小麦是人类消费的主要谷物之一[1]，小麦麸皮是小麦加工过程中的主要副产品，亦是膳食纤维（dietary fiber，DF）的天然来源。然而在现代全谷物加工过程中，麦麸通常会被丢弃，利用率很低，造成资源浪费和环境污染，因此值得进一步探索研究麦麸的综合利用价值，提高麦麸产品的附加值，以减少谷物生产的生态足迹，促进谷物生产链的循环[2]。DF 被认为是对人类健康有价值的营养素，在人体小肠中很难被消化和吸收，但在大肠中可以被完全或部分发酵。一般按水溶性分为可溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）和不溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber，IDF）两类，前者包括β-葡聚糖、难消化低聚糖、菊糖、果胶等，而后者包括纤维素、一些半纤维素和木质素。据报道[3]，DF 可以在人体内发挥有益的生理作用，包括降低正常受试者餐后血糖的升高，通过被肠道微生物利用发酵产生短链脂肪酸，调节肠道功能，预防便秘，降低患结肠癌、心血管疾病和II型糖尿病的风险等等。DF 结构的修饰包括物理、化学和生物3 种类型技术，以提高DF 产率或改善其物理化学性质。研究表明[4]，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）有产半纤维素酶的能力，通过发酵可产生高活性的葡甘聚糖酶，将多糖降解为低聚糖。之前有研究表明[5]，其芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）分泌的β-D-葡聚糖内水解酶已被用于谷物中β-D-葡聚糖的定量分析，该酶将葡聚糖降解为一系列低聚葡萄糖。因此，本研究首次使用解淀粉芽孢杆菌辅助酶解法来修饰麦麸中的DF，研究葡甘聚糖酶处理前后SDF 的结构功能性质变化及其对小麦粉流变学特性的影响，为小麦麸皮的利用提供一种新的途径。
1 材料和方法
1.1 试剂与培养基
1.1.1 主要试剂
解淀粉芽孢杆菌：天津科技大学粮油科学方向微生物实验室保存；小麦麸皮：山东德州农家院；小麦面粉（11.5%蛋白质、1.2%脂肪、73%碳水化合物）：甘肃麦上客食品有限公司；α-淀粉酶（500 KNU/g）、淀粉糖苷酶（10 万U/g）：上海阿拉丁生化科技有限公司；木瓜蛋白酶（50 万U/g）、葡萄糖标准品（色谱级）、二甲基亚砜、2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇（分析纯）：天津江天化工有限公司。
1.1.2 培养基配制
固体培养基：蛋白胨2 g，NaCl 1 g，牛肉膏提取物6 g，琼脂4 g，溶解于200 mL 蒸馏水中，调节pH7.2～7.4。
种子培养基：无水葡萄糖1 g、麦芽汁提取物0.3 g、酵母提取物0.3 g、胰蛋白胨0.5 g，溶于100 mL蒸馏水中。
发酵培养基：葡萄糖4 g，（NH4）2SO4 0.08 g，MgSO4 0.01 g，酵母提取物0.9 g，K2HSO4 0.2 g，溶于100 mL 蒸馏水中，调节pH 值至7.0，将培养基装于250 mL 锥形瓶中，在121 ℃灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
TSK 凝胶柱（G4000PWXL）：日本东曹株式会社；智能生化培养箱（SPX-250）：宁波海曙赛福实验仪器厂；酶标仪（Epoch2）：美国BioTek 仪器有限公司；台式高速冷冻离心机（LGR20-W）：上海珂淮仪器有限公司；动态流变仪（HAKKE MARS 60）：德国赛默飞世尔科枝公司；X-射线衍射仪（DMAX2500）：日本理学株式会社；扫描电子显微镜（JSM-6300）：日本JEOL 公司。
1.3 方法
1.3.1 解淀粉芽孢杆菌培养和麦麸前处理
解淀粉芽孢杆菌在固体培养基中活化，37 ℃下培养24 h。在种子培养基中进行扩大培养，在30 ℃下200 r/min 培养24 h。然后，将10%的细菌悬浮液（约107 CFU/mL）添加到发酵培养基中，并以200 r/min，30 ℃下培养80 h。将发酵液在4 ℃下10 000 r/min 离心25 min 即获得葡甘聚糖酶液，通过3，5-二硝基水杨酸比色法测定酶活性为119.2 U/g。将葡甘聚糖酶液[1∶1.2（g/mL）]在50 ℃、pH7.0 的最佳酶活力条件下[4]分别经液态酶解（10%悬浮液）和固态酶解对麦麸进行改性处理，对照组用蒸馏水代替酶液。将处理后的麦麸在45 ℃烘箱内烘干，并过60 目筛。
1.3.2 可溶性膳食纤维的提取
