绿豆（Vigna radiate L.），也被称为青小豆，是中国传统的豆科植物[1]。与大豆相比，绿豆中除含有维持人体生命功能的三大营养素外，多糖、维生素和矿物质等生物活性大分子含量也非常丰富[2]。传统中医认为，绿豆具有“清热利尿、安神衡压”等功效[3]。单糖脱水、聚合通过糖苷键连接形成多糖[4]。多糖作为绿豆中重要的营养成分，受到人们多方面关注。多糖是天然的高分子有机物质，存在于所有生物体中，是维持生命体正常生命活动的不可或缺的活性大分子[5]。越来越多的研究表明，多糖在抗氧化、抗炎、抗癌等方面有显著效果[6-8]。多糖还凭借其较好的生物相容性、生物降解性和低异物反应性，被认为是递送小分子、生物活性成分和治疗细胞的理想材料[9]。
酶法是一种常见的提取多糖的方法，利用酶破坏植物细胞壁，使细胞内活性成分流出溶解，具有反应条件温和及减少化学试剂的使用等优点。超声辅助提取是利用超声过程中体系温度和压力的升高，使细胞破碎从而促进溶质分子扩散，提高溶解度，具有提取效率高、耗时短和减少溶剂浪费的优点。综上所述，本研究结合两种提取方法的优势，利用超声辅助复合酶法提取绿豆多糖。
近年来关于绿豆多糖功能特性的文献鲜有报道，为了充分开发绿豆中多糖资源，本研究以超声辅助复合酶法提取绿豆多糖，响应面法优化多糖提取工艺，并通过测定绿豆多糖的持水性、持油性、起泡性、乳化性和体外抗氧化活性评估其功能特性，旨在确定一种绿色高效的绿豆多糖提取方法，为未来绿豆多糖在食品保鲜等领域开发应用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
绿豆：市售；蒽酮、浓硫酸、氯仿、正丁醇、无水乙醇、过氧化氢（均为分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司；2，6-二叔丁基对甲酚（butylated hydroxy toluene，BHT，分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；石油醚、丙酮（均为分析纯）、淀粉酶（＞350 U/mg）、木瓜蛋白酶（＞3 500 U/mg）：上海麦克林生化科技股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、邻二氮菲、硫酸亚铁（均为分析纯）、超氧阴离子清除能力检测试剂盒：北京索莱宝科技有限公司。
1.2 仪器与设备
酶标仪（SPX-250B-Z）：美国伯腾仪器有限公司；旋涡混合器（WH-861）：太仓市科教器材厂；超声波清洗机（KQ2200）：昆山超声仪器有限公司；三孔电热恒温水槽（DK-8D）：上海一恒科学仪器有限公司；台式高速冷冻离心机（H2500R）：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。
1.3 方法
1.3.1 绿豆粗多糖的提取
绿豆研磨粉粹后，依次经无水乙醇、丙酮、石油醚浸泡洗涤，烘干24 h，过100 mm 筛。称取适量绿豆粉，添加蒸馏水振荡混匀，固定功率100 W 超声处理，置于恒温水浴锅中浸提，离心（10 000 r/min）20 min，除去滤渣，上清液中按照3 g/L 的比例添加复合酶（淀粉酶与木瓜蛋白酶质量比为3∶1），60 ℃静置一定时间充分酶解绿豆淀粉及绿豆蛋白。向上清液中添加同体积的Sevag 试剂（氯仿与正丁醇体积比为4∶1 混合）进一步除去绿豆蛋白和复合酶，振荡试剂瓶30 min，使上清液与Sevag 试剂充分混匀，10 000 r/min 离心10 min，除去中层变性蛋白质和下层有机试剂，重复上述操作至无蛋白质析出。无水乙醇沉淀多糖，2 ℃封口过夜后7 000 r/min 离心10 min，沉淀复溶于水中，在500 Da的透析袋中透析24 h，冻干得绿豆多糖，多糖得率按式（1）计算。
1.3.2 蒽酮-硫酸法测定多糖含量
采用蒽酮比色法[10]测定绿豆多糖中糖质量分数，配制0.1 mg/mL 葡萄糖标准溶液，分别移取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 标准溶液于试管中，补加去离子水至1.0 mL，混合均匀后再迅速加入5 mL 蒽酮-硫酸溶液，混匀，沸水浴煮沸10 min 使反应充分进行，待颜色稳定后取出试管，在波长620 nm 处测量吸光度。以标准葡萄糖溶液的不同质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线方程为Y=0.078+0.517x，R2=0.998 5。
