黄豆酱，作为一种含有丰富营养的调味品，因其独特的鲜味而成为日常餐桌上必不可少的一部分，深受消费者喜爱[1-2]。目前，常用的黄豆酱生产工艺主要以黄豆、面粉为原料，并按照一定的比例拌以12%的盐水，经密封收罐之后进行高温发酵[3]。该工艺因设备利用率高、发酵时间短，经济效益高而成为调味品企业常用的黄豆酱发酵工艺。然而，该工艺高温发酵的特点却限制了中温球拟酵母（Torulopsis versatilis）的生长。T.versatilis 是黄豆酱发酵中常用的一种增香酵母，能够分解大豆并利用阿魏酸和香豆酸等物质产生4-乙基愈创木酚（4-ethylguaiacol，4-EG）、4-乙基苯酚（4-ethylphenol，4-EP）等重要的风味物质，赋予发酵产品特殊的烟熏味并改善滋味 [4]。缺少了增香酵母T.versatilis 的发酵作用，所生产出的黄豆酱普遍质量低下，无法满足消费者的需求。构建耐高温酵母，将是解决这种困境的有效途径。
目前，已有许多成熟的技术用以构建耐高温酵母。诱变育种是较常用的一种方式，该方法以紫外线（ultraviolet，UV）、甲烷磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，EMS）等诱变剂为手段，诱导酵母菌的基因组发生点突变从而赋予酵母菌新的性状[5]。然而，这些点突变只能随机发生，无法人为控制。因此，需要大量的筛选工作才能获得发生正突变的菌株，这无疑耗时耗力。另外，有研究者以基因工程技术为手段构建耐高温酵母，如过度表达热激蛋白（heat shock proteins，HSPs）[6]，诱导丙酮酸激酶基因CDC19 的突变[7]等。然而，该技术需要对微生物的分子信息有明确的了解，无法在非模式菌株T.versatilis 中实现。电转化因具有可高效导入外源DNA 实现基因重组，重复性高，也无需了解微生物有关分子信息的优点，成为一种常用的微生物育种方法[8]。
虽然已有许多关于耐高温酵母的研究，但研究主要集中在生物乙醇的生产[9-11]，而有关黄豆酱发酵专用耐高温酵母的研究较少。因此，本研究利用电转化将耐高温酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的基因组导入T.versatilis 出发菌株，从而提高T.versatilis 的耐热性以提升黄豆酱品质。本研究将有助于构建适合于黄豆酱发酵的耐高温酵母，并为工业微生物的构建提供有效途径。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黄豆、面粉：天津市利民调料有限公司；黄豆酱样品：市售；米曲霉沪酿3.042（Aspergillus oryzae 3.042）、球拟酵母（T.versatilis）、酿酒酵母（S.cerevisiae）：天津科技大学菌种保藏中心；LiAc、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、山 梨 醇、NaOH、甲 醛、CuSO4、K2SO4、浓H2SO4、溴甲酚绿-甲基红混合指示剂、H3BO3、稀HCl、3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；酵母基因组提取试剂盒（货号：D1900）、DNA 聚合酶（均为分析纯，货号：PC1100）、2’-脱氧核苷酸-5’-三磷酸混合物（dNTP Mix，货号：PC2100）：北京索莱宝科技有限公司。
1.2 培养基及溶液
酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）培养基（100 mL）：1 g 酵母菌提取物、2 g蛋白胨、5 mL 无水葡萄糖溶液（40 g/100 mL）；酵母膏胨葡萄糖琼脂（yeast extract peptone dextrose agar medium，YPDA）培养基（100 mL）：1 g 酵母菌提取物、2 g 蛋白胨、5 mL 无水葡萄糖溶液（40 g/100 mL）、1.5 g 琼脂；麸皮固体培养基（100 g）：50 g 麸皮、50 mL 水；10×TE（Tris-EDTA）缓冲液：100 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（TRIS hydrochloride，Tris·HCl）、10 mmol/L 乙二胺四 乙 酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、NaOH 