葛氏鲈塘鳢（Perccottus glenii），隶属于鲈形目，沙塘鳢科[1]，俗称老头鱼、还阳鱼、山胖子[2]，是一种原产于俄罗斯远东地区、中国东北部和朝鲜半岛北部的鱼类[3]。葛氏鲈塘鳢由于其口感独特，且鱼刺较少，成为人们青睐的一种食品，并且已经成为中国东北水产养殖的重要品种[4]。鱼头作为水产品加工副产物，大多被随意丢弃，这不仅造成环境污染，也是一种资源的浪费[5]。目前已有研究证明葛氏鲈塘鳢鱼头多糖具有抗氧化、降血压、抗凝血等生理活性[6-8]；且根据目前的研究可知，葛氏鲈塘鳢鱼头多糖的提取方法多为碱法提取[8]。
本研究以葛氏鲈塘鳢鱼头作为原料，以多糖提取率为指标，通过单因素试验和响应面试验优化葛氏鲈塘鳢鱼头多糖的提取工艺，并对提取到的多糖进行抗氧化研究，为葛氏鲈塘鳢鱼头高值化利用及深入研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
葛氏鲈塘鳢：黑龙江佳木斯；中性蛋白酶（100 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）、纤维素酶（50 U/mg）：大连美伦生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-dipheny l-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美国Sigma 公司。
1.2 仪器与设备
旋转蒸发仪（RE-3000A）：上海亚荣生化仪器厂；台式高速离心机（L550）：湘仪离心机仪器有限公司；pH 计（S400-B）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；紫外分光光度计（721G-100）：上海仪电分析仪器有限公司；傅立叶变换红外光谱仪（Nicolet 6700）：美国Thermo Fisher Scientific 公司。
1.3 方法
1.3.1 多糖的提取
将葛氏鲈塘鳢鱼头冻干后粉碎过筛，在特定的条件下酶解、沸水灭活，待酶解液冷却至室温后调节pH值至中性，5 000 r/min 离心10 min，获得上清液，旋转蒸发至原体积的三分之一，用3 倍体积的95%乙醇进行醇沉，24 h 后继续5 000 r/min 离心，收集沉淀物并冻干，最后获得葛氏鲈塘鳢鱼头多糖。
1.3.2 酶种类的筛选
固定料液比1∶40（g/mL）、酶解温度37 ℃、酶解时间3 h、pH7.0，保持以上提取条件不变，分别选取纤维素酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，酶添加量均为2%，探讨酶种类对葛氏鲈塘鳢鱼头多糖提取率的影响。
1.3.3 单因素试验
根据最佳用酶的试验结果，选用木瓜蛋白酶作为酶解蛋白酶，按1.3.1 中所述的提取方法，考察料液比、pH 值、酶解时间、酶解温度和酶添加量对葛氏鲈塘鳢鱼头多糖提取率的影响。
1.3.4 响应面试验设计
在单因素试验基础上，选择酶解时间2 h，采用Box-Behnken 试验设计，以pH 值（A）、酶添加量（B）、料液比（C）和酶解温度（D）为自变量，多糖提取率为响应值设计四因素三水平响应面试验，优化葛氏鲈塘鳢鱼头多糖提取的工艺，响应面试验设计如表1 所示。
表1 响应面试验设计
Table 1 Response surface design
水平 因素A pH 值 D 酶解温度/℃-1 6.0 32 0 6.5 37 1 7.0 42 B 酶添加量/% C 料液比/（g/mL）2.0 1∶20 2.5 1∶30 3.0 1∶40
1.3.5 多糖提取率测定方法
多糖提取率计算参考赵文瑾等方法[9]，多糖提取率计算公式如下。
多糖提取率/%=（C×V×N）/（m×106）×100
式中：C 为提取液多糖浓度，μg/mL；V 为提取液体积，mL；N 为稀释倍数；m 为葛氏鲈塘鳢鱼头粉末质量，g。
1.3.6 多糖的抗氧化活性测定
1.3.6.1 羟自由基清除能力测定
葛氏鲈塘鳢鱼头多糖的羟自由基清除能力根据Zhu 等[10]的方法稍作修改，以VC 为阳性对照，用Fenton反应体系测定样品的羟基自由基清除能力。取5 支干燥试管，依次加入0.5 mL FeSO4（9 mmol/L）、0.5 mL水杨酸-乙醇溶液（9 mmol/L）和1 mL 不同质量浓度（0.5 mg/mL～10 mg/mL）的多糖样品溶液，最后加入5 mL H2O（29 mmol/L），在37 ℃下水浴30 min。在510 nm处测定溶液的吸光度，取3 次的平均值。羟自由基清除率按下式计算。
