衣康酸（itaconic acid，IA）又名亚甲基丁二酸或亚甲基琥珀酸，是一种重要的不饱和有机酸，被广泛应用于乳胶、塑料、树脂等高价值化学品的生产[1-2]，其被美国能源部评选为12 种最具发展潜力的生物基平台化合物之一[3]。它含有两个活泼的羧基和一个双键，赋予其活跃的功能，使其既可进行自身间的聚合，也能够与其他的单体如丙烯腈等聚合[4]。衣康酸作为化学工业的重要原料，易溶于水、乙醇等其它溶剂，能进行各种加成反应、酯化反应和聚合反应[5]。衣康酸与丙烯酸或甲基丙烯酸或其酯类聚合制成树脂，添加氯烷基二甲基苄基氯化铵可制成水溶性涂料，用于食品包装材料，可减少包装物表面细菌污染，防止微生物污染。
目前衣康酸的主要生产方法之一是微生物发酵法，利用糖类或淀粉类为原料，选用衣康酸发酵菌株，如土曲霉、玉米黑粉菌、黑曲霉等合成衣康酸[6-8]，土曲霉利用葡萄糖发酵生产衣康酸产量已达到160 g/L[9-10]，但存在发酵周期长达6.5 d、发酵糖酸转化率低等问题。随着生物技术及基因工程的发展，基于大肠杆菌[11]、酵母[12]、黑曲霉[13]等作为底盘生物来合成生产衣康酸的研究大量展开，如何快速高效筛选产衣康酸的菌株成为亟待解决的问题。目前，衣康酸的测定方法有碘定量法[14]、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[15]和电位滴定法等，其中碘定量法操作中碘易挥发，而且检测过程繁琐，结果误差大[14]；HPLC 法需要高压液相色谱设备并制备样品，无法实现在线快速检测[15]；基于已有检测方法的缺陷，如果能够设计与衣康酸浓度相关的显色反应，可实现其快速检测。基于衣康酸具有活泼的双键结构可与高锰酸钾发生反应，使高锰酸钾褪色，可通过高锰酸钾分光光度法进行快速检测，高锰酸钾分光光度法已经用于苯胺[16]和维生素B1[17]等的测定。
本研究基于衣康酸分子中碳碳双键的还原性，利用其能与高锰酸钾发生氧化还原反应使高锰酸钾褪色的特点，详细探究其反应条件。在此基础上，建立高锰酸钾分光光度法测定衣康酸浓度的方法。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
752 紫外-可见分光光度计：天津市华伟科技有限公司；BS-1 型电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。
高锰酸钾（分析纯）：天津市化学试剂一厂；衣康酸（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司。试验用水为蒸馏水。
1.2 方法
1.2.1 标准溶液的配制
高锰酸钾标准溶液（10 g/L）：准确称取1 g 高锰酸钾粉末溶于蒸馏水中，转移至100 mL 容量瓶中定容，避光处保存，使用时稀释至标准工作溶液2.50 g/L。
衣康酸标准溶液（10 g/L）：准确称取1 g 衣康酸粉末溶于蒸馏水中，转移至100 mL 容量瓶中定容。
1.2.2 高锰酸钾与衣康酸褪色反应
在25 mL 的比色管中依次加入2 mL 高锰酸钾标准工作溶液、1 mL 不同稀释度衣康酸标准溶液，用水稀释至刻度线并摇匀，在30 ℃下反应30 min 后，取1 mL于比色皿中，置于紫外-可见分光光度计上，在450 nm～700 nm 范围内进行扫描或以蒸馏水空白为参比测定540 nm 处体系的吸光度A，同时测定相应试剂空白的吸光度A0，求出差值ΔA=A0-A。
1.2.3 吸收波长的选择
按照1.2.1 步骤配制溶液，在450 nm～700 nm 范围内进行波长扫描，绘制吸收光谱。
1.2.4 高锰酸钾浓度的确定
高锰酸钾是衣康酸的氧化剂，高锰酸钾的浓度是影响该体系吸光度变化的关键因素，为此固定衣康酸浓度为0.12 g/L 时，考察高锰酸钾浓度（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/L）对体系吸光度的影响。
