硫酸软骨素（chondroitin sulfate）是一种天然酸性黏多糖，具有多种生物活性，如缓解关节炎、食品乳化及保湿等，因而引起了全球医药界的广泛兴趣[1-3]。目前，我国商品化硫酸软骨素大多来源于猪、牛、鸡等陆生动物和鲨鱼等水生动物的软骨组织[5-7]。然而，陆生动物来源的硫酸软骨素面临着猪流感、疯牛病、禽流感等人畜共患急性传染病的威胁和风险，其安全性饱受质疑[8]；因此，硫酸软骨素的来源范围已逐渐扩大至鲨鱼、鲟鱼、鱿鱼等海洋生物[9-11]。然而，由于人类的过度捕捞和水质污染，某些体内含有特殊硫酸软骨素成分的物种已濒临灭绝，探索并开发能够替代这些物种来源的硫酸软骨素成为研究者们面临的重大挑战。
鳐鱼（Raja porosa），隶属脊索动物门、鳐科，在各个海域均有分布，为重要的渔业捕捞对象[12]。鳐鱼的内骨骼完全由软骨组成，占总体重的比例较大，常被作为副产物丢弃，造成了极大的资源浪费和环境污染，不利于鳐鱼产业链的持续健康发展。
本研究选取孔鳐软骨作为制备硫酸软骨素的原料，通过优化提纯工艺，以期有效提高硫酸软骨素的产率和纯度，大幅度增加鳐鱼加工产业的附加值，为鳐鱼硫酸软骨素的工业生产提供技术支持和数据参考。此外，本研究还将对鳐鱼硫酸软骨素的品质及结构进行研究，为鳐鱼硫酸软骨素的进一步开发和应用提供基础理论数据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
孔鳐软骨：秦皇岛海东青有限公司。
1.1.2 试剂
碱性蛋白酶（200 U/mg）、考马斯亮蓝：北京索莱宝生物有限公司；葡萄糖醛酸标准品、乙酸铜一水合物、荧光素钠、水杨酸钠：上海源叶生物科技有限公司；硫酸软骨素标准品、氢氧化钠：上海阿拉丁生化科技有限公司。
1.2 仪器与设备
高速粉碎机（TP-1000C-8）：宁波新芝生物科技股份有限公司；真空冷冻干燥机（FD-5）：上海能共实业有限公司；台式高速冷冻离心机（TGL-16M）：长沙易达仪器有限公司；紫外分光光度计（721）：上海菁华科技仪器有限公司；傅里叶变换红外光谱仪（Vertex 70）：德国布鲁克公司；多功能酶标仪（Varioskan－Flash3001）：美国赛默飞世尔科技公司；凝胶渗透色谱仪（PL-GPC50）：美国安捷伦科技公司。
1.3 方法
1.3.1 样品处理
取鳐鱼全身软骨，用清水洗净，剪成小块后烘干至恒重，研磨粉碎，冷冻备用。
1.3.2 提取工艺流程
鳐鱼软骨粉→碱提取→酶解→灭酶→乙醇沉淀→离心取沉淀→冻干→硫酸软骨素。
1.3.3 硫酸软骨素提取单因素试验
以硫酸软骨素提取率及其葡萄糖醛酸含量为评价指标，分别对碱液浓度、提取温度和碱性蛋白酶添加量3 个参数进行单因素试验。
1.3.3.1 碱液浓度对提取效果的影响
每组试验称取5 g 鳐鱼软骨粉于烧杯中，以料液比1∶6（g/mL），提取温度40 ℃，酶添加量0.5%，碱液（NaOH）浓度分别为1%、2%、3%、4%，参照1.3.2 方法进行提取试验，离心收集沉淀并冻干，干燥条件下储藏，待测。
1.3.3.2 提取温度对提取效果的影响
每组试验称取5 g 鳐鱼软骨粉于烧杯中，以料液比1∶6（g/mL），碱液浓度2%，酶添加量0.5%，提取温度分别为30、40、50、60 ℃，参照1.3.2 方法进行提取试验，离心收集沉淀并冻干，干燥条件下储藏，待测。
1.3.3.3 酶添加量对提取效果的影响
每组试验称取5 g 鳐鱼软骨粉于烧杯中，以料液比1∶6（g/mL），碱液浓度为2%，提取温度为40 ℃，酶添加量分别为0.25%、0.50%、1.00%、2.00%，参照1.3.2方法进行提取试验，离心收集沉淀并冻干，干燥条件下储藏，待测其含量。
1.3.4 响应面法优化硫酸软骨素提取工艺
依照Box-Behnken 进行响应曲面模型设计：选取碱液浓度（A）、提取温度（B）、酶添加量（C）为3 个考察因素，每个因素设置3 个试验水平，以硫酸软骨素提取率（Y）为响应值，使用Design-Expert 10.0 设计响应面试验，探究硫酸软骨素最佳提取条件下各因素的水平。
表1 Box-Behnken 响应面试验因素与水平
Table 1 Box-Behnken response surface test factors and levels
水平 因素A 碱液浓度/% B 提取温度/℃ C 酶添加量/%-1 1 30 0.250 0 2 40 0.625 1 3 50 1.000
1.3.5 鳐鱼硫酸软骨素提取率的测定
参照王妍等[13]方法测定鳐鱼硫酸软骨素提取率，提取率按以下公式计算。
提取率/%=M/5×100
式中：M 为冻干硫酸软骨素样品质量，g；5 为鳐鱼软骨粉质量，g。
1.3.6 鳐鱼硫酸软骨素理化性质的分析
1.3.6.1 葡萄糖醛酸含量的测定
采用硫酸-咔唑法[14]测定硫酸软骨素中葡萄糖醛酸含量。分别吸取50 μg/mL 葡萄糖醛酸标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，加水补至1 mL，4 ℃冰浴5 min，各加入5 mL 硼砂-硫酸试剂，沸水加热15 min 后迅速冷却，加入0.2 mL 咔唑，沸水加热显色15 min，在530 nm处测定其吸光度，以浓度和吸光度为横、纵坐标绘制标准曲线，标准曲线方程为y=8.152 803-0.211 132x，R2=0.999 44。
配制50 μg/mL 的硫酸软骨素溶液按上述步骤操作，根据标准曲线方程计算样品中葡萄糖醛酸含量。
1.3.6.2 分子量和纯度测定
采用高效凝胶渗透色谱（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）法测定硫酸软骨素样品的分子量及纯度[15]。使用系列分子量的葡聚糖标准品作为分子量参考，通过保留时间对相应的分子量的对数绘制标准曲线，将样品的保留时间带入校准曲线方程中，计算硫酸软骨素样品的分子量，通过得出的重均分子量（Mw）和数均分子量（Mn）计算其多分散系数（polydispersity index，PDI）。
1.3.6.3 红外光谱分析
将鲨鱼来源的硫酸软骨素标准品、鳐鱼硫酸软骨素干燥至恒重，与KBr 研磨成粉，混合均匀，制成压片，采用傅里叶变换红外光谱仪进行扫描分析（4 000 cm-1～400 cm-1）。
1.3.7 鳐鱼硫酸软骨素质量指标的测定
鳐鱼硫酸软骨素主要质量指标的测定方法按照《中国药典》2015 版的要求进行。
1.4 数据处理与分析
试验采用Design-Expert 10.0 软件进行响应面试验设计，采用SPSS 18.0 软件进行数据分析，P＜0.05 为具有统计学意义的显著差异。
2 结果与分析
2.1 鳐鱼硫酸软骨素提取单因素试验
碱液浓度、提取温度和碱性蛋白酶添加量3 个因素对鳐鱼硫酸软骨素提取效果的影响如表2～表4 所示。
表2 碱液浓度对硫酸软骨素提取率和葡萄糖醛酸含量的影响
Table 2 Effect of alkali concentration on the extraction rate of chondroitin sulfate and the content of glucuronic acid
碱液浓度/% 提取率/% 葡萄糖醛酸含量/%1 10.72 17.23 2 36.88 23.08 3 33.68 17.55 4 28.79 18.93
表3 提取温度对硫酸软骨素提取率和葡萄糖醛酸含量的影响
Table 3 Effect of extraction temperature on the extraction rate of chondroitin sulfate and the content of glucuronic acid
提取温度/℃ 提取率/% 葡萄糖醛酸含量/%30 30.76 20.97 40 36.39 22.51 50 32.73 20.48 60 28.35 16.17
表4 酶添加量对硫酸软骨素提取率和葡萄糖醛酸含量的影响
Table 4 Effect of enzyme addition on the extraction rate of chondroitin sulfate and the content of glucuronic acid
酶添加量/% 提取率/% 葡萄糖醛酸含量/%0.25 31.95 18.35 0.50 36.33 22.59 1.00 36.25 20.48 2.00 36.30 19.42
由表2 可知，碱液浓度由1%增加至2%时，硫酸软骨素提取率从10.72%明显上升至36.88%，而随着碱液浓度的进一步增大，硫酸软骨素提取率出现了一定程度的下降；硫酸软骨素产物的葡萄糖醛酸含量也呈现出相似的趋势，同样在碱液浓度为2%时达到最大值，为23.08%。在碱液浓度较低时，鳐鱼软骨组织中糖蛋白无法被有效分离，大部分硫酸软骨素未溶解于溶液中；而碱液浓度过高时，硫酸软骨素分子易被降解，造成提取率的下降，且在试验过程中发现，碱液浓度越高，硫酸软骨素产品的色泽越深，此外，还会加大后续工艺中HCl 的用量，造成试剂的浪费以及成本的提高。
由表3 可知，提取温度由30 ℃上升至40 ℃时，硫酸软骨素提取率从30.76%提高至36.39%，而当提取温度大于40 ℃时，硫酸软骨素提取率随温度升高而下降，在60 ℃时仅为28.35%；40 ℃时达到最大值，为36.39%，而提高温度后出现了明显下降，且提取温度越高，浸提液的颜色越深，60 ℃时呈褐色。在一定的提取温度范围内，温度越高，硫酸软骨素提取率及葡萄糖醛酸含量越高，这是由于较高的提取温度可使蛋白多糖发生β-消去反应的速率加快，同时能够提高硫酸软骨素分子的溶出速率，有利于硫酸软骨素从蛋白多糖中释放。但当温度过高时，浸提液长时间处于高温环境下，溶解于其中的硫酸软骨素被碱液降解，导致提取率的降低，同时某些杂质（蛋白质和无机盐等）由于溶解度的提高也溶解于浸提液中，造成了硫酸软骨素样品中杂质含量的增多、纯度的下降以及外观品质的降低。
由表4 可知，当酶添加量由0.25%上升至0.50%时，硫酸软骨素提取率及葡萄糖醛酸含量出现了大幅度的提高并达到了最大，为36.33%和22.59%，但当进一步提高酶添加量后，硫酸软骨素提取率并没有发生明显的变化，而葡萄糖醛酸含量却发生了一定程度的下降。此结果表明，在酶添加量较低时，底物无法与蛋白酶分子充分结合，蛋白质的水解程度受到限制；当继续添加蛋白酶后，酶与底物蛋白的结合达到饱和，以蛋白质-多糖复合物形式存在的硫酸软骨素分子被充分释放，从而达到最佳的提取效果；然而在此基础上过量地添加蛋白酶，并不能提高蛋白质的水解程度，反而会大量引入蛋白酶这种新的杂质，使其残留在溶液中，进而降低了硫酸软骨素产物的纯度，并且在试验中发现，碱性蛋白酶加入到溶液中会使反应体系呈棕褐色，过度添加不仅提高了生产成本，还会导致硫酸软骨素产品外观品质的下降。
2.2 响应面试验优化提取工艺
2.2.1 提取条件优化分析
响应面试验设计及结果见表5。
表5 Box-Behnken 响应面试验设计及结果
Table 5 Box-Behnken response surface test design and results
试验组 A 碱液浓度 B 提取温度 C 酶添加量 Y 提取率/%1-1 1 0 30.03 2-1 1 0 25.78 3 0 1 1 40.63 4-1 0 -1 28.11 5 -1 0 1 28.70 6 0 0 0 42.21 7-1 38.30 8 0 0 0 43.10 0 1 42.39 10 0 -1 -1 32.51 11 1 0 1 38.06 12 0 0 0 41.85 13 1 0 -1 35.50 14 1 -1 0 35.40 15 0 0 0 41.85 16 0 -1 1 35.14 17 1 1 0 37.26 9 0 0 0
2.2.2 方差分析
利用Design-Expert 10.0 分析表5 中数据，得出多元拟合回归方程：Y=42.28+4.20A+2.17B+1.01C-0.60AB+0.49AC-0.075BC-7.11A2-3.06B2-2.58C2。
为了检验回归方程的有效性，需对其进行方差分析和模型分析，响应面试验方差分析见表6。
表6 模型回归方程方差分析
Table 6 Analysis of variance of regression model
注：**表示极显著（P＜0.01）；*表示显著（P＜0.05）；/表示不显著（P＞0.05）。
来源 离差平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型 493.79 9 54.87 79.83 ＜0.000 1 **A 碱液浓度 141.12 1 141.12 205.33 ＜0.000 1 **B 提取温度 37.80 1 37.80 55.00 0.000 1 **C 酶添加量 8.22 1 8.22 11.96 0.010 6 *AB 1.43 1 1.43 2.08 0.192 7 /AC 0.97 1 0.97 1.41 0.273 5 /BC 0.023 1 0.023 0.033 0.861 5 /A2 212.70 1 212.70 309.48 ＜0.000 1 **B2 39.30 1 39.30 57.18 0.000 1 **C2 28.03 1 28.03 40.78 0.000 4 **残差 4.81 7 0.69失拟项 3.75 3 1.25 4.72 0.083 9 /净误差 1.06 4 0.26总误差 498.60 16
由表6 可知，此回归模型的显著性检验（P＜0.000 1）达到极显著水平，表明该模型具有统计学意义；失拟项P 值为0.083 9＞0.05，不显著，说明试验误差小；校正决定系数R2Adj=0.977 9，说明该模型能解释97.79%响应值的变化；相关系数R2=0.990 4，说明该模型拟合程度很好，可用此模型优化和预测工艺参数。
从模型回归方程以及表6 可知：模型一次项A、B极显著，C 显著；模型二次项A2、B2、C2 均极显著；交互项AB、AC、BC 皆不显著。由F 值可知，各因素对硫酸软骨素提取率的影响大小依次为A＞B＞C，即碱液浓度＞提取温度＞酶添加量。
2.2.3 各因素间交互作用分析
通过Design-Expert 10.0 软件绘制多元回归方程的响应曲面图及其等高线图（图1），以进一步研究相关变量间的交互作用，确定最佳因素水平范围。
图1 各因素的交互作用对硫酸软骨素提取率的影响
Fig.1 Interaction effects of factors on the extraction of chondroitin sulfate
由1a 可知，在碱液浓度为2.0%～2.5%，温度为40 ℃～45 ℃时，响应面坡度达到最高，即硫酸软骨素提取率达到最大值。在一定的提取温度下，硫酸软骨素提取率随碱液浓度的增大呈现先上升后下降的趋势，当碱液浓度恒定时，提取率随提取温度的升高而上升，然后出现下降，碱液浓度的主效应大于提取温度。由方差分析表6 和等高线图可以看出，碱液浓度（A）与提取温度（B）的交互作用对硫酸软骨素提取率（Y）的影响不显著。
由图1b 可以看出，碱液浓度对硫酸软骨素提取率的影响大于酶添加量，在碱液浓度较高时，较少的酶添加量即可得到较高的提取率。随着碱液浓度的提高，硫酸软骨素提取率上升较快，但当碱液浓度大于2.5%时，提取率出现明显的下降。而在碱液浓度为2.0%～2.5%，酶添加量为0.7%时，响应面坡度达到最高，硫酸软骨素提取率达到最大值。由方差分析表6和等高线图可以看出，碱液浓度（A）与酶添加量（C）的交互作用对硫酸软骨素提取率（Y）的影响不显著。
由图1c 可知，提取温度与酶添加量的交互作用对硫酸软骨素提取率的影响不显著，与方差分析结果一致。酶添加量为0.7%，提取温度为40 ℃～45 ℃时，响应曲面坡度最高，硫酸软骨素提取率有最大值。
2.2.4 响应面优化提取工艺的验证
通过Design-Expert 10.0 分析数据，并对回归方程求解，以硫酸软骨素提取率（Y）为指标，根据响应面分析得出最佳硫酸软骨素提取工艺参数：碱液浓度2.290%，提取温度43.249 ℃，酶添加量0.707%，在此条件下硫酸软骨素提取率的预测值可达43.35%。为方便实际的试验操作，将各因素修正为碱液浓度2.3%，提取温度43 ℃，酶添加量0.7%，并在此条件下进行3 次验证试验，硫酸软骨素提取率的平均值为43.32%，与理论值43.35%基本吻合，说明响应面试验的优化结果可靠、准确。
2.3 鳐鱼硫酸软骨素分子量和纯度的测定结果
葡聚糖标准曲线见图2。
图2 葡聚糖标准曲线
Fig.2 Standard curve of glucan
由图2 可知，鳐鱼硫酸软骨素的重均分子量（Mw）为40 752，数均分子量（Mn）为38 257，纯度为94%，多分散系数（PDI，Mw/Mn）达到1.065 2。上述结果表明，提取得到的鳐鱼硫酸软骨素成分均一、纯度较高。
2.4 硫酸软骨素的红外光谱分析
鲨鱼来源的硫酸软骨素标准品和鳐鱼硫酸软骨素的红外光谱图见图3。
图3 鳐鱼硫酸软骨素和鲨鱼硫酸软骨素的红外光谱图
Fig.3 Fourier transform infrared transform spectra of chondroitin sulfate from shark and Raja porosa
由图3 可知，鲨鱼硫酸软骨素和鳐鱼硫酸软骨素的红外光谱十分相似，二者的大多数官能团基本一致：在3 435 cm-1 处都有一强宽峰，这是由硫酸软骨素分子中的羟基和氨基的伸缩振动引起的；在2 920 cm-1附近都存在甲基的C—H 伸缩振动峰；在1 635 cm-1 附近都有较强的乙酰氨基中羰基伸缩振动峰，说明两者都含有乙酰氨基；1 424 cm-1 处的C—O 伸缩振动证明了羧基的存在，而1 384 cm-1 处的吸收峰为—COO-离子的谱峰，这说明两种硫酸软骨素中皆同时含有离子化和非离子化的葡萄糖醛酸；在1 560 cm-1 附近都发现了乙酰氨基的N—H 变角振动；在1 262 cm-1 都出现了强的硫酸酯基的
非对称伸缩振动峰，这说明两种硫酸软骨素的硫酸取代基都较多；而糖环的C—O伸缩振动特征峰也都在1 140 cm-1～1 045 cm-1 范围内被发现，证明了两种硫酸软骨素都具有完整糖环结构；927 cm-1 附近的吡喃糖环的非对称伸缩振动特征峰也证实了两者的葡萄糖醛酸为β-D-吡喃葡萄糖醛酸构型；在821 cm-1 附近出现了硫酸酯基的C—O—S伸缩振动峰，表明硫酸基团结合在N-乙酰基-半乳糖胺的C6 位置上，这说明两种硫酸软骨素都含有6-硫酸软骨素，即硫酸软骨素-C。综合以上结果可知，鲨鱼硫酸软骨素和鳐鱼硫酸软骨素都含有羟基、乙酰氨基、羧基、硫酸酯基、吡喃糖环等官能团。
除此之外，可以看出鲨鱼硫酸软骨素与鳐鱼硫酸软骨素在某些谱峰上存在差异，如：鳐鱼硫酸软骨素在1 424 cm-1 处有强度较弱的振动谱峰，而鲨鱼硫酸软骨素的为中等强度；在1 384 cm-1 处鳐鱼硫酸软骨素的振动谱峰较强，而鲨鱼硫酸软骨素的则较弱，这说明在鲨鱼硫酸软骨素中羧基主要以葡萄糖醛酸的形式存在，而鳐鱼硫酸软骨素的葡萄糖醛酸大多被离子化，羧基主要以羧酸根（—COO-）的形式存在，这可能是由于在提取过程中，溶液中的Na+与葡萄糖醛酸分子结合，羧基被离子化，形成了硫酸软骨素钠而导致的。此外，在862 cm-1 处还观察到了鳐鱼硫酸软骨素的较弱的硫酸酯基振动峰，而这属于典型的4-硫酸软骨素的特征吸收峰，因此鳐鱼硫酸软骨素中可能含有少量的4-硫酸软骨素分子。
2.5 鳐鱼硫酸软骨素主要质量指标
鳐鱼硫酸软骨素样品的主要质量指标测定结果如表7 所示。
表7 鳐鱼硫酸软骨素的主要理化性质和质量指标
Table 7 Physical and chemical properties and quality indexes of chondroitin sulfate from Raja porosa
注：/表示未做要求。
项目 质量指标要求 硫酸软骨素样品性状 白色或类白色粉末 白色粉末溶解度 易溶于水，不溶于乙醇、丙酮、冰醋酸易溶于水，不溶于乙醇、丙酮、冰醋酸酸度 6.0～7.0 6.1澄清度 ≤0.05 0.041含氮量 2.5%～3.5% 3.14%干燥失重 ≤10.0% 9.09%蛋白质含量 / 1.35%葡萄糖醛酸含量 / 28.20%硫酸根含量 / 17.18%
由表7 可知，鳐鱼硫酸软骨素样品为白色粉末状固体，无臭，不溶于乙醇、乙酸和丙酮，易溶于水且溶液无色透明，具有黏稠性，加热不发生凝结。其他主要质量指标均符合2015 版《中国药典》标准要求。此外，经测定，鳐鱼硫酸软骨素样品中蛋白质含量为1.35%，葡萄糖醛酸含量为28.20%。
此外，经测定，鳐鱼硫酸软骨素样品中的硫酸根含量高达17.18%，这说明鳐鱼硫酸软骨素是一种高度硫酸化的多糖。硫酸根作为硫酸软骨素结构中的重要组成成分之一，与硫酸软骨素的分子量、电荷密度以及生理活性密切相关。一般认为，硫酸软骨素的硫酸化程度越高，则其分子量和电荷密度越大，与蛋白质的结合能力就越强[16]；Bobula 等[17]的研究表明，高度硫酸化的硫酸软骨素的抗氧化能力明显高于硫酸化程度较低的硫酸软骨素。
3 结论
本研究选用资源相对丰富的孔鳐软骨作为硫酸软骨素的提取原料，进行提取纯化工艺的优化及多糖结构的表征。碱-酶解法为最佳工艺条件：碱液浓度2.3%，提取温度43 ℃，酶添加量0.7%，最终提取率可达43.32%。制备得到的鳐鱼CS 样品的主要质量指标均符合标准要求，蛋白质含量为1.35%，葡萄糖醛酸含量为28.20%，硫酸根含量达到17.18%，为高度硫酸化的软骨素多糖纯品。鳐鱼CS 的纯度为94%，重均分子量为40 752，多分散系数为1.065 2，鳐鱼硫酸软骨素具有与鲨鱼硫酸软骨素相同的结构特点。
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