羟自由基清除率/%=[1-（Ax-Ax0）]/A0×100
式中：A0 为用蒸馏水代替样品的吸光度；Ax 为样品组的吸光度；Ax0 为用蒸馏水代替H2O2 的吸光度。
1.3.6.2 DPPH 自由基清除能力测定
葛氏鲈塘鳢鱼头多糖的DPPH 自由基清除能力根据Tan 等[11]的方法稍作修改，以VC 为阳性对照，取5 支干燥管，依次加入2 mL 不同质量浓度（0.5 mg/mL～10 mg/mL）的多糖样品溶液和2 mL DPPH 无水乙醇溶液（0.2 mmol/L），充分混合，在室温下避光反应30 min。在波长517 nm 处测定溶液的吸光度，取3 次的平均值。DPPH 自由基清除率按下式计算。
DPPH 自由基清除率/%=[1-（Ax-Ax0）]/A0×100
式中：A0 为用蒸馏水代替样品的吸光度；Ax 为样品组的吸光度；Ax0 为用无水乙醇代替DPPH 无水乙醇溶液的吸光度。
1.3.7 红外光谱测定
将葛氏鲈塘鳢鱼头多糖与KBr 按质量比1∶100 充分研磨混匀后压片。以KBr 为空白，置于红外光谱仪中，在4 000 cm-1～400 cm-1 区间内进行红外光谱扫描[12]。
1.4 数据处理
试验所有数据均测定3 次，绘图采用origin 2018软件，响应面分析软件为Design-Expert8，采用SPSS 23.0 软件进行显著性分析和方差分析。
2 结果与分析
2.1 酶种类对葛氏鲈塘鳢鱼头多糖提取率的影响
不同蛋白酶对葛氏鲈塘鳢鱼头多糖提取率的影响见图1。
图1 不同蛋白酶对葛氏鲈塘鳢鱼头多糖提取率的影响
Fig.1 Effects of different enzymes on the extraction yield of polysaccharides from the head of Perccottus glenii
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图1 可知，当采用木瓜蛋白酶酶解葛氏鲈塘鳢鱼头多糖时，多糖的提取率最高，达到11.1%，其次为中性蛋白酶，为9.2%，纤维素酶酶解提取率最低，为8.3%。因此选用木瓜蛋白酶作为试验用酶来提取葛氏鲈塘鳢鱼头多糖。
2.2 单因素试验结果分析
2.2.1 pH 值对葛氏鲈塘鳢鱼头多糖提取率的影响
pH 值对葛氏鲈塘鳢鱼头多糖提取率的影响见图2。
图2 pH 值对葛氏鲈塘鳢鱼头多糖提取率的影响
Fig.2 Effect of pH on the extraction yield of polysaccharides from the head of Perccottus glenii
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图2 可知，多糖提取率在pH 值为6.5 时达到峰值，为9.8%；pH 值为6.0～6.5 时，多糖提取率随pH 值的增大而增大，而在6.5～8.0 时，多糖提取率随pH 值的增大而缓慢下降，可能是当pH 值大于6.5 时，酶的活性受到抑制而使多糖的提取率下降。
2.2.2 酶添加量对葛氏鲈塘鳢鱼头多糖提取率的影响
酶添加量对葛氏鲈塘鳢鱼头多糖提取率的影响见图3。
图3 酶添加量对葛氏鲈塘鳢鱼头多糖提取率的影响
Fig.3 Effect of enzyme dose on the extraction yield of polysaccharides from the head of Perccottus glenii
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图3 可知，多糖提取率在酶添加量为2.5%时达到峰值，为9.4%，酶添加量在1.0%～2.5%时，多糖提取率随酶添加量的增加逐渐增大，而在2.5%～3.0%时下降，可能是因为在酶催化底物反应中，当底物完全与酶结合后，再增大酶添加量，反而使反应体系中杂物增加，而使得多糖提取率降低。
2.2.3 料液比对葛氏鲈塘鳢鱼头多糖提取率的影响
料液比对葛氏鲈塘鳢鱼头多糖提取率的影响见图4。
图4 料液比对葛氏鲈塘鳢鱼头多糖提取率的影响