调节pH 值至8.0；柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH4.0）：0.08 mol/L 磷酸氢二钠（N2HPO4）、0.06 mol/L柠檬酸、pH4.0；酶储存缓冲液（10×buffer）：20 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）、0.1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、100 mmol/L KCl、15 mmol/L Mg2+、50%甘油、稳定剂；DNS 试剂（100 mL）：18.2 g 酒石酸钾钠、0.63 g DNS、2.1 g NaOH、0.5 g 苯酚、0.5 g 无水Na2SO4。
1.3 仪器与设备
MICRO 17 型常温高速离心机、Arktik 型PCR 仪：赛默飞世尔科技有限公司；YP 型电子天平：上海天平仪器厂；LDZX 型立式压力蒸汽灭菌锅：日本雅马拓科技有限公司；Gel DocTM XR+型凝胶成像仪：伯乐生命医学产品（上海）有限公司；Eporator 型电转化仪：德国艾本德股份有限公司；1510-01114 型全自动酶标仪：深圳科瑞技术有限公司；T5 型自动电位滴定仪：梅特勒-托利多仪器有限公司；SH220N 型石墨消解仪：海能仪器有限公司；ZDDN-11 型自动凯式定氮仪：浙江托普仪器有限公司；QP-2010 型气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）：日本Shimadzu 公司。
1.4 方法
1.4.1 初始菌株温度耐受性的测定
挑取酵母单菌落接入20 mL YPD 培养基中，于30 ℃、180 r/min 下培养至对数期。测定菌液OD660，计算细胞浓度。在4 500 r/min、室温下离心5 min 收集大约1.0×107 个细胞，再用1 mL 无菌H2O 将细胞重新悬浮以调整细胞浓度至1.0 ×107 CFU/mL。之后进行10倍梯度稀释（调整细胞浓度分别为1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103 CFU/mL）。吸取2.5 μL 的不同浓度的细胞菌液，按浓度从大到小的顺序，点滴于YPDA 平板上于不同的温度（30、37、42 ℃）下培养3 d～4 d。观察酵母生长结果。
1.4.2 基因重组
1.4.2.1 酿酒酵母基因组的提取
参照说明书，使用酵母基因组提取试剂盒提取S.cerevisiae 的基因组。
1.4.2.2 球拟酵母感受态细胞的制备
挑取T.versatilis 单菌落接种于20 mL 的YPD 培养基中，在30 ℃、180 r/min 下摇瓶培养。培养至对数期时，4 500 r/min 离心5 min，收集所有细胞沉淀。用10 mL 10×TE 缓冲液和10 mL 1 mol/L LiAC（pH 7.5）重新悬浮细胞，于30 ℃、180 r/min 下孵育45 min。再向其中添加500 μL 1 mol/L DTT，同样的条件下孵育15 min。然后再向其中添加30 mL 无菌水，于4 500 r/min、4 ℃离心5 min 以收集细胞沉淀。再分别用50 mL 预冷无菌水和1 mol/L 山梨醇洗涤细胞沉淀。最后，用1 mol/L 预冷山梨醇重新悬浮细胞并储存在-80 ℃冰箱备用。
1.4.2.3 电转化
将20 μL 的300 ng/μL S.cerevisiae 基因组与80 μL的1.0×109 CFU/mL T.versatilis 感受态细胞均匀混合在1.5 mL 离心管中，并将离心管置于冰中孵育5 min。然后转移管内混合物到已预冷的0.1 cm 宽电转杯（Bio-Rad）中，并使用电转化仪施加两次600 V 的电击。电转化后，立即向电转杯中添加1 mL 的柠檬酸-盐磷酸盐缓冲液（pH4.0）并将混合物转移至1.5 mL 离心管中，在30 ℃下孵育4 h。然后4 500 r/min、室温离心5 min收集细胞沉淀，再重新重悬于5 mL 的YPD 培养中，在30 ℃、180 r/min 下培养4 h。最后，将转化后的细胞悬液涂布于YPDA 平板上，在42 ℃下培养进行耐高温新菌株的筛选。
1.4.3 新菌株基本性能的测定
1.4.3.1 耐热稳定性的测定