DF 的提取方法是以美国谷物化学师协会方法为基础并进行了少量修改。将麦麸以1∶20（g/mL）溶解于提前配好的磷酸盐缓冲液中，用NaOH 溶液调节pH值至6.0±0.2。称取1.0 g 麦麸样品（精确至0.1 mg），先运行一个空白样以消除误差。将样品放置于水浴磁力搅拌器中，加入转子使样品充分分散于溶液体系中，依次加入α-淀粉酶（0.1 mL/g）、木瓜蛋白酶（5 mg/g）分别在75 ℃下反应35 min、60 ℃下反应30 min，待反应结束后冷却至室温，用HCl 溶液调节pH 值至4.0～4.6，最后加入淀粉葡萄糖苷酶（0.3 mL/g）在60 ℃下反应30 min，连续孵育水解后去除淀粉和蛋白质[6]。反应结束后将样品在4 800 r/min 离心10 min，在上清液中加入95%乙醇（1∶4，体积比），4 ℃醇沉过夜。最后，4 000 r/min，15 min 离心去掉上清溶液，沉淀置于通风橱中，乙醇充分挥发后真空冷冻干燥，即得到SDF[7-8]。经解淀粉芽孢杆菌发酵液酶解麦麸后提取的SDF 为Y-SDF，未经解淀粉芽孢杆菌发酵液酶解麦麸提取的SDF 为K-SDF。GY 表示由固态酶解提取的Y-SDF；GK 即固态酶解提取K-SDF；LY 即液体酶解提取YSDF；LK 即液体酶解提取K-SDF。根据下式计算SDF的提取率。
SDF 提取率/%=W/Wb×100
式中：W 是SDF 的质量，g，Wb 是麦麸的质量，g。
1.3.3 SDF 结构特征的测定
1.3.3.1 分子量测定
K-SDF 和Y-SDF 的分子量分布采用凝胶渗透色谱法（gel permeation chromatography，GPC）测定[9]。SDF（2 mg/mL）溶解在流动相（超纯水）中，0.22 μm 微孔膜过滤，注入TSK 凝胶柱，使用一系列葡聚糖标准品（T-2000、T-500、T-70、T-40、T-10）获得标准曲线。
1.3.3.2 扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）观察
使用SEM 观察SDF 的形态特性。将双面胶带贴在圆形铝管上，在双面胶带上均匀涂抹少量K-SDF 和Y-SDF 粉末，并使用溅射涂敷器喷涂薄金。在40 kV电压下，放大3 000 倍获得K-SDF 和Y-SDF 的显微形态照片。
1.3.3.3 核磁共振分析（nuclear magnetic resonance spectroscopy，1H-NMR）
将冻干样品（20 mg）溶解在二甲基亚砜（0.5 mL）中，并在分析之前转移到核磁管中。使用400 MHz NMR 光谱仪在25 ℃下进行16 次扫描，获得1H-NMR光谱。
1.3.3.4 傅里叶变换红外光谱（Fourier transforminfrared spectroscopy，FT-IR）
使用FT-IR 光谱仪测量样品之间的分子结构差异。将冻干样品（1 mg）和KBr（150 mg）混合并研磨成片剂，设置分辨率为4 cm-1，在4 000 cm-1～400 cm-1 处扫描16 次。
1.3.3.5 X 射线衍射（X-ray diffraction，XRD）
在40 kV 和120 mA 的工作电压和电流下，使用X射线衍射仪获得样品的XRD 图谱。使用Cu-Kα 辐射源，衍射角2θ 扫描范围为5°～45°，结合2°/min 的扫描速度和0.02°的扫描步长进行测定[10]。
1.3.3.6 热重分析（thermogravimetric analysis，TGA）
使用热重分析仪研究样品的热性能。称量SDF 样品（5 mg）置于小坩埚中。加热程序以25 ℃/min 的速率在30 ℃～600 ℃进行，使用氮气作为保护气体。记录样品的导数热重分析（derivative thermogravimetry，DTG）和TGA 曲线。
1.3.3.7 黏度特性
将SDF 样品（40 mg/mL）溶解于蒸馏水中，搅拌30 min 以完全水合。K-SDF 和Y-SDF 的黏度由动态流变仪测定，使用直径为35 mm 的不锈钢平行板，间隙尺寸设置为0.5 mm，在25℃下，0～100 s-1 的剪切速率范围内测量Y-SDF 和K-SDF 的表观黏度与剪切应力的关系。
1.3.4 SDF 理化功能性质的测定
1.3.4.1 持水性测定
持水力（water-holding capacity，WHC）的测定参考文献[11]，并略有修改。在室温（25 ℃）下，将SDF（0.1 g）溶解在蒸馏水中（5 mL）平衡24 h。然后以4 800 r/min离心混合物10 min。收集沉淀并称重。WHC 的计算如下。
WHC/（g/g）=（m1-m）/m
式中：m1 为离心后收集的沉淀质量，g；m 为SDF干重，g。
1.3.4.2 抗氧化能力的测定
取0.1 g SDF 溶于5 mL 蒸馏水中制备样品溶液。以还原力、DPPH 自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力和·OH 自由基清除能力来评价SDF 的体外抗氧化能力，自由基清除能力测定方法参考文献[12-14]。
1.3.5 SDF 对小麦面粉流变学特性的影响
分别将K-SDF、Y-SDF 样品粉末（2%）和过筛麦麸（12%）添加到小麦粉中，以分析混合面粉流变学特性的变化。
1.3.5.1 快速黏度分析仪（rapid viscosity analyser，RVA）分析
使用RVA 测试面粉混合物的糊化特性。将3 g 面粉混合物（水分含量12%）与蒸馏水（25 mL）混合成浆，按如下程序加热：50 ℃下保持1.3 min，以12 ℃/min的速率升高至95 ℃，保持3 min，以-12 ℃/min 的速率冷却至50 ℃，保持2 min。记录以下参数：峰值黏度（peak viscosity，PV）、低谷黏度（through viscosity，TV）、最终黏度（final viscosity，FV）、回生值（setback，SB）[15]。收集RVA 试验形成的混合物，冷却至室温并用于进一步的流变特性分析。
1.3.5.2 动态频率扫描
使用动态流变仪测定1.3.5.1 中采集样品的黏弹性。试验温度设置为25 ℃，将样品加载到直径为35 mm的锥形板上10 次，设置间隙为1.00 mm，应变为1%，并在0.1 Hz～10 Hz 的频率范围内扫描，记录弹性模量（G′）、损耗模量（G″）和损耗因数tanδ（G′/G″）。
1.3.5.3 触变性
使用动态流变仪测定1.3.5.1 中采集样品的触变性。测量温度设定为25 ℃，剪切速率在6 min 内从0 s-1 变化到300 s-1，然后在6 min 内从300 s-1 降低到0 s-1。使用Herschel-Bulkley 模型拟合流变曲线（拟合包括向上行线和下行线）。相关系数R2 表示方程的拟合精度。方程描述如下。
式中：τ 为剪切应力，Pa；τ0 为屈服应力，Pa；k 为稠度系数，Pa·s；γ 为剪切速率s-1；n 为流体指数。
1.4 数据处理与分析
试验结果以3 次测定的平均值±标准差表示，显著性分析采用单因素方差分析（ANOVA），p＜0.05 被认为具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 SDF 提取率及改性条件优化
不同酶解法和反应时间对SDF 提取率的影响见图1。
图1 不同酶解法和反应时间对SDF 提取率的影响
Fig.1 Effect of the enzymolysis methodology and duration on SDF yield
A.不同酶解法；B.不同反应时间。字母不同表示具有显著性差异（p＜0.05）。
如图1A 所示，以SDF 的提取率作为评价指标，固态酶解（15.2%～20.4%）比液态酶解（13.5%～15.5%）更有效，这可能是因为液态酶解产生的SDF 分子量太低，导致水溶性物质的部分损失。固态酶解使SDF 的溶解度显著增加了34.2%，提取率的变化可能归因于部分IDF 的溶解和解聚[16]。如图1B 可知，SDF 的产量随着酶解反应时间的延长而增加，在4 h 时达到峰值，然后随着反应时间的延长SDF 产量有所下降，因此，固体酶解4 h 是制备SDF 的最佳条件。
2.2 结构性质表征
2.2.1 分子量分布
SDF 的分子量分布见表1。K-SDF 和Y-SDF 的凝胶渗透色谱图见图2。
图2 K-SDF 和Y-SDF 的凝胶渗透色谱图
Fig.2 GPC spectra of K-SDF and Y-SDF
表1 SDF 的分子量分布
Table 1 Molecular weight distribution（Mw）of SDF
样品名称 峰序号 保留时间/min 分子量/（g/mol） 峰面积比/%K-SDF 1 8.87 3.8×106 68.55 2 11.36 4.7×105 28.88 3 12.63 1.6×105 2.57 Y-SDF 1 8.80 4.0×106 21.22 2 9.15 3.0×106 7.05 3 11.18 5.5×105 11.14 4 11.58 3.9×105 1.97 5 19.08 0.7×103 49.32
采用GPC 分析SDF 的分子量差异，通过标准曲线计算[logMw=9.795 5+（-0.362 7）×Tr，R2=0.997 8，Tr为相对的保留时间]平均分子量。如表1 所示，酶解过程降低了SDF 的分子量。与K-SDF 相比，Y-SDF 在保留时间为19.08 min 时出现了更窄、更尖锐的主峰（图2），可能产生了低聚糖。
2.2.2 SEM 分析
K-SDF 和Y-SDF 的电镜图见图3。
图3 K-SDF 和Y-SDF 的电镜图（3 000×）
Fig.3 SEM images of K-SDF and Y-SDF（3 000×）
由图3 可以看出，K-SDF 和Y-SDF 的微观形态有显著差异。与K-SDF 相比，通过葡甘聚糖酶的酶解，Y-SDF 分叉更细、分支度更高。这种结构的改变增加了Y-SDF 的比表面积，提高了其吸附性能。因此，推测Y-SDF 具有更高的水合性能和抗氧化活力等功能特性。
2.2.3 1H-NMR 分析
SDF 的核磁共振氢谱见图4。
图4 SDF 的核磁共振氢谱
Fig.4 1H-NMR spectrum of SDF
SDF 的化学位移主要集中在3.0 ppm～5.0 ppm。2.5、3.0～4.5、4.0～5.0 ppm 和5.0～5.6 ppm 处的峰值分别代表二甲基亚砜、糖残基H2-H6 位置的重叠信号、β构型和α 构型，结果表明，K-SDF 和Y-SDF 均含有β-糖苷构型，而非α-糖苷构型。残留物中信号的峰值面积与共振核的数量呈正比[17-18]。曲线积分表明，Y-SDF的峰面积小于K-SDF，这说明Y-SDF 中的糖残基含量较低，显示了酶降解的效果。
2.2.4 FT-IR 和XRD 分析
K-SDF 和Y-SDF 分子的红外光谱图见图5，KSDF 和Y-SDF 分子的晶体衍射图见图6。
图5 K-SDF 和Y-SDF 分子的红外光谱图
Fig.5 FT-IR spectra of K-SDF and Y-SDF molecules
图6 K-SDF 和Y-SDF 分子的晶体衍射图
Fig.6 XRD pattern of K-SDF and Y-SDF molecules
3 415、2 939 cm-1 和1 650 cm-l 处的峰值分别指羟基的拉伸振动、C—H 拉伸振动和
拉伸振动[19]。1 000 cm-1～1 200 cm-1 的峰值被指定为糖苷键的C—O—C 拉伸和C—OH 弯曲，表明存在吡喃环结构。图5显示K-SDF 在881 cm-1 处有一个明显的峰值，这被认为是β-糖苷键的特征。然而，该峰值在Y-SDF 中几乎消失，表明半纤维素降解[20]，这与1H-NMR 谱结果一致。此外，图6 显示K-SDF 和Y-SDF 的XRD 光谱相似，表明酶解作用对SDF 的晶体结构影响不大。在约22°处观察到清晰的衍射强度峰，表明K-SDF 和Y-SDF 主要为无定型结构或纤维素晶体的物质。
2.2.5 热重分析
SDF 的热重分析图见图7。
图7 SDF 的热重分析图
Fig.7 Thermogravimetric analysis graph of SDF
a.DTG；b.TGA 曲线。
TGA 曲线中K-SDF 有3 个热吸收峰，而Y-SDF中有4 个热吸收峰，额外的峰值被认为是Y-SDF 中低聚糖分子的熔化[21]。从TGA 曲线来看，K-SDF 和Y-SDF之间的最终质量损失没有显著差异（图7b）。约120 ℃时的初始失重归因于SDF 内部的水分蒸发，最大失重发生在250 ℃时，对应于多糖热分解相关的复杂过程。酶解作用导致多糖降解生成新物质，这与2.2.1 中Mw降低的结果一致。
2.2.6 黏度分析
酶解作用对SDF 溶液黏度的影响见图8。
由图8 可知，SDF 溶液（4%）的黏度随着剪切速率的增加而降低，表明剪切变稀的假塑性流体行为。与K-SDF 相比，通过葡甘聚糖酶的酶解后Y-SDF 的初始黏度更低，这可能归因于分子链的排列，因为碳水化合物溶液的黏度与其相应的聚合物分子量呈正相关。
图8 酶解作用对SDF 溶液黏度的影响
Fig.8 The effect of enzymolysis in viscosity of SDF
2.3 功能特性分析
2.3.1 持水能力
SDF 的持水力见图9。
图9 SDF 的持水力
Fig.9 WHC characteristics of SDF
字母不同表示具有显著性差异（p＜0.05）。
WHC 是指施加外力（例如离心）后已知质量的水胶体保留的水量。如图9 所示，葡甘聚糖酶的酶解使SDF 的WHC 显著增加36.5%。根据结构分析，持水能力的增强可能是由于Y-SDF 的比表面积和亲水基团增加，从而扩大了SDF 与水的接触面积，更容易与水结合。
2.3.2 抗氧化能力
SDF 的抗氧化活性见图10。
图10 SDF 的抗氧化活性
Fig.10 The effect of enzymolysis for antioxidