紫苏是一年生的草本植物，是我国首批列入药食同源的60 种作物之一[1]。紫苏因其生长周期较短（约60 d～90 d）、成本投入低，且对环境的适应性强、易成活、产量高等优势，有近2 000 年的栽培历史，不仅各地均有种植，中国还是紫苏栽培面积和出口量最大的国家[2]。紫苏中含有丰富的活性物质及营养成分，其中，黄酮类是紫苏叶中主要的活性物质[3-4]。现代药理研究表明，紫苏中的黄酮具有抗氧化、预防衰老[5]、治疗组织损伤后引起的炎症[6]、抑菌杀菌[7]、抗病毒[8]、调节神经中枢[9]、解热[10]等生理活性，最新研究表明紫苏叶中的黄酮在抗肿瘤和心血管疾病方面也发挥着重要作用[11-12]。紫苏作为一种营养丰富的药食两用植物，在食品、医药、化妆品等方面应用潜力较大，越来越受到大众的关注，紫苏的综合开发及利用逐渐成为科学界的研究热点。近年来，关于紫苏叶的研究多集中在提取及纯化上，且提取工艺主要为溶剂提取法、微波辅助提取法等工艺。然而，关于紫苏叶黄酮超声辅助提取与抗氧化性的研究鲜见。相较其他方法，超声辅助提取具有提取时间短、成本更低廉、提取效率高、操作简单等优点。因此，本研究将深入探讨紫苏叶含有的黄酮类活性物质及其抗氧化性质，为紫苏叶的深度开发利用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
紫苏叶：河北祁州中药材种植园；芦丁标准品、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、无水乙醇、磷酸氢二钠、过硫酸钾、硫酸亚铁：天津市风船化学试剂科技有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：京东化成工业株式会社；Trolox：上海源叶生物科技有限公司；过氧化氢：天津市北联精细化学品开发有限公司；水杨酸：天津渤化化学试剂有限公司；2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]：上海易恩化学技术有限公司。以上所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
AX224ZH 电子天平：奥豪斯仪器（常州）有限公司；STARTER-3100 酸度计：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；LGJ-1A-50 真空冷冻干燥机：科仪创智（北京）科技发展有限公司；UV-2600 紫外可见分光光度计：日本岛津仪器有限公司；YB-2500A 多功能粉碎：永康市速锋工贸有限公司；CL5R 高速冷冻离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；SK8210HP 超声波清洗器：上海科导超声仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 紫苏叶黄酮的提取工艺流程
40 ℃烘干至恒重→粉碎→过40 目筛→超声辅助提取→离心取上清液→测定吸光度→计算黄酮提取量。
1.3.2 单因素试验
挑选无腐烂霉变的新鲜紫苏叶放入40 ℃烘箱烘干6 h，用粉碎机将其粉碎的粉末过40 目筛，冷藏备用。以紫苏叶总黄酮的提取量为评价指标，考察的各因素水平及固定水平见表1。
表1 单因素试验中各因素考察参数及固定水平
Table 1 Factors and levels of single factor experiment
因素 水平 固定水平乙醇体积分数/% 25、30、35、40、45 30料液比/（g/mL） 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 1∶20超声功率/W 200、250、300、350、400 350提取时间/min 10、20、30、40、50 50提取温度/℃ 20、30、40、50、60 50
1.3.3 响应面试验
选用黄酮提取量为响应值，乙醇体积分数、料液比、超声功率和提取时间为响应变量。应用响应面优化紫苏叶中总黄酮的最优提取工艺后进行验证试验。试验考察因素及水平见表2。
表2 响应面考察因素与水平
Table 2 Factors and levels of response surface experiment
水平 因素提取时间/min 料液比/（g/mL）-1 25 1∶10 0 30 1∶15 1 35 1∶20超声功率/W 乙醇体积分数/%250 30 300 35 350 40
1.3.4 紫苏叶黄酮的提取量计算
参照吴昊等[13]的方法，选用芦丁标准溶液的浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，线性回归方程：A=13.243C-0.003 1，R2=0.994 4。将紫苏叶提取液进行适当稀释，测定吸光度并根据公式（1）计算。
式中：C 为通过计算得出的紫苏提取液中黄酮的质量浓度，mg/mL；V 为提取溶剂体积，mL；m 为紫苏叶粉末质量，g；F 为稀释倍数。
1.3.5 抗氧化性试验
1.3.5.1 清除DPPH 自由基试验
参考李学玲等[14]和Luo 等[15]的方法，分别取0.5 mL的40、50、60、70、80、90 μg/mL 紫苏叶黄酮提取液，加入1mL 0.1 mmol DPPH 乙醇溶液和1.5 mL 40%乙醇混匀，室温避光反应30 min 后，测定510 nm 波长处的吸光度值。随后用同样方法分别测定无水乙醇替换紫苏叶黄酮提取液和DPPH 溶液的吸光度。以黄酮提取液相应浓度的Trolox 溶液作对照组，DPPH 自由基清除率根据公式（2）计算。
式中：A1 为0.5 mL 黄酮提取液、1 mL 0.1 mmol DPPH乙醇溶液、1.5 mL 40%乙醇在510 nm 的吸光度；A2 为无水乙醇替换DPPH 工作液的吸光度；A0 为用无水乙醇替换黄酮提取液的吸光度。
1.3.5.2 清除ABTS＋自由基试验
参照张静等[16]的方法并进行适当修改，将245 μL（100 mmol/L）过硫酸钾溶液置于10 mL 容量瓶中，加入9.5 mL 的7 mmol/L ABTS 溶液后定容并混匀，避光静置16 h 得ABTS 母液。向pH7.4 的磷酸缓冲盐溶液中滴加ABTS 母液，在734 nm 波长处测吸光度，吸光度在值在0.68～0.72 内即得ABTS 工作液。吸取30 μL不同质量浓度（0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL）的紫苏叶黄酮提取液，加入3 mL ABTS 工作液并混匀，室温下避光静置6 min 后，测量734 nm 波长处的吸光度。随后用同样方法，测定用无水乙醇代替黄酮提取液和ABTS 工作液的吸光度。以黄酮提取液相应浓度的Trolox 溶液作对照组。
式中：A1 为30 μL 黄酮提取液、3 mL ABTS 工作液的吸光度；A2 为无水乙醇替换ABTS 工作液的吸光度；A0 为无水乙醇替换黄酮提取液的吸光度。
1.3.5.3 清除羟基自由基试验
采用雷良波等[17]的方法并稍加改动，取1 mL 不同质量浓度（0.1、0.3、0.5、0.7、1 mg/mL）紫苏叶黄酮提取液，依次加入1 mL 4 mmol FeSO4、1 mL 4.5 mmol 水杨酸和1 mL H2O2 混匀，静置反应30 min 后，测定510 nm波长处的吸光度。选用Trolox 溶液作对照组。
式中：A1 为1 mL Trolox 样品溶液+1 mL FeSO4+1 mL 水杨酸-乙醇+1 mL H2O2 在波长510 nm 的吸光度；A2 为1 mL 黄酮提取液+1 mL FeSO4+1 mL 水杨酸-乙醇+1 mL H2O 在波长510 nm 的吸光度；A0 为1 mL H2O+1 mL FeSO4+1 mL 水杨酸-乙醇+1 mL H2O2 在波长510 nm 的吸光度。
1.4 数据处理
以上试验均重复3 次，选用Graphpad Prism 9 和Design-Expert11.1.0 软件对数据进行作图和分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
乙醇体积分数、料液比、超声功率、提取时间和提取温度对紫苏叶黄酮提取量的影响如图1 所示。
图1 单因素试验结果
Fig.1 Results of single factor experiment
由图1 可以看出，随着各因素水平不断升高，黄酮提取量在一定范围内都呈现出先上升后下降的趋势，这可能是因为乙醇体积分数的增大可加大溶液对物料的渗透性，而乙醇浓度太高会致使细胞内蛋白质发生凝固，阻碍黄酮的溶出[18]；随溶剂添加量增大可使反应物与提取溶剂中黄酮浓度差和接触面积变大，利于黄酮的扩散，而过量的提取溶剂会导致紫苏叶中其他杂质溶出，从而总黄酮占溶出物的比例及其纯度下降[19-20]；在一定的提取时间下，物料中的黄酮类物质持续溶出，而提取时间过长使得黄酮发生变性损失[21]；超声功率增大可加速空化效应破坏细胞壁和细胞膜，加快黄酮物质溶出，而功率继续增大，也会导致提取温度过高，破坏黄酮的结构[22]；提取温度太低，分子运动速率较慢，不利于传质，而过高的提取温度会破坏黄酮结构[23]。因此，由单因素试验得到的最优试验条件为乙醇体积分数30%～40%、料液比1:10（g/mL）～1:20（g/mL）、提取时间20 min ～40 min、超声功率250 W ～350 W 和提取温度40 ℃～60 ℃。
2.2 各单因素与紫苏叶黄酮提取量的方差分析
对5 个单因素进行方差分析，结果如表3 所示。
表3 单因素试验方差分析结果
Table 3 Variance analysis of single factor experiment
因素水平 料液比/（g/mL）提取时间/min乙醇体积分数/%F 34.522 P 0.001超声功率/W 11.016 14.714 0.010 0.005提取温度/℃115.147 2.194＜0.000 1 0.193
由表3 可知，乙醇体积分数、超声功率和提取时间对黄酮提取量均有极显著影响（P＜0.01），料液比对黄酮提取量影响显著（P＜0.05），提取温度对黄酮提取量影响不显著（P＞0.05）。因此，选择影响黄酮提取量的关键因素（乙醇体积分数、超声功率、提取时间和料液比）进行响应面试验。
2.3 响应面试验结果
2.3.1 响应面试验结果与分析
应用Box-Behnken 建立了四因素三水平的响应面优化试验[24-25]，结果见表4。
表4 Box-Behnken 试验设计及结果
Table 4 Box-Behnken design and result
组别 A 乙醇体积分数 B 料液比 C 超声功率D 提取时间黄酮提取量/（mg/g）1 0 1 0 1 18.29 2 0 1 -1 0 19.23 3 0 0 1 -1 18.42 4 1 -1 0 0 18.68 5 0 0 0 0 22.48 6 1 0 -1 0 19.38 7 0 1 1 0 20.07 8 0 0 0 0 24.99 9 0 0 0 0 23.90 10 -1 0 0 -1 17.18 11 0 -1 0 1 17.71 12 0 0 0 0 22.76 13 1 1 0 0 19.21 14 0 0 -1 -1 18.62 15 -1 0 -1 0 18.09 16 1 0 1 0 21.39 17 0 1 0 -1 17.29 18 0 -1 1 0 18.28 19 0 0 -1 1 20.06 20 0 0 1 1 21.53 21 0 0 0 0 22.29 22 1 0 0 1 21.28 23 -1 0 0 1 14.91 24 -1 -1 0 0 15.24 25 -1 0 1 0 16.89 26 0 -1 0 -1 16.50 27 1 0 0 -1 17.73 28 -1 1 0 0 16.32 29 0 -1 -1 0 18.40
2.3.2 二次多项回归方程拟合与方差分析
方差分析结果见表5。
表5 回归方程各项的方差分析
Table 5 Analysis of variance of the regression equation
注：*表示影响显著，P＜0.05；**表示影响极显著，P＜0.01。
?
根据响应面的试验结果拟合回归方程：Y=23.28+1.59A+0.47B+0.23C+0.67D-0.14AB+0.80AC+1.45AD+0.24BC-0.05BD+0.42CD-2.97A2-3.10B2-1.21C2-2.56D2。
模型F=22.71，表明该模型精准度较高，回归模型失拟项F=0.17（P＞0.05），表明失拟项误差不显著，该响应面模型存在较小误差，二次模型较合理；模型P＜0.000 1，表明该模型可靠。在此情况下，一次项A 和D对紫苏叶黄酮的提取量具有极显著影响，是模型的重要参数，B 对模型的影响显著，C 对模型的影响不显著；二次项A2、B2、C2 和D2 对模型均具有极显著影响。各因素对黄酮提取量影响顺序为A＞D＞B＞C。
2.3.3 因素间的交互效应分析
根据数据模拟结果，绘制三维响应面图，结果见图2。
坡度越陡说明此项因素对响应面的影响越大，表明两两交互作用对黄酮的提取量的影响越大[26]。由图2 可知，紫苏叶黄酮的提取量随着各因素水平的持续增大，在一定范围内出现先上升后下降的趋势，其中乙醇体积分数和超声功率的交互作用对响应值有显著影响，乙醇体积分数和提取时间的交互作用对响应值有极显著影响，而其余的两两因素之间的交互作用对紫苏叶黄酮提取量的影响不显著。
图2 因素间的交互效应分析
Fig.2 Analysis of interaction between factors
2.3.4 最佳提取量验证
通过Design-Expert 分析得出紫苏叶黄酮最佳提取工艺为超声功率313.403 W，提取时间31.274 min，乙醇体积分数36.819%，料液比1∶15.381（g/mL）。考虑实际可操作性，调整参数为超声功率313 W，提取时间31 min，乙醇体积分数37%，料液比1∶15（g/mL）。进行3 次平行试验，紫苏叶黄酮提取量为22.48 mg/g，与理论值23.71 mg/g 相比，相对误差为5.19%，且t 检验差异不显著（P＞0.05），表明该拟合模型可靠。
2.4 紫苏叶黄酮的体外抗氧活活性
2.4.1 DPPH 自由基清除能力紫苏叶黄酮对DPPH 自由基的清除效果见图3。
图3 紫苏叶黄酮提取液对DPPH 自由基的清除效果
Fig.3 DPPH·scavenging rate of flavonoids from Perilla frutescens leaves
DPPH 自由基可以和黄酮类物质提供的质子结合形成一种稳定的抗磁性分子，从而降低DPPH 自由基的含量[27]。由图3 可知，紫苏叶黄酮提取液在质量浓度为40 mg/mL～70 mg/mL 内，对DPPH 自由基的清除率大体上呈直线上升趋势。与Trolox 对照组相比，紫苏叶黄酮的清除能力明显较弱；但随着质量浓度的增加，两者的差距逐渐减小。紫苏叶黄酮对DPPH 自由基的清除率在质量浓度为90 μg/mL 时，达到最大值，此时紫苏叶黄酮和Trolox 对DPPH 自由基的清除率为82.58%和97.22%，DPPH 溶液出现明显褪色现象[28]。由此可知，紫苏叶黄酮提取液对DPPH 自由基有良好的清除效果。
2.4.2 清除ABTS+自由基能力
紫苏叶黄酮对ABTS+自由基的清除效果见图4。
图4 紫苏叶黄酮提取液对ABTS+自由基的清除效果
Fig.4 ABTS＋·scavenging rate of flavonoids from Perilla frutescens leaves
黄酮类物质提供的H+可以与ABTS＋自由基结合，使其还原为惰性化合物或是稳定的自由基，从而降低了ABTS+自由基的含量。由图4 可知，紫苏叶黄酮和对照组Trolox 对ABTS＋自由基的清除率都是随着质量浓度增加而增大，紫苏叶黄酮对ABTS+自由基的清除能力在与Trolox 同一质量浓度下明显较弱。质量浓度在0.2 mg/mL～0.7 mg/mL 内，紫苏叶黄酮和Trolox 对ABTS+自由基清除率均在质量浓度为0.7 mg/mL 时达到最大，分别为57.89%和99.74%。由此可知，紫苏叶黄酮提取液对ABTS+自由基的清除效果明显弱于Trolox。
2.4.3 清除羟基自由基能力
紫苏叶黄酮对羟基自由基的清除效果见图5。
图5 紫苏叶黄酮提取液对羟基自由基的清除效果
Fig.5 Hydroxyl radical scavenging rate of flavonoids from Perilla frutescens leaves
羟基自由基有很高的氧化活性，其会对重要的生物体组织进行不定性的攻击，致使细胞损坏或死亡[29]。黄酮对羟基自由基有一定的清除能力，如图5 所示，在0.1 mg/mL～1.0 mg/mL 内，不同质量浓度的紫苏叶黄酮对羟基自由基均表现出一定的清除能力，并且羟基自由基清除率随紫苏叶黄酮质量浓度的增加而提高，且与浓度呈现正相关。但同质量浓度的紫苏叶黄酮对羟基自由基清除率低于Trolox 对照组。当质量浓度为1.0 mg/mL 时，紫苏叶黄酮和Trolox 对羟基自由基的清除效率最高，分别为48.78%和96.68%，表明紫苏叶黄酮提取液对羟基自由基清除率相比于Trolox 较弱，但也有一定的羟基自由基清除效果。
3 结论
本试验通过超声辅助提取紫苏叶黄酮，在单因素试验的基础上，对紫苏叶黄酮的超声辅助提取工艺进行响应面优化，得到的最佳工艺条件：超声功率313 W，提取时间31 min，乙醇体积分数37%，料液比1∶15（g/mL），在此最佳工艺条件下，紫苏叶黄酮的提取量为22.48 mg/g，对DPPH 自由基、ABTS＋自由基和羟基自由基的清除率分别达到82.58%、57.89%和48.78%，表现出一定的抗氧化能力，可作为一种安全的天然抗氧化剂。紫苏叶具有较高的应用价值和潜在经济效益，本文研究成果可为紫苏叶的开发应用、深加工、精加工提供一定的理论依据。
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