通过连续传代测定新菌株的耐热稳定性。从1.4.2.3 中的筛选平板上挑取菌落直径较大的新菌株划线于YPDA 平板上，并于42 ℃培养2 d～3 d（此为第一代）。从第一代中再挑出每个菌株的单菌落，持续划线于新的YPDA 平板上，并于42 ℃培养2 d～3 d（此为第二代）。重复以上操作，直至第十代，检测每一代菌株是否均保持耐热特性。
1.4.3.2 优良耐高温新菌株的筛选
将具有耐热稳定性的新菌株进行进一步筛选。挑取新菌株单菌落接种于20 mL 的YPD 培养基中，并于30℃、180r/min过夜预培养。测定预培养物OD660，稀释预培养物至菌液浓度为0.81×107 CFU/mL。转移0.2 mL的预培养物稀释液至另一新的20 mL YPD 培养基中，并于42 ℃、180 r/min 下培养30 h。培养结束后，使用全自动酶标板测定菌液的OD660。以OD660 表征细胞生物积累量，筛选出生物积累量最高的新菌株进行后续分析。
1.4.3.3 随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）分析
参照说明书，使用酵母基因组提取试剂盒提取亲本菌株（S.cerevisiae 和T.versatilis）和新菌株的基因组。然后以这些基因组为模板，通过随机引物进行RAPD 分析。具体的引物序列、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）反应体系及PCR 反应程序分别如表1、表2、表3 所示。
表1 随机引物序列
Table 1 Random primer sequences
随机引物 5'～3'引物序列2 CAGGCCCTTC 4 GAAACGGGTG
表2 PCR 反应体系
Table 2 PCR reaction systems
试剂 体积/μL模板DNA（100 ng/μL） 1随机引物（10 mol/L） 3 10×buffer（含Mg2+） 2.5 dNTP Mix（各2.5 mmol/L） 2.5 DNA 聚合酶（5 U/L） 0.3 ddH2O 加至25 μL
表3 PCR 反应程序条件
Table 3 Procedure conditions of PCR
温度/℃94时间3 min程序预变性94 1 min 36～38 72 45 s 2 min 44 循环72 10 min 4∞修复延伸终止反应
1.4.4 新菌株黄豆酱发酵特性的研究
1.4.4.1 种曲制备
用接种环从米曲汁培养基上挑取3 环～4 环A.oryzae 3.042 孢子接种至装有麸皮固体培养基的瓶中并振荡混匀，于30 ℃培养15 h 左右。待培养基因菌丝生长而变白时，晃动锥形瓶以打散变硬的结块同时起到第二次接菌的作用，于30 ℃继续培养7 h 左右。待培养基全部变白，再次晃动锥形瓶打散变硬结块，继续30 ℃培养。待培养基因大量孢子生长而变为黄绿色时，收取种曲于牛皮纸袋中备用。
1.4.4.2 黄豆酱发酵
称取140 g 黄豆浸泡于350 g 水中，待黄豆充分吸水泡涨后，滤去多余水分，再用曲布包裹黄豆于蒸汽灭菌锅中，121 ℃蒸煮20 min。黄豆经蒸煮后，结构不再紧凑。此时，称取60 g 面粉，趁热与黄豆拌和，再向其中添加0.6 g 的种曲，于30 ℃培养42 h 后形成成熟的大曲。再将成熟大曲与400 mL 12 g/100 mL 的盐水混合于发酵罐中，发酵罐置于工艺培养箱中发酵30 d。根据不同的发酵温度（37 ℃和42 ℃）和酵母添加情况（T.versatilis、M-4 和M-7），共设置了6 个发酵组，具体情况如表4 所示。
表4 不同的黄豆酱发酵工艺
Table 4 Different fermentation process of soybean paste
编号1-1 1-2 1-3 2-1 2-2 2-3发酵温度/℃37 42酵母菌添加情况T. versatilis M-4 M-7 T. versatilis M-4 M-7酵母菌添加量/（CFU/g）1×106 1×106 1×106 1×106 1×106 1×106
1.4.4.3 测试样制备
发酵结束后，称取5 g 黄豆酱样品于研钵中并添加适量蒸馏水进行充分研磨后，转移研磨液至50 mL容量瓶中，以蒸馏水定容后，用三层纱布过滤全部样品液至50 mL 离心管中待测。
1.4.4.4 氨基酸态氮（amino acid nitrogen，AAN）含量的测定
参照GB 5009.235—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》中的酸度计法（甲醛值法）测定氨基酸态氮含量。
1.4.4.5 全氮（total nitrogen，TN）含量的测定