Fig.4 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction yield of polysaccharides from the head of Perccottus glenii
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图4 可知，多糖提取率在料液比为1∶30（g/mL）时达到峰值，为9.2%。料液比在1∶20（g/mL）～1∶30（g/mL）时，多糖提取率随溶剂用量的增加逐渐增大，而在1∶30（g/mL）～1∶50（g/mL）时，逐渐下降，可能是因为溶剂用量过大会将酶浓度稀释，而使得多糖提取率降低。
2.2.4 酶解温度对葛氏鲈塘鳢鱼头多糖提取率的影响
酶解温度对葛氏鲈塘鳢鱼头多糖提取率的影响见图5。
图5 酶解温度对葛氏鲈塘鳢鱼头多糖提取率的影响
Fig.5 Effect of enzymolysis temperature on the yield of polysaccharides from the head of Perccottus glenii
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图5 可知，多糖提取率在酶解温度为37 ℃条件下达到峰值，为9.4%。酶解温度在27 ℃～37 ℃时，多糖提取率随酶解温度的上升逐渐增大，而在37 ℃～47 ℃时逐渐下降，可能是由于酶作为生物大分子，在过高温度下稳定性降低而变性失活，而使得多糖提取率降低。
2.2.5 酶解时间对葛氏鲈塘鳢鱼头多糖提取率的影响
酶解时间对葛氏鲈塘鳢鱼头多糖提取率的影响见图6。
图6 酶解时间对葛氏鲈塘鳢鱼头多糖提取率的影响
Fig.6 Effect of enzymolysis time on the yield of polysaccharides from the head of Perccottus glenii
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图6 可知，多糖提取率在酶解时间为2 h 时达到峰值，为9.3%。酶解时间在1 h～2 h 时，多糖提取率平缓上升，而在2 h～5 h 时逐渐下降，可能是由于酶解时间过长而导致酶活性减弱，而使得多糖提取率降低。但酶解时间对多糖提取率影响不大，因此不将酶解时间作为交互因素。
2.3 响应面试验优化提取工艺
2.3.1 响应面试验设计与结果
响应面试验设计方案及结果见表2。
表2 响应面试验设计与结果
Table 2 Response surface design and test results
试验号 A pH 值B 酶添加量C 料液比D 酶解温度 多糖提取率/%1 -1 -1 0 0 9.12 2 0 0 0 0 11.54 3 0 -1 1 0 9.39 4 1 0 -1 0 9.96 5 0 1 1 0 10.14 6 0 -1 0 1 9.84 7 1 0 0 1 10.9 8 0 0 0 0 11.43 9 0 0 -1 -1 9.67 10 0 1 -1 0 9.35 11 0 1 0 1 10.03 12 0 -1 -1 0 9.29 13 -1 0 0 1 9.63 14 -1 1 0 0 9.47 15 0 1 0 -1 9.18 16 0 0 1 -1 9.94 17 -1 0 1 0 9.13 18 0 0 0 0 11.63 19 0 0 -1 1 10.14 20 0 -1 0 -1 9.32 21 1 -1 0 0 10.03 22 -1 0 -1 0 9.64 23 0 0 1 1 9.85 24 1 1 0 0 9.99 25 1 0 1 0 10.11 26 -1 0 0 -1 9.68 27 0 0 0 0 11.45 28 0 0. 0 0 11.65 29 1 0 0 -1 9.29
利用Design-Expert8 对表2 中的数据进行回归分析和多项式拟合，得到葛氏鲈塘鳢鱼头多糖提取率的最终方程：Y=11.54+0.30A+0.098B+0.043C+0.28D-0.097AB+0.16AC+0.17BC+0.083BD-0.14CD-0.86A2-1.09B2-0.91C2-0.80D2。
2.3.2 方差分析
将回归方程进行方差分析，结果见表3。
表3 方差分析
Table 3 Analysis of variance
注：**表示极显著（P＜0.01）。
?