1.3.3 单因素试验
称取3.0 g 绿豆粉末，按照料液比1∶20（g/mL）、水提温度95 ℃、水提时间180 min、超声时间20 min 为基础参数进行单因素试验，分析料液比、水提温度、水提时间和超声时间对绿豆多糖得率的影响。
1.3.4 响应面试验
依据单因素试验的结果，利用Box-Behnken 设计原理，以绿豆多糖得率为响应值，对料液比、水提温度、水提时间、超声时间4 个试验因素进行响应面分析试验。每组试验设置3 个平行。响应面试验因素及水平见表1。
表1 响应面试验因素及水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design
水平因素A 料液比/（g/mL）B 水提温度/℃D 超声时间/min-1 1∶15 20 0 1∶20 30 1 1∶25 40 C 水提时间/min 90 150 95 180 100 210
1.3.5 持水性和持油性测定
称取1.0 g 绿豆多糖于离心管中，分别加入水或玉米油10.0 mL 充分涡旋振荡混合均匀，封口静置1 h后，以2 500 r/min 离心15 min，记录管内液体体积变化，差值即为每克绿豆多糖的持水性和持油性[11]。
1.3.6 乳化性及乳化稳定性测定
称取200 mg 绿豆多糖充分溶于10.0 mL 去离子水中，加入5.0 mL 食用油，振荡均匀，以2 500 r/min 离心10 min 后，记下乳化层体积；将乳状液80 ℃水浴加热30 min 后，以2 500 r/min 离心10 min，记下加热后乳化层的体积。大豆卵磷脂是广泛应用于食品等领域的乳化剂，以大豆卵磷脂作为阳性对照[12]。分别按式（2）、式（3）计算乳化性及乳化稳定性。
式中：V1 为加热前乳化层体积，mL；V2 为加热后乳化层体积，mL。
1.3.7 起泡性及泡沫稳定性测定
将0.1 g/mL 的多糖溶液在打发器中高速搅拌3 min后，迅速将溶液及泡沫都转入100 mL 量筒中，立即记下泡沫所占体积，30 min 后记录泡沫保留体积，以蛋清作为对照样品[13]。分别按照式（4）、式（5）计算起泡性及泡沫稳定性。
式中：V0为泡沫初体积，mL；Vx 为泡沫保留体积，mL。
1.3.8 DPPH·清除能力测定
根据文献[14]的方法稍作修改测定绿豆多糖的DPPH·清除能力。取25 μL 质量浓度为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL 的绿豆多糖溶液，依次加入975 μL 0.1mmol/L DPPH 溶液，混匀，黑暗条件下静置1 h，515 nm 处测定吸光度。选定维生素C 和BHT 作为对照样本。按式（6）计算DPPH 自由基清除率。
式中：A0 为无水乙醇的吸光度；A1 为样品和DPPH溶液的吸光度；A2 为DPPH 溶液的吸光度。
1.3.9 ·OH 清除能力测定
根据文献[15]的方法稍作修改测定绿豆多糖的·OH 清除能力。取0.15 mL 质量浓度为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL 的绿豆多糖溶液，加入0.3 mL 硫酸亚铁溶液、0.3 mL 过氧化氢溶液、0.3 mL 水杨酸溶液（3 种溶液浓度均为10 mmol/L），37 ℃混匀反应1 h，测量不同反应溶液在536 nm 处的吸光度。按式（7）计算·OH清除率。
式中：A0 为蒸馏水的吸光度；A1 为样品和过氧化氢反应体系的吸光度；A2 为过氧化氢反应体系的吸光度。
1.3.10 O2-·清除能力测定
O2-·清除能力按照试剂盒测定方法进行测定。取0.1 mL 质量浓度为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL 的绿豆多糖溶液，依次加入0.25 mL 0.1mol/L Tris-HCl 缓冲溶液（pH8.8）、0.2 mL 0.05 mol/L 邻苯三酚溶液，振荡混匀，测量不同反应溶液在415 nm 处的吸光度。按式（8）计算超氧阴离子自由基清除率。
