01Bb 45 d C 35.35±0.04Cc 4.72±0.05Cc 36.63±0.03Aa 19.34±0.02Ac PC1 38.07±0.04Bc 4.82±0.02Ab 35.38±0.01Ba 15.87±0.03Cc PC2 39.94±0.04Ac 4.81±0.07Ba 35.24±0.02Ba 17.71±0.11Bc
由表1 可知，干酪成熟早期的水分含量约为43.53%。由于暴露在空气中，水分会逐渐流失，在30 d 时，干酪的水分含量稍有下降，在第45 天时，水分含量已下降至35.35%。干酪成熟15 d 和45 d 时，C 组和PC1、PC2干酪的水分含差异显著（P＜0.05）。添加PC1 和PC2 菌株后干酪水分下降较C 组缓慢，可能是由于添加PC1和PC2 菌株后促进干酪中蛋白质水解，导致较多氨基和羧基化合物的产生，使干酪的水分含量较高[14]。
干酪成熟过程中pH 值的变化可分为3 个阶段。在最初阶段（15 d），pH 值逐渐下降，主要原因是乳糖转化为乳酸[15]，C 组的pH 值下降缓慢，PC2 干酪的pH值迅速下降至4.80。在第30 天时，当乳糖被发酵剂大量分解后，PC2 干酪pH 值进一步下降至4.7 左右。当成熟至45 d 的过程中，C 组pH 值仍然下降，而PC1 和PC2 干酪pH 值逐渐上升。此时，大量蛋白质分解产生一些碱性物质，部分乳酸被中和，导致pH 值逐渐增加[16]。在成熟过程中，PC1 和PC2 干酪的pH 值与C 组差异显著（P＜0.05），可能是奶酪中发酵剂受添加酵母菌影响所致。
干酪成熟过程中蛋白质含量明显增加，这主要是由于水分含量减少，从而导致蛋白质含量的增加[17]。奶酪成熟阶段，C 组和PC1、PC2 干酪因不同微生物互作产生的酪蛋白含量差异显著（P＜0.05），其原因可能是由于酵母菌分泌蛋白酶的作用所致[18]。但PC1 和PC2干酪蛋白质含量差异不显著（P＞0.05）。
干酪成熟过程中脂肪含量显著减少（P＜0.05），在达到30 d 和45 d 时，PC1 和PC2 干酪较C 组脂肪变化差异显著（P＜0.05），说明添加酵母菌对干酪成熟后期的脂肪含量有较大影响。添加PC1 和PC2 菌株可在干酪中产生降解三酰甘油的脂肪酶和酯酶，使脂肪大量水解[19]。
2.2 挥发性风味组分分析
表2 为不同成熟阶段切达干酪中挥发性化合物，可以直观呈现不同种类不同成熟时间干酪中的47 种风味化合物。图1 为不同干酪品种各风味指标聚类热图。
图1 不同干酪品种各品质指标聚类热图
Fig.1 Clustering heat map for quality indexes of four different varieties of cheeses
表2 不同成熟阶段奶酪中挥发性化合物
Table 2 The volatile compounds isolated from cheeses at last stages of ripening mg/100 g
成分 C-0 C-15 C-30 C-45 PC1-0 PC1-15 PC1-30 PC1-45 PC2-0 PC2-15 PC2-30 PC2-45 A1 2，3-丁二醇 - - - - - - 0.97±0.02a - 2.06±0.02a 2.07±0.01a - -A2 2-壬基醇 1.63±0.03a 1.64±0.02a - - - - - - - - - -A3 苯甲醇 - - 3.64±0.03a - - - 5.65±0.02a - - - 4.66±0.02a -A4 苯乙醇 - - - 5.04±0.04a - - - 5.51±0.03a - - - 3.86±0.02a A5 （2S，3S）-（+）-2，3-丁二醇------ - 0.21±0.02a - - - 0.64±0.02a A6 正戊醇 - - - - - - - - - - - 2.15±0.02a A7 3-甲基-1-戊醇------ - 0.72±0.03a - - - -A8 3-甲基-1-丁醇--- 6.05±0.03a - - - 9.65±0.03a - - - 6.70±0.02a B1 顺-5-十二碳烯酸--- 15.33±0.04a 3.8±0.07b 3.85±0.05b - 7.67±0.02a - - - 8.05±0.03a B2 正癸酸 - - - - - - 0.03±0.01a - - - 0.02±0.01a -B3 正辛酸 - - 16.26±0.05a - - - 12.25±0.04a - - - 10.66±0.03a -B4 3-苯基丙酸 - - 1.05±0.03a - - - - 0.62±0.03a - - - 0.65±0.02a B5 肉豆蔻油酸 - - 0.26±0.02b 1.25±0.02a - - - - - - - 3.37±0.02a B6 甲基丙二酸 - - - - - - - 1.30±0.02a - - - -B7 壬酸 - - - 2.66±0.03a - - - 1.32±0.04a - - - 6.36±0.02a C1 糠醛 - - - 7.33±0.02a - - 4.86±0.03a 3.75±0.02b - - - 4.14±0.03a C2 庚醛 - - 2.45±0.03a - - - - - - - 4.25±0.03a -C3 壬醛 - - 15.64±0.02a 7.24±0.03b - - 16.08±0.02a13.37±0.02b - - 13.54±0.03a 2.37±0.02b C4 甲基壬基乙醛 - - - 2.43±0.04a - - - - - - - -C5 已醛 - - 2.05±0.04a - - - - 4.46±0.04a - - 2.44±0.04a -D1 2，3-丁二酮 1.05±0.03a 1.05±0.03a 0.96±0.03b - 6.48±0.07a 6.48±0.02a - - - - - -D2 2-戊酮 - - - 2.26±0.02a - - 11.3±0.03b 0.97±0.02a - - 9.23±0.02a -
续表2 不同成熟阶段奶酪中挥发性化合物
Continue table 2 The volatile compounds isolated from cheeses at last stages of ripening
mg/100 g
注：-表示未检测出；不同小写字母表示数据之间差异显著（P＜0.05）。A1～A8 为醇类物质；B1～B7 为羧酸类化合物；C1～C5 为醛类物质；D1～D4 为酮类物质；E1～E12为酯类物质；F1～F8 为烷烃类物质；G1、H1 和H2 为其他化合物。
成分 C-0 C-15 C-30 C-45 PC1-0 PC1-15 PC1-30 PC1-45 PC2-0 PC2-15 PC2-30 PC2-45 D3 2-壬酮 - - - - - - - - - - 0.33±0.02b 0.43±0.02a D4 2-庚基环戊酮 - - - - - - - - - - 0.76±0.02a 0.71±0.03b E1 十四（烷）酸十四烷基酯18.35±0.02a 18.35±0.02a - - 16.46±0.02b 16.48±0.00a - - 20.43±0.02a 20.45±0.03a - -E2 辛酸乙酯 19.75±0.02b 19.74±0.02b 19.95±0.01a 4.76±0.03c 22.55±0.04a 22.57±0.00a 20.48±0.03b 6.48±0.03c 19.25±0.04b 19.28±0.03b 19.55±0.03a 8.44±0.02c E3 癸酸乙酯 10.52±0.03c 10.56±0.03c 11.05±0.02b 23.44±0.03a 16.50±0.05b 16.49±0.00b 8.09±0.03c 20.98±0.04a 17.76±0.03b 17.77±0.01b 7.07±0.03c 23.48±0.03a E4 乙酸异戊酯 - - - - - - - - 6.04±0.03a 6.04±0.03a - -E5 月桂酸乙酯 - - 12.49±0.04a - - - 10.47±0.01a - - - 12.37±0.03a -E6 癸酸甲酯 - - 5.35±0.03a - - - 4.53±0.04a - - - 5.63±0.03a -E7 乙酸乙酯 - - - 4.02±0.02a - - - 8.64±0.03a - - - 6.39±0.02a E8 乙酸壬酯 - - - - - - - - - - - 0.93±0.03a E9 甲酸丁酯 - - - 3.25±0.03a - - - 5.66±0.02a - - - 7.40±0.04a E10 丁酸乙酯 - - - 0.63±0.02a - - - 0.21±0.03a - - - 0.03±0.01a E11 甲酸己酯 - - - 3.65±0.04a - - - 2.07±0.02a - - - 5.61±0.03a E12 羟甲苯丁酯 5.35±0.02a 5.35±0.03a - - - - - 3.25±0.01a - - - -F1 甲苯 6.86±0.02b 6.93±0.03a - - 8.51±0.05b 8.55±0.03a - - 8.07±0.04a 8.06±0.03a - -F2 苯乙烯 9.39±0.02a 9.40±0.02a - 0.14±0.03b 2.49±0.04a 2.49±0.03a - - - - - 0.85±0.01a F3 羟甲苯丁酯 1.26±0.01a 1.27±0.03a - - 7.30±0.03b 7.32±0.02a - - 5.96±0.03a 5.96±0.02a - -F4 呋喃酮 - - - - 10.74±0.31a 