1.2.5 反应温度的确定
在25 mL 的比色管中依次加入2 mL 高锰酸钾标准工作溶液、1 mL 不同稀释度衣康酸标准溶液，摇匀，在不同水浴温度下恒温反应。通过观察不同温度（25、30、40、50 ℃）下0.20 g/L 高锰酸钾与不同浓度衣康酸反应的颜色差异，确定最适反应温度。
1.2.6 反应时间的确定
在25 mL 比色管中依次加入2 mL 高锰酸钾标准工作溶液、1 mL 不同稀释度衣康酸标准溶液，摇匀，同时配制试剂空白溶液，分别在30 ℃条件下反应。固定衣康酸的浓度为0.12、0.16、0.20 g/L，通过测定体系在不同时间的吸光度，考察在30 ℃条件下反应时间（5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 min）对体系吸光度的影响。
1.2.7 干扰试验
微生物发酵法是生产衣康酸的主要方法，发酵法生产衣康酸的过程中可能会产生不饱和酸如乌头酸，但其浓度极低，且不产生不饱和醛或酮。衣康酸发酵的最适原料是葡萄糖，除碳源外，衣康酸发酵还需要一些无机盐类，主要包括（NH4）2SO4、KH2PO4 和MgSO4·7H2O。为此固定衣康酸浓度为0.12 g/L 时，在高锰酸钾和衣康酸反应体系中加入一定浓度葡萄糖及金属离子，考察发酵液中共存物质对体系吸光度的影响。
2 结果与分析
2.1 吸收波长的确定
选择450 nm～700 nm 波长范围进行吸收光谱扫描，结果见图1。
由图1 可知，纯高锰酸钾溶液（0.12 g/L）呈紫红色，在525、540 nm 处有两个较强吸收峰；当高锰酸钾与衣康酸反应后，其吸收峰明显下降；衣康酸的加入使体系的吸收曲线发生明显的变化，吸收光谱的变化说明高锰酸钾和衣康酸之间发生了氧化还原反应，高锰酸钾被还原而褪色，虽然还在525、540 nm处有两个较强吸收峰，但峰值明显下降。其中，高锰酸钾与衣康酸反应后体系吸光度的差值ΔA（A 高锰酸钾-A高锰酸钾+衣康酸）在525 nm 处为1.663 5，在540 nm 处为1.820 1，ΔA 在540 nm 处最大，故本文选择540 nm 作为体系的测定波长。
图1 空白溶液与测定溶液吸收光谱
Fig.1 Absorption spectra of blank solution and measured solution
1.KMnO4（水为对照）；2.KMnO4（KMnO4+IA 为对照）。
2.2 高锰酸钾与衣康酸检测体系的建立
2.2.1 检测体系中高锰酸钾浓度的确定
高锰酸钾是衣康酸的氧化剂，固定衣康酸浓度为0.12 g/时，考察高锰酸钾浓度对体系吸光度的影响，结果见图2。
图2 高锰酸钾浓度对吸光度的影响
Fig.2 Effect of potassium permanganate concentration on absorbance
由图2a 可知，衣康酸浓度为0.12 g/L，固定体系中高锰酸钾的用量为2 mL，高锰酸钾浓度为0.05 g/L～0.25 g/L 时，随着高锰酸钾浓度的增加，体系的颜色加深，衣康酸被逐渐反应完全。由图2b 可知，随着高锰酸钾浓度的增加，体系的吸光度增加，吸光度的差值ΔA（A 高锰酸钾-A 高锰酸钾+衣康酸）也逐渐增加。当高锰酸钾的浓度为0.20 g/L 时，吸光度的差值ΔA 达到最大值，且随高锰酸钾浓度的增加，变化不大。体系中高锰酸钾的浓度大于0.25 g/L 时，溶液颜色太深，A 高锰酸钾超过分光光度计可测量范围的最大值。故选择体系中高锰酸钾的浓度为0.20 g/L。
2.2.2 反应温度的确定
衣康酸含有不饱和双键，具有活泼的化学性质。温度影响氧化还原反应速率，为此观察不同水浴温度下高锰酸钾与不同浓度衣康酸反应的颜色差异，选择差异明显的反应温度确定为最适反应温度。试验结果表明，0.20 g/L 高锰酸钾与不同浓度衣康酸标准溶液在25 ℃～30 ℃下反应30 min 颜色有明显差异，40 ℃～50 ℃条件下反应2 min 颜色差异明显，反应速度较快，误差增大，不易测量，因此选择反应温度为30 ℃。
2.2.3 反应时间的确定
通过测定体系在不同时间的吸光度，考察反应时间对吸光度的影响，结果如图3 所示。
图3 反应时间对吸光度的影响
Fig.3 Effect of reaction time on absorbance
图3结果表明，当衣康酸的浓度为0.12 g/L，在30 min 测定时，吸光度的差值ΔA 达到最大值，表明反应已进行完全，经SPSS 分析，30、35、40、45、50 5 个时间点的ΔA 的P 值在0.077～0.466 之间，均大于0.05，表示5 个时间点相互之间没有明显差异，吸光度的差值ΔA 在30 min 稳定，且延长反应时间到50 min 与反应30 min 无明显变化。当衣康酸的浓度为0.16 g/L，在25 min～50 min 测定时，吸光度的差值ΔA 稳定。当衣康酸的浓度为0.20 g/L，在30 min～50 min 测定时，吸光度的差值ΔA 稳定。故选择反应时间为30 min，并在50 min 内测量完毕。
2.3 标准衣康酸与高锰酸钾反应的吸光度曲线
准确移取不同体积10 g/L 的衣康酸标准溶液于一系列25 mL 比色管中，按1.2.2 步骤测定540 nm 处的吸光度A，同时测定相应试剂空白的吸光度A0，求出差值ΔA=A0-A。绘制工作曲线，结果如图4 所示。
图4 工作曲线
Fig.4 Working curve
由图4 可知，衣康酸在0.12 g/L～0.36 g/L 浓度范围内，其吸光度与其浓度呈线性关系，工作曲线的回归方程为y=1.862 1x+1.689 3，线性相关系数R2 为0.995 3。
2.4 干扰试验
按试验方法，考察发酵液中几种常见的金属离子和葡萄糖对衣康酸测定的影响，结果见表1。
表1 干扰试验
Table 1 Interference test
干扰组分 干扰组分浓度/（g/L） ΔA NH4+ 0.12 1.898 K+ 0.04 1.894 Mg2+ 0.06 1.900葡萄糖 0.40 1.909衣康酸标准液 0 1.904
表1 结果表明，在测定0.12 g/L 衣康酸时，相对误差在±5.00%范围内，0.12 g/L NH4+、0.04 g/L K+、0.06 g/L Mg2+对测定结果没有影响，0.40 g/L 葡萄糖不干扰测定。
2.5 精密度与回收试验
配制含有0.12 g/L 衣康酸的模拟发酵液，按1.2.2步骤测定发酵液中衣康酸含量。在样品中分别加入不同量衣康酸标准溶液，进行回收试验，结果见表2。
表2 结果显示，本方法的相对标准偏差为1.50%，回收率在100.00%～101.11%之间，由此可知本方法简单、准确、可靠，用于发酵液中衣康酸的测定，结果准确。
表2 衣康酸测定精密度与回收试验
Table 2 Determination precision and recovery test of itaconic acid
样品衣康酸含量/（g/L）测定衣康酸值/（g/L）相对标准偏差/%加标量/（g/L）测得衣康酸总量/（g/L）回收率/%0.120 0.123 1.500 0.020 0.140 100.00 0.120 0.120 1.500 0.060 0.182 101.11 0.120 0.107 1.500 0.100 0.221 100.45
3 结论
本文基于衣康酸与高锰酸钾发生的氧化还原反应，建立了分光光度法测定衣康酸含量的方法。检测体系为2.50 g/L 的高锰酸钾加入2.0 mL，即高锰酸钾的终浓度为0.20 g/L，含衣康酸样品加入1.0 mL，用水稀释至刻度线并摇匀，30 ℃反应30 min。以此检测方法用标准品进行加标回收试验，回收率为100.00%～101.11%，由此可知本文测定方法可靠，灵敏度高、操作简单，适用于发酵液中衣康酸的快速检测。
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