参照Lynch 等[12]描述的凯氏定氮法并稍作修改，将10 mL 测试样与0.2 g CuSO4、3 g K2SO4 和10 mL 浓H2SO4 混合，先在260 ℃下消解75 min，再在420 ℃下消解135 min 以释放全部氮元素。消解完成后，将样品与40 g/100 mL NaOH 反应，并在自动凯式定氮仪上蒸馏。蒸馏液被含有溴甲酚绿-甲基红指示剂的2 g/100 mL H3BO3 溶液吸收。最后，用0.1mol/LHCl 滴定上述H3BO3-（NH4）2B4O7 溶液来测定全氮含量。
1.4.4.6 还原糖（reducing sugar，RS）含量的测定
参照孙月芹[13]描述的DNS 法并稍作修改，将1 mL 测试样与2mLDNS 试剂混合，然后在沸水浴中保持2 min。待混合物冷却后，再添加12 mL 蒸馏水，然后测量溶液的OD540。不同浓度的葡萄糖标准溶液（0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/100 mg）也按照上述相同的过程进行测定以绘制标准曲线。根据标准曲线方程（y=0.174 7x+0.001 7，R2=0.996 4）计算样品中的还原糖含量。
1.4.4.7 风味物质的测定
风味物质参照Liu 等[14]所描述的固相微萃取-气质联用（solid phase microextraction-gas chromatography mass spectrometer，SPME-GC-MS）法进行测定并稍作修改。称取5 g 黄豆酱放入20 mL 的顶空瓶中，再加入5 mL 的蒸馏水，然后在55 ℃水浴中平衡30 min，平衡期间持续搅拌。平衡后，用固相微萃取纤维（50/30 m DVB/CAR-PDMS）在同样的条件下萃取样品。然后将萃取头插入GC-MS（色谱柱：HP-5MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm）的进样口中，在250 ℃下保持20 min 进行解吸。解吸时，吸附于纤维头中的风味物质解脱下来进入检测仪器。
气相色谱采用程序升温：初始温度为40 ℃，维持3 min；第一阶段以4 ℃/min 的速率上升到150 ℃，维持1 min；第二阶段以8 ℃/min 的速率上升至250 ℃，维持6 min。进样口温度250 ℃。载气为氦气；流速1 mL/min。
质谱条件：电离模式为电子电离源；电子能量70eV；接口温度220 ℃；离子源温度200 ℃；扫描质量33 amu～450 amu。
1.4.4.8 感官评价测定
称取不同黄豆酱样品各20 g，置于5 个随机编号的100 mL 烧杯中。再随机邀请30 名经过专业培训的感官人员（男性和女性各15 名）对上述黄豆酱样品进行评分。30 名同学参照9 点线性量表[从0（最差/极不喜欢）到9（最好/极喜欢）]对黄豆酱的外观、香气、味道和整体可接受性进行打分。进行感官评价时，将市售的6 份黄豆酱作为评价参照，以明确相应分数表示的感官等级。以蜘蛛网图展示评价结果。
1.4.4.9 生物胺含量的测定
参照GB 5009.208—2016《食品安全国家标准食品中生物胺的测定》描述的内标法测定生物胺含量。
1.5 数据处理
使用IBM SPSS Statistics 24.0 软件进行单因素方差分析和Duncan’s post-hoc，以评估样本之间的显著性差异，显著性定义为P＜0.05。
2 结果与分析
2.1 初始菌株温度耐受性的测定
母本菌株S.cerevisiae 和T.versatilis 在不同温度下的生长情况如图1 所示。
由图1 可知，S.cerevisiae 在3 个温度下均可正常生长，表明S.cerevisiae 具备耐高温的优良特性，可以作为本试验的外源基因供体菌。而出发菌株T.versatilis 只能在30 ℃下生长，在高温37 ℃和42 ℃下已无法生长，表明T.versatilis 无法耐受较高的温度，耐热性有待进一步提升。同时，选择42 ℃作为后续筛选温度。
图1 母本酵母在不同温度下的生长情况
Fig.1 Growth of parental yeasts at different temperatures
1～5 依次为菌株浓度1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103CFU/mL。
2.2 基因重组
2.2.1 酿酒酵母基因组的提取
S.cerevisiae 提取基因组后，凝胶成像结果如图2所示。
图2 酿酒酵母基因组提取结果