由表3 可知，回归模型P＜0.000 1，表明上述模型极显著，拟合方程一次项A 和D 的P 值＜0.01，为极显著水平，表明pH 值和酶解温度对葛氏鲈塘鳢鱼头多糖提取率的影响比较大。交互项AD 的P 值＜0.01，为极显著水平，表明pH 值和酶解温度的交互作用对葛氏鲈塘鳢鱼头多糖提取率影响较大；二次项A2、B2、C2、D2 的P 值＜0.01，为极显著水平，表明pH 值、酶添加量、料液比和酶解温度的二次项对葛氏鲈塘鳢鱼头多糖提取率的影响比较大。失拟项P=0.052 1＞0.05，表明失拟项在统计意义上不显著，表明模型拟合度较好；决定系数R2=0.965 1，说明试验值与预测值的一致性良好，该模型可用于多糖提取率的分析和预测。
2.3.3 各因素交互作用与结果
各因素交互作用的响应面及等高线图见图7。
图7 直观的反映了pH 值、酶添加量、料液比和酶解温度之间的交互作用，曲面图越陡峭说明对葛氏鲈塘鳢鱼头提取率影响越大；而等高线反映了各因素交互作用的大小，椭圆表示交互作用显著[13]。结合方差分析结果可知，pH 值和酶解温度的交互作用显著。
图7 因素间相互作用对葛氏鲈塘鳢鱼头多糖提取效果影响的等高线图和响应面图
Fig.7 Contour plots and response surface plots showing the effects of factor interactions on the yield of polysaccharides from the head of Perccottus glenii
2.3.4 验证结果
通过响应面优化确定葛氏鲈塘鳢鱼头多糖的最佳提取条件为pH6.57、酶添加量2.53%、料液比1∶30.53（g/mL）、酶解温度37.33 ℃，在此条件下，多糖提取率的理论值为11.57%。为了便于试验操作，将提取参数调整为pH6.5、酶添加量2.5%、料液比1∶30（g/mL）、酶解温度37 ℃，3 次平行试验得到多糖提取率实际值为（11.43±0.31）%，与预测值接近，说明响应面法优化得到的葛氏鲈塘鳢鱼头多糖的最佳提取工艺是合理的。
2.4 多糖的抗氧化活性分析
2.4.1 羟自由基清除能力
羟自由基容易穿过细胞膜，打破机体内的平衡，导致细胞损伤甚至死亡，所以清除羟自由基对氧化损伤非常重要[14]。葛氏鲈塘鳢鱼头多糖和VC 对羟自由基的清除能力见图8。
图8 葛氏鲈塘鳢鱼头多糖和VC 对羟自由基的清除能力
Fig.8 Hydroxyl free radical scavenging rates of polysaccharides from the head of Perccottus glenii and VC
由图8 可知，葛氏鲈塘鳢鱼头多糖对羟自由基清除率随样品浓度的增加而增加，当浓度为8 mg/mL 时，葛氏鲈塘鳢鱼头多糖的羟自由基清除能力为81.2%。葛氏鲈塘鳢鱼头多糖对羟自由基的半抑制浓度（IC50）值为1.19 mg/mL。虽然葛氏鲈塘鳢鱼头多糖清除羟基自由基的IC50 值高于VC，但低于泥鳅多糖（IC50=2.8 mg/mL）[15]。
2.4.2 DPPH 自由基清除能力
DPPH 自由基是一种稳定的以氮为中心的自由基，且配成溶液后呈现紫色，当遇到能提供一个电子的自由基清除剂时，溶液颜色变浅，因此被广泛用于评价多糖的抗氧化能力[16]。葛氏鲈塘鳢鱼头多糖和VC对DPPH 自由基的清除能力见图9。
图9 葛氏鲈塘鳢鱼头多糖和VC 对DPPH 自由基的清除能力
Fig.9 DPPH free radical scavenging rates of polysaccharides from the head of Perccottus glenii and VC
由图9 可知葛氏鲈塘鳢鱼头多糖对DPPH 自由基清除能力随着多糖浓度的增加而增加，当浓度为8 mg/mL时，葛氏鲈塘鳢鱼头多糖的DPPH 自由基清除能力为80%。葛氏鲈塘鳢鱼头多糖对DPPH 自由基的半抑制浓度（IC50）值为1.43 mg/mL，虽然葛氏鲈塘鳢鱼头多糖清除DPPH 自由基的IC50 值高于VC，但低于蓝斑背肛海兔卵多糖（IC50=4.113 mg/mL）[17]。
2.5 红外光谱分析
红外吸收是由分子偶极矩的振动或电荷分布变化产生的，是分析多糖结构的有效手段，因此根据多糖的特征吸收峰，可以推断其组分可能的结构特征[18]。葛氏鲈塘鳢鱼头多糖红外光谱图见图10。
由图10 可知，葛氏鲈塘鳢鱼头多糖的红外吸收光谱显示出典型的碳水化合物特征，宽峰在3 000 cm-1～3 500 cm-1 处检测到，这来源于羟基（-OH）的伸缩振动，在2 937.87 cm-1 附近的弱峰代表C-H 伸缩振动[19]。1 632.35 cm-1 处检测出来的吸收峰显示为有糖醛酸的自由羧基中羟基的弯曲振动[20]。1 381.78 cm-1 附近的吸收峰主要是由C-H 官能团受C-H 变角振动引起的；1 133.60 cm-1 处的峰表明具有C-OH 侧基和吡喃糖环[21]，756.15 cm-1 处的峰为β-糖苷键构型的特征吸收峰[22]，因此可以推断葛氏鲈塘鳢鱼头多糖是一种含有β-糖苷键构型和吡喃环的酸性多糖。
图10 葛氏鲈塘鳢鱼头多糖红外光谱图
Fig.10 Fourier transform infrared spectroscopy spectrum of polysaccharides from the head of Perccottus glenii
3 结论
本研究以多糖提取率为评价指标，通过单因素和响应面试验优化得到酶解葛氏鲈塘鳢鱼头多糖的最佳工艺：pH6.5、酶添加量2.5%、料液比1∶30（g/mL）、酶解温度37 ℃、酶解时间2 h，此条件下葛氏鲈塘鳢鱼头多糖的提取率为11.43%。在羟自由基和DPPH 自由基清除试验中，当葛氏鲈塘鳢鱼头多糖浓度为10 mg/mL时，羟自由基和DPPH 自由基清除率分别为81.2%和80%。由红外光谱得到葛氏鲈塘鳢鱼头多糖是一种含有β-糖苷键构型和吡喃环的酸性多糖。本研究对葛氏鲈塘鳢鱼头多糖提取工艺条件的优化及抗氧化活性进行了探究，为水产品副产物多糖的进一步应用开发提供了技术支持和理论依据。
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