10.86±0.02a - - 9.65±0.02a 9.66±0.01a - -F5 2，4-二叔丁基苯酚0.57±0.02a 0.56±0.02a - - 5.75±0.04b 5.78±0.04a - - 6.76±0.02a 6.77±0.03a - -F6 柠檬烯 - - 6.47±0.04a - - - 7.33±0.04a - - - 11.76±0.02a -F7 2，3，5-三甲基吡嗪------ - - - - 3.67±0.03a -F8 香草烯 - - - 0.41±0.03a - - - - - - - -G1 乙烯基甲醚 - - - - - - - 0.73±0.02a - - - 0.65±0.02a H1 2-戊基呋喃 - - - - - - - 0.75±0.01a - - - 0.89±0.02a H2 二甲基砜 - - - 0.72±0.03a - - - 0.90±0.02a - - - 0.66±0.02a
由表2、图1 可知，添加PC1 和PC2 菌株干酪的代谢物与C 组明显不同。成熟15 d 时，添加组与C 组相比，生成的主要风味物质是2，3-丁二醇、2-庚基环戊酮、呋喃酮、2，4-二叔丁基苯酚，C 组中含有大量2-壬基醇、苯乙烯。成熟30 d 时，添加组生成了2，3，5-三甲基吡嗪、2-壬酮和2-庚基环戊酮化合物。成熟45 d时，添加组比C 组的风味物质明显增多，C 组中出现了香草烯（可能来源于饲用草类）和甲基壬基乙醛（青草味），这些物质在添加组中均未出现，可见随着成熟时间的延长，添加酵母菌可明显改善风味。
添加PC2 菌株的干酪中生成的风味物质主要是酯类（黄油酯类物质甲酸丁酯和乙酸壬酯）[20]、醇类（2，3-丁二醇和正戊醇）、酸类（肉豆蔻油酸、壬酸、3-苯基丙酸）及其他化合物（乙烯基甲醚、2-戊基呋喃）。添加PC1 菌株的干酪中形成的风味物质相对较少，上述醇类、酸类、2-壬酮和2-庚基环戊酮化合物含量较低，而是生成了3-甲基-1-戊醇、甲基丙二酸和已醛风味物质。通过以上结果可知，PC2 菌株使切达干酪中风味物质丰富多样，且呈现气味的挥发性风味物质总体大于C 组，添加PC1 菌株的干酪与C 组相比，风味物质也明显增多，但少于添加PC2 菌株的干酪。并且发现，随着成熟时间的延长，添加酵母菌后酯类物质大量生成，这些酯类物质可以缓和因脂肪酸类化合物浓度过高而带来的不愉快味道（酸败味和苦涩味），从而赋予奶酪更加柔和的风味[21]。
为评估不同酵母菌株（PC1 和PC2）在干酪不同成熟阶段对风味的影响，对47 种挥发性化合物和各理化指标进行了PCA 分析，如图2 所示。
图2 主成分分析
Fig.2 Principal component analysis
由图2 可知，第一主成分PC1 的贡献率36.4%，第二主成分PC2 的贡献率22.8%，相同菌株的干酪在成熟15、30 d 和45 d 时的位置相对较远，说明添加相同菌株的干酪在成熟15、30 d 和45 d 时的挥发性风味存在明显差异。添加不同菌株的干酪在同一成熟时间位置接近，说明不同菌株品种的干酪同一成熟时间的挥发性风味基本相似。
图3 为添加酵母菌干酪挥发性风味成分的负载图。
图3 添加酵母菌干酪挥发性风味成分的负载图
Fig.3 Loading plot of the volatile compounds of cheese from the yeast strains
由图2、图3 可知，第一主成分贡献率最大的是蛋白质，其次为pH 值，水分、脂肪位于主成分PC1 和PC2的负侧，因此蛋白质和pH 值是影响干酪风味的关键因素。变化明显的挥发性化合物主要是3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、乙酸乙酯、2-戊基呋喃、乙烯基甲醚、3-甲基-1-戊醇。
3 结论
将PC1 菌株和PC2 菌株添加到切达干酪中进行理化指标及挥发性成分分析，研究发现，在成熟过程中，PC1 和PC2 干酪与C 组相比，蛋白质和pH 值均差异显著（P＜0.05），成熟30 d 后，脂肪含量差异显著（P＜0.05）。在干酪的3 个不同成熟阶段，共检测到47 种风味物质，其中醇类物质8 种、酸类物质7 种、醛类物质5 种、酮类物质4 种、酯类物质12 种、烷烃类8 种、其他化合物3 种。蛋白质和pH 值是影响奶酪风味的关键因素，变化明显的挥发性化合物主要是3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、乙酸乙酯、2-戊基呋喃、乙烯基甲醚、3-甲基-1-戊醇。添加PC2 菌株的干酪所产生风味明显高于添加PC1 菌株的干酪和对照组。成熟时间越长检测到的挥发性风味化合物越多。在干酪加工中添加分离酵母菌株可能会和商业发酵剂相互作用影响产品的风味，因此，在生产使用菌株之前需加以考虑。
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