式中：A0 为空白管吸光度；A1 为测定管吸光度。
1.4 数据处理
试验数据取3 次平行试验结果的平均值，采用Design Expert8.0.6 软件处理数据、Origin 2018 软件作图。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 料液比对多糖得率的影响
料液比对绿豆多糖得率的影响见图1。
图1 料液比对绿豆多糖得率的影响
Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of polysaccharides from mung bean
由图1 可知，随着溶剂量增大，多糖得率先升高后降低。当料液比为1∶20（g/mL）时，多糖得率最高，为5.17%。当溶剂量过小时，体系过于黏稠造成绿豆多糖还未浸提到溶液中，绿豆淀粉已在高温下发生糊化，部分绿豆多糖仍在细胞内。但溶剂量过大时，绿豆多糖在体系中浓度减小，同时造成后续试验无水乙醇用量增加，绿豆多糖在相同浓度乙醇中更难被沉淀出来[16]。因此，选择料液比1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）进行后续试验。
2.1.2 水提温度对多糖得率的影响
水提温度对绿豆多糖得率的影响见图2。
图2 水提温度对绿豆多糖得率的影响
Fig.2 Effect of extracting temperature on the yield of polysaccharides from mung bean
由图2 可知，随着水提温度的不断提高，多糖得率先升高后降低。水提温度在95 ℃时，绿豆多糖得率最高，为5.39%。温度的升高使更多的多糖从细胞中溶出到体系中，当温度高于95 ℃时，体系温度迅速升高造成绿豆淀粉糊化加快，绿豆粉与水的接触面积减小，部分绿豆多糖未溶出到体系内，也有可能是因为温度过高造成糖蛋白分解变性，从而导致绿豆粗多糖得率下降[17]。因此，选择水提温度90、95、100 ℃进行后续试验。
2.1.3 水提时间对多糖得率的影响
水提时间对绿豆多糖得率的影响见图3。
图3 水提时间对绿豆多糖得率的影响
Fig.3 Effect of extracting time on the yield of polysaccharides from mung bean
由图3 可知，随着水提时间的不断延长，多糖得率先升高后降低。水提时间为180 min 时，多糖得率最高，为5.23%。水提时间较短，细胞未充分吸水胀破，多糖浸提效率不高。浸提时间过长，多糖及部分糖蛋白在长时间的高温浸提中会水解，导致多糖得率有所下降。因此，选择水提时间150、180、210 min 进行后续试验。
2.1.4 超声时间对多糖得率的影响
超声时间对绿豆多糖得率的影响见图4。
图4 超声时间对绿豆多糖得率的影响
Fig.4 Effect of ultrasound time on the yield of polysaccharide from mung bean
由图4 可知，随着超声时间的不断延长，多糖得率先升高后降低。超声时间为30 min 时，绿豆多糖得率最高，为5.33%。超声时间过短，植物细胞超声破碎不完全，多糖未能充分从细胞溶出到体系溶液中。当超声时间超过30 min 时，多糖及部分糖蛋白在长时间的超声作用下多糖主、支链部分官能团或基团的结构组织被破坏，导致绿豆多糖得率呈现下降态势[18]。因此，选择超声时间20、30、40 min 进行后续试验。
2.2 响应面试验
利用Design Expert8.0.6 软件共设计29 组试验，结果见表2，此模型回归方程的方差分析见表3。
表2 Box-Benhnken 试验设计及结果
Table 2 Design and results of Box-Benhnken test