Fig.2 Result of Saccharomyces cerevisiae genome extraction
Lad 表示1 000 bp plus DNA ladder；2～8 泳道表示7 个酿酒酵母基因组样品。
由图2 可知，所提取的酿酒酵母基因组经凝胶成像后，出现清晰、明亮、单一的条带，无拖尾等现象出现，表明所提取的基因组质量良好，可用于后续电转化。
2.2.2 电转化筛选结果
电转化筛选结果如图3 所示。
图3 电转化筛选结果
Fig.3 Screening results of electroporation
由图3 可知，筛选平板在42 ℃下经过2 d～3 d 的培养，生长出一些直径大小不等的乳白色圆形菌落，这是酵母菌落的典型特征。再结合2.1 的试验结果发现：出发菌株在42 ℃下无法生长，这些筛选平板上的菌落被认为是潜在的耐高温新菌株。Abdel-Banat 等[15]曾指出，对于发酵食品而言，发酵温度每提升5 ℃，降温成本就可减少3 万美元。本文所构建的这些可耐受42 ℃高温的新菌株，则可以大大节约工业生产中的冷却成本，对经济效益的提高有着实际意义。从中挑取直径较大的8 株菌落，命名为M-1、M-2、M-3、M-4、M-5、M-6、M-7、M-8 进行后续分析。
2.3 新菌株基本性能的测定
2.3.1 菌株耐热稳定性的测定
基因工程菌株在实际应用中，难免会出现性状丢失、基因分离等现象，这种不稳定性会给工厂带来巨大的损失。因此，一般用于工业生产的菌株均要经过十代左右的稳定筛选才能正式投入使用。耐热性状的稳定遗传是本文所构建新菌株工业化应用的先决条件。新菌株耐热稳定性测定结果如图4 所示。
图4 新菌株的耐热稳定性
Fig.4 Thermotolerant stability of new strains
①～⑧分别代表新菌株M-1、M-2、M-3、M-4、M-5、M-6、M-7 和M-8；C、H 分别代表亲本菌株T.versatilis 和S.cerevisiae。
由图4 可知，新菌株经过整整十代的传代之后仍然可以在42 ℃下正常生长，而出发菌株T.versatilis 始终无法在高温下生长，表明新菌株完美的融合了亲本S.cerevisiae 耐高温的特性，且耐热性可以稳定遗传。张金伟等[16]曾以一株工业酿酒酵母作为出发菌株，通过基因组改造和实验室适应性进化，成功得到了可耐受40 ℃高温的新菌株。而本文通过基因重组所构建的新菌株可以稳定耐受42 ℃的高温，这与文献的研究相似，且新菌株的稳定耐热性确保了新菌株在工业生产中具有潜在的应用前景。
2.3.2 优良耐高温新菌株的筛选
对8 株新菌株在42 ℃下培养30 h 后的生物积累量进行比较，进一步筛选出更优良的耐高温新菌株。不同酵母在高温下的生物积累量如图5 所示。
图5 不同酵母在高温下的生物积累量
Fig.5 Biomass accumulation of different yeasts under high temperature
不同小写字母表示具有显著性差异，P＜0.05。
由图5 可知，在高温42 ℃下，出发菌株T. versatilis 始终表现出很低的生物积累量，原因可能是高温胁迫会对不耐热菌株产生热损伤，包括蛋白质变性、质膜的不稳定以及产生活性氧造成氧化损伤等，致使出发菌株无法正常生长[17]。同时，可以发现8 株新菌株的生物积累量均显著高于出发菌株T.versatilis，表明新菌株比出发菌株T.versatilis 更能耐受高温胁迫，这将有助于高温下黄豆酱的发酵。其中M-4 与M-7 的生物积累量又显著高于其余6 株新菌株。因此，选择M-4 与M-7 这两株新菌株进行后续分析。
2.3.3 随机扩增多态性DNA 分析
RAPD 分析是由Williams 所发明的，利用随机引物扩增模板基因的方法[18]。扩增出的片段数量和大小主要取决于模板基因的结构。因此，RAPD 扩增结果可在一定程度上反映模板的基因组结构。该方法常用于检测不同模板之间的基因组结构差异。将优良耐高温新菌株M-4、M-7 和亲本菌株S.cerevisiae、T.versatilis进行RAPD 扩增，结果如图6 所示。
由图6 可知，无论是使用引物2 还是引物4，在新菌株和亲本菌株的RAPD 图谱中，均可以明显观察到新菌株M-4、M-7 与亲本菌株S.cerevisiae（用a 框表示）和T.versatilis（用b 框表示）之间由于菌株基因组序列的改变导致PCR 产物的长度和数量具有明显差异。这些差异性表明，构建的M-4 与M-7 新菌株较亲本菌株的基因结构发生了改变，验证了基因重组的成功。
图6 亲本酿酒酵母、球拟酵母和M-4、M-7 新菌株的RAPD 图谱
Fig.6 RAPD profiles of parental strains Saccharomyces cerevisiae，Torulopsis versatilis，and new strains M-4 and M-7
泳道1 代表Maker，泳道2 代表亲本酿酒酵母，泳道3 代表M-4，泳道4 代表M-7，泳道5 代表亲本球拟酵母；a 框表示新菌株与S.cerevisiae的基因差异，b 框表示新菌株与T.versatilis 的基因差异。
2.4 新菌株黄豆酱发酵特性研究
将M-4、M-7 新菌株和出发菌株T.versatilis 应用于黄豆酱的高温（37 ℃和42 ℃）发酵，以检测新菌株对黄豆酱品质的提升作用。
2.4.1 氨基酸态氮含量
氨基酸态氮是评价黄豆酱品质的重要指标之一，其含量能很好地反映黄豆酱的营养价值，也表征着黄豆酱发酵的成熟度[19]。不同黄豆酱氨基酸态氮测定结果如图7 所示。
图7 不同黄豆酱中的氨基酸态氮含量
Fig.7 Amino acid nitrogen content in different soybean pastes
A 为37 ℃，B 为42 ℃；不同小写字母表示存在显著性差异，P＜0.05。
由图7 可知，在高温下发酵的黄豆酱样品中，添加了新菌株的黄豆酱样品，其AAN 含量均显著高于添加出发菌株的黄豆酱样品。相比于出发菌株T.versatilis，在37°C，M-4 与M-7 新菌株使黄豆酱中的AAN 含量分别显著提高3.66%和12.20%；在42 ℃，M-4 与M-7 新菌株使黄豆酱中的AAN 含量均显著提高2.78%，表明新菌株显著提升了高温发酵黄豆酱的营养品质。同时，可以看出M-7 对黄豆酱AAN 含量的提升作用高于M-4，且37 ℃下的提升作用更为明显，这可能是因为更高温度对M-7 的生长起到了一定的抑制作用。在M-4 与M-7 新菌株的提升作用下，黄豆酱中AAN 含量最高分别达到0.85 g/100 g 和0.92 g/100 g，符合国家标准GB/T 24399—2009《黄豆酱》中对于氨基酸态氮≥0.50 g/100 g的要求。此外，随着发酵温度从37 ℃上升至42 ℃，黄豆酱中AAN 含量有所下降，这与乔鑫等[20]的研究结果“在黄豆酱酿造过程中，随着发酵温度的升高，氨基酸态氮含量呈上升趋势”相反。原因可能是酸性蛋白酶在黄豆酱发酵过程中对蛋白质的降解起主要作用，并且有研究表明酸性蛋白酶的温度稳定性在25 ℃～55 ℃时先上升后下降，在35 ℃左右达到最高的稳定性[21]。温度升高所引起的酸性蛋白酶稳定性下降造成了AAN 含量下降。
2.4.2 全氮含量
全氮是可溶性含氮化合物的总称，主要包括可溶性蛋白质、多肽和氨基酸，更易被人体消化和吸收，可以表征黄豆酱的品质好坏。不同黄豆酱全氮含量测定结果如图8 所示。
由图8 可知，在黄豆酱的高温发酵中，除M-7 在42 ℃下生成的TN 含量与出发菌株T.versatilis 无明显差异外，其余添加了新菌株的黄豆酱样品中，TN 含量均得到显著提升。相比于出发菌株T.versatilis，在37 ℃条件下添加了M-4 与M-7 新菌株的黄豆酱样品TN含量分别显著提高8.23%和12.03%；在42 ℃条件下添加了M-4 与M-7 新菌株的黄豆酱样品TN 含量分别提高28.68%和2.94%，表明新菌株大大提升了低盐固体黄豆酱的品质。解殿伟等[22]研究发现，在黄豆酱自然发酵（自然接种，露天晾晒）、低盐发酵（单一菌株制曲，前10 d 高温发酵、后20 d 低温发酵）和复合发酵（单一菌株制曲，露天晾晒）3 种发酵方式中，低盐发酵方式所生成的全氮含量（0.87 g/100 g）总是低于自然发酵（0.91 g/100 g）和复合发酵（0.90 g/100 g）。本研究耐高温新菌株的应用，可以省去发酵过程中的降温步骤，使原料在全程高温下得以充分分解，提升全氮含量最高至1.77 g/100 g，使低盐发酵方式的全氮含量高于自然发酵和复合发酵。同时也发现，在温度下，M-4 与M-7 提升TN 含量的能力不同，原因有待进一步探究。
图8 不同黄豆酱中的全氮含量
Fig.8 Total nitrogen content in different soybean pastes
A 为37 ℃，B 为42 ℃；不同小写字母表示存在显著性差异，P＜0.05。
2.4.3 还原糖含量
黄豆酱中的还原糖主要由原料中的淀粉降解而产生，可作为一种能源物质为微生物的生长和代谢活动提供能量。微生物的发酵活性越旺盛，还原糖消耗越明显。因此，还原糖含量的变化可以在一定程度上表征微生物的生长状态[23]。不同黄豆酱中的还原糖含量测定结果如图9 所示。
图9 不同黄豆酱中的还原糖含量
Fig.9 Reducing sugar content in different soybean pastes
A 为37 ℃，B 为42 ℃；不同小写字母表示存在显著性差异，P＜0.05。
由图9 可知，在高温发酵条件下，与出发菌株T.versatilis 发酵的黄豆酱样品相比，M-4 新菌株发酵的黄豆酱样品中还原糖含量没有显著差异，而M-7 新菌株发酵的黄豆酱样品中还原糖含量却显著降低，即在37 ℃和42 ℃条件下分别降低了11.56%和43.23%。上述结果说明M-7 消耗了更多的还原糖，发酵活性高于出发菌株T.versatilis。其中一部分还原糖可能会参与美拉德反应，形成黄豆酱重要的色泽和风味物质[24]。综上，相比于出发菌株T.versatilis 和M-4 新菌株，M-7新菌株有着更高的黄豆酱发酵活性，对黄豆酱品质有显著的提升作用。因此，选择M-7 为最终的优良菌株进行后续的比较分析。
2.4.4 风味物质的测定
黄豆酱发酵过程中，作为主要发酵原料的黄豆，经微生物所分泌酶系的分解生成多肽、糖类、脂肪酸等风味前体物[25]，而后又经醇发酵、酯化反应等一系列复杂的代谢过程和生化反应形成黄豆酱独特的风味物质。风味指标可以很好地反映黄豆酱品质，风味质量的好坏直接决定消费者的购买意愿。风味物质的测定结果如图10 和表5 所示。
表5 不同黄豆酱中风味物质的种类
Table 5 Kinds of flavor compounds in different soybean pastes
物质名称1-1（T. versatilis）1-3（M-7）2-1（T. versatilis）2-3（M-7）醇类 4 6 5 6酸类 1 1 0 1酯类 6 8 5 7醛类 8 11 10 12酮类 3 3 3 4呋喃类 1 1 1 1吡啶类 0 0 1 0总计 23 30 25 31
由图10 可知，在4 个黄豆酱样品中主要检测到醇类、酸类、酯类、醛类、酮类、呋喃类和吡啶类风味物质。其中，醇类和酯类是对黄豆酱风味贡献最大的两种物质，其次是醛类和酸类。
醇类物质主要来源于多糖与氨基酸之间的化学反应，包括低级醇和高级醇。图10 表明，M-7 对醇类含量的提升作用在42 ℃下更明显。在42 ℃发酵条件下，相比于出发菌株T.versatilis，M-7 发酵的黄豆酱中醇类含量提升24.61%，提升的醇类含量可以带给黄豆酱更加醇厚的滋味。
图10 不同黄豆酱中风味物质的相对含量
Fig.10 Relative content of flavor compounds in different soybean pastes
A 为37 ℃，B 为42 ℃；每条连接线的两端分别代表相应的风味化合物和黄豆酱样品；每条连接线的宽度代表黄豆酱中风味化合物的相对含量。
酯类物质能使发酵调味品具备“醇香酯厚”的特点，这对调味品非常重要，如很多乙酯类物质可以产生花香味或甜味[26]。图10 表明，相比于出发菌株T.versatilis，在37 ℃和42 ℃条件下，M-7 发酵的黄豆酱样品中酯类含量分别提升了35.39%和8.32%，酯类含量的提升可以使得黄豆酱酯香味更加浓厚。
醛类物质主要来自于氨基酸的脱氨或脱羰基反应，香气阈值低且香气强度高[27]。图10 表明，相比于出发菌株T.versatilis，在37 ℃和42 ℃条件下，M-7 发酵的黄豆酱样品中醛类含量分别提升了2.71%和9.23%，提升的醛类含量能够增强黄豆酱的杏仁、苹果香气。
酸类物质能够缓和黄豆酱的咸味，其中所蕴含的多类有机酸能够增强黄豆酱风味多样性。图10 表明，相比于出发菌株T.versatilis，在37 ℃，M-7 发酵的黄豆酱样品中酸类含量提升53.74%；在42 ℃，M-7 发酵的黄豆酱样品中检测到12.69%的酸类物质，而出发菌株T.versatilis 发酵的黄豆酱样品中却未检测到。
同时，由图10 可知，随着发酵温度从37 ℃上升至42 ℃，黄豆酱中酯类和酸类含量降低，醛类含量上升，这与孟鸳等[28]的研究结果一致，说明风味物质的产生会受到发酵温度的影响。
由表5 可知，M-7 在37 ℃和42 ℃下发酵的黄豆酱样品中分别检测出30 种和31 种风味物质，而出发菌株T.versatilis 发酵的黄豆酱样品中仅分别检测到23 种和25 种风味物质。相比于出发菌株T.versatilis，新菌株M-7 发酵的黄豆酱样品中显示出更多种类的风味物质。康旭等[29]研究表明，酵母菌的添加有利于黄豆酱中挥发性成分种类的增加，包括醛类、酯类等物质。试验结果证明，本研究所构建的新菌株是比出发菌株更加优良的风味酵母，对黄豆酱风味的提升有着重要作用。
以上结果表明，新菌株M-7 可以显著提升黄豆酱样品的风味含量以及风味物质的多样性。
2.4.5 感官评价测定
对于黄豆酱品质的评定，除一些相关的理化指标外，还有感官指标。消费者对于黄豆酱品质的直观感受也是衡量黄豆酱品质好坏的一个重要参考。黄豆酱样品的感官评价结果如图11 所示。
图11 不同黄豆酱的感官评价结果
Fig.11 Sensory evaluation results of different soybean pastes
由图11 可知，M-7 新菌株对黄豆酱样品的香气和滋味均有明显的提升作用。就香气而言，添加了M-7 新菌株的黄豆酱样品均获得了最高的酒香味、酸味和水果香味评分，这是因为M-7 新菌株显著提升了黄豆酱样品中醇类和酸类风味物质的含量（图10）。同时，黄豆酱中较强的水果香气可以产生令人愉快的感觉。就滋味而言，鲜味是5 种基本滋味中最关键性的指标[30]，主要产生于氨基酸与呈味核苷酸的相互作用。M-7 新菌株发酵的黄豆酱样品得到最高的鲜味评分，该结果与黄豆酱中AAN 含量的结果相一致（图7）。M-7 新菌株对黄豆酱鲜味感官的提升能够大大满足消费者对于高滋味的需求。此外，4 种黄豆酱样品的外观评分均明显低于市售黄豆酱，原因可能是长时间的高温发酵，使得黄豆酱颜色发黑，不如黄豆酱标准的土黄色外观好。整体上，M-7 新菌株发酵的黄豆酱样品可接受性最高。
2.4.6 生物胺含量
生物胺特指一类具有生物活性的含氮有机化合物，广泛存在于豆酱、酱油以及酒精饮料等发酵产品中[31-32]。生物胺的超量摄入会引起头晕、红疹、吞咽困难、腹泻、呼吸窘迫和血压紊乱等中毒现象[33]，成为发酵产品中存在的一大安全隐患。因此，很有必要测定黄豆酱中的生物胺含量，以检测M-7 新菌株的应用是否会影响黄豆酱安全。生物胺测定结果如图12 所示。
图12 不同黄豆酱中的生物胺含量
Fig.12 Biogenic amine content in different soybean pastes
由图12 可知，M-7 新菌株在高温下发酵的黄豆酱样品中，苯乙胺含量分别为25.29 mg/kg（37 ℃）和21.35 mg/kg（42 ℃），这与张菁[34]的研究结果相似，随着环境温度的升高，黄豆酱中苯乙胺的含量呈下降趋势。且苯乙胺含量未达到Brink 等[35]提出的30 mg/kg的有害水平；组胺含量分别为3.81 mg/kg（37 ℃）和5.12 mg/kg（42 ℃），远低于美国食品药品监督管理局规定的50 mg/kg 限量[36]；酪胺含量分别为13.9 mg/kg（37 ℃）和15.3 mg/kg（42 ℃），低于FDA 规定的25 mg/kg限量；其他生物胺，如精胺、亚精胺、尸胺、腐胺和色胺的最大含量也未超过36 mg/kg。总体上，M-7 新菌株发酵的黄豆酱样品中生物胺总量均在136 mg/kg 以下，出发菌株T.versatilis 发酵的黄豆酱样品中生物胺总量均在121 mg/kg 以下。M-7 新菌株生成的生物胺总量同出发菌株T.versatilis 一致，均远低于欧洲食品安全局规定的1 000 mg/kg 限量 [37]。相比于出发菌株T.versatilis，M-7 新菌株并未影响黄豆酱的安全品质。
3 结论
本研究以球拟酵母（T. versatilis）为出发菌株，通过电转化导入耐高温酿酒酵母（S.cerevisiae）基因组而构建出一株具有稳定耐热性的M-7 新菌株，并将其应用于高温下（37 ℃和42 ℃）的黄豆酱发酵以提升黄豆酱品质。试验结果表明，与亲本菌株相比，M-7 新菌株显示出不同的RAPD 图谱，表明了基因重组的成功。与出发菌株T.versatilis 相比，高温下，M-7 新菌株发酵的黄豆酱样品中，氨基酸态氮含量最高提升12.20%，全氮含量最高提升12.03%。此外，M-7 新菌株还显著提升了黄豆酱中多种风味物质的含量及多样性，其中酸类物质的含量提升最为明显，显著提升53.74%。同时，M-7 新菌株还大大提升了黄豆酱的感官质量，生产出总体可接受性最高的黄豆酱样品。最后，M-7 新菌株生成的生物胺总量远远低于1 000 mg/kg的有害水平，保证了黄豆酱的安全。综上，本研究所构建的耐高温M-7 新菌株在不影响黄豆酱安全性的前提下，提升了黄豆酱的营养、风味和感官品质。
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