序号 A B C D 多糖得率/%1 0 -1 -1 0 3.82 2 0 0 0 0 5.44 3 0 1 0 -1 4.25 4 1 0 0 -1 4.26 5 1 -1 0 0 4.92 6 0 0 0 0 5.93 7 -1 0 -1 0 3.84 8 -1 0 1 0 4.11 9 1 0 0 1 5.35 10 -1 0 0 -1 4.28 11 0 1 0 1 4.12 12 0 1 1 0 4.22 13 0 0 -1 -1 3.99 14 1 1 0 1 4.81 15 0 -1 1 0 5.03 16 0 0 -1 1 4.21 17 -1 0 0 1 3.77 18 0 0 1 -1 4.61 19 0 0 0 0 5.90 20 -1 -1 0 0 4.04 21 1 0 -1 0 4.48
表3 方差分析
Table 3 Variance analysis
注：*表示影响显著，P＜0.05；**表示影响极显著，P＜0.01。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型 11.66 14 0.83 28.49 ＜0.000 1 **A 料液比 1.61 1 1.61 55.18 ＜0.000 1 **B 水提温度 0.074 1 0.074 2.52 0.134 8 C 水提时间 0.82 1 0.82 27.92 0.000 1 **D 超声时间 0.17 1 0.17 5.67 0.032 0 *AB 0.027 1 0.027 0.93 0.350 9 AC 0.004 225 1 0.004 225 0.14 0.709 6 AD 0.64 1 0.64 21.89 0.000 4 *BC 0.23 1 0.23 7.88 0.014 0 *BD 0.20 1 0.20 6.77 0.020 9 *CD 0.014 1 0.014 0.49 0.494 3 A2 2.30 1 2.30 78.83 ＜0.000 1 **B2 3.14 1 3.14 107.49 ＜0.000 1 **C2 3.67 1 3.67 125.57 ＜0.000 1 **D2 3.15 1 3.15 107.88 ＜0.000 1 **残差 0.41 14 0.029失拟项 0.25 10 0.025 0.64 0.742 2净误差 0.16 4 0.039总和 12.07 28
续表2 Box-Benhnken 试验设计及结果
Continue table 2 Design and results of Box-Benhnken test
序号 A B C D 多糖得率/%22 0 0 0 0 5.70 23 0 1 -1 0 3.97 24 0 -1 0 1 4.76 25 0 0 1 1 4.59 26 1 0 1 0 4.88 27 0 0 0 0 5.67 28 -1 1 0 0 4.26 29 0 -1 0 -1 4.00
通过模型拟合得到二次多项回归方程：Y=5.73+0.37A-0.078B+0.26C+0.12D-0.083AB+0.032AC+0.40AD-0.24BC-0.22BD-0.060CD-0.60A2-0.70B2-0.75C2-0.70D2。此回归模型方程中，二次项系数均为负，所以方程存在最大值。
表3 结果显示，此回归模型P＜0.000 1，极显著。并且该模型的决定系数R2=0.966 1，这代表该模型与实际试验拟合程度非常高，可解释96.61%的试验结果。此试验设计模型可以用于超声辅助复合酶法提取绿豆多糖的工艺优化的理论预测。另外根据F 值，得到各因素对绿豆多糖得率影响大小的顺序为料液比＞水提时间＞超声时间＞水提温度。
运用软件Design Expert8.0.6 分析各项数据，得出最佳工艺条件：超声时间32.13min、料液比1∶21.97（g/mL）、水提温度94.26 ℃、水提时间185.92 min，预测该条件下绿豆多糖得率为5.84%。为了在实际提取操作中更加便捷，将上述工艺条件调整为水提温度95 ℃、水提时间186 min、超声时间32 min、料液比1∶22（g/mL）、固定超声功率100 W。
通过验证试验，得到绿豆粗多糖实际得率平均值为5.77%，与预测值的5.84%相差仅为0.07%。证明采用该多元二次回归模型对绿豆多糖的提取工艺参数进行优化是成功的，得到的工艺参数是可靠的。
2.3 功能特性测定结果
2.3.1 加工特性
绿豆多糖加工特性结果如表4 所示。
表4 绿豆多糖加工特性结果
Table 4 Functional properties of mung bean polysaccharides
持水性/（mL/g）持油性/（mL/g）乳化性/%起泡性/%乳化稳定性/%泡沫稳定性/%2.89 3.07 14.69 34.32 47.36 24.16
试验测得大豆卵磷脂（乳化剂）的乳化性、乳化稳定性分别为95.65%、92.73%，蛋清（发泡剂）的起泡性、泡沫稳定性分别为47.62%、36.64%。由表4 可知，绿豆多糖具有一定的乳化性能和起泡性能。
2.3.2 DPPH·清除能力测定结果
绿豆多糖、VC、BHT 对DPPH·清除能力测定结果见图5。
图5 绿豆多糖、VC、BHT 的DPPH·清除能力
Fig.5 DPPH·scavenging ability of mung bean polysaccharides，VC and BHT
如图5 所示，随着绿豆多糖质量浓度增加，绿豆多糖对DPPH·清除率不断提高，在质量浓度为5.0 mg/mL时，绿豆多糖对DPPH·清除率达到最高，为78.41%。绿豆多糖对清除DPPH·的半抑制质量浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值为2.96 mg/mL。绿豆多糖中高含量的糖醛酸可能是使其具有清除自由基能力的基础[19]。绿豆多糖中含有大量的葡萄糖单糖也可能是其高生物活性的原因之一。多糖的抗氧化机制与糖醛酸的存在以及未甲基化羧基的数量也可能有关[20]。本试验结果说明绿豆多糖对DPPH·有较好的清除能力。
2.3.3 ·OH 清除能力测定结果
绿豆多糖、VC、BHT 对·OH 清除能力测定结果见图6。
图6 绿豆多糖、VC、BHT 的·OH 清除率
Fig.6 ·OH scavenging capacity of mung bean polysaccharides，VC and BHT
如图6 所示，随着绿豆多糖质量浓度增加，绿豆多糖对·OH 清除率不断提高，在质量浓度为5.0 mg/mL时，绿豆多糖对·OH 清除率最高，为88.32%。绿豆多糖对清除·OH 能力的IC50 值为2.08 mg/mL。多糖在清除·OH 时，不仅是需要多糖中的还原基团提供电子，还需要各还原基团中的还原氢与羟基自由基反应结合生成水才能够彻底消失。VC 和BHT 较多糖具有更强的还原性，其不仅可以直接提供自身强电子和还原氢，还可以直接与过氧化氢反应从而减少自由基的生成。本试验结果说明绿豆多糖对·OH 具有较好的清除能力。
2.3.4 O2-·清除能力测定结果
绿豆多糖、VC、BHT 对O2-·清除能力测定结果见图7。
如图7 所示，随着绿豆多糖质量浓度增加，绿豆多糖对O2-·清除率不断提高，在质量浓度为5.0 mg/mL时，绿豆多糖对O2-·的清除率达到最高，为52.66%。绿豆多糖对O2-·清除能力的IC50 值为4.83 mg/mL。多糖对O2-·的清除能力与多糖中可作为电子供体或氢供体的官能团数量有关[21]，绿豆多糖有复杂的空间结构，部分还原性基团和羟基在空间内部无法与O2-·发生反应，而O2-·也无法进入多糖空间中，造成体系中的O2-·没有完全除去[22]。本试验结果说明绿豆多糖对O2-·具有较好的清除能力。
图7 绿豆多糖、VC、BHT 的O2-·清除率
Fig.7 O2-·scavenging ability of mung bean polysaccharides，VC and BHT
3 结论
本研究采用超声辅助复合酶法提取绿豆多糖，在单因素试验基础上，结合响应面法优化分析，得到最佳绿豆多糖提取工艺为料液比1∶22（g/mL）、水提温度95 ℃、水提时间186 min 和超声时间32 min，此时绿豆多糖得率为5.77%与预测值相差较小。各因素对绿豆多糖得率影响大小的顺序为料液比＞水提时间＞超声时间＞水提温度。绿豆多糖功能特性测定结果显示，绿豆多糖持水性2.89 mL/g、持油性3.07 mL/g、乳化性14.69%、乳化稳定性47.36%、起泡性34.32%、泡沫稳定性24.16%，绿豆多糖对各自由基清除效果呈现剂量依赖性，绿豆多糖对DPPH·、·OH 和O2·-清除率最高为78.41%、88.32%和52.66%。本试验提取工艺简单，成本较低且有较高的多糖得率，同时绿豆多糖展现出较强功能特性和自由基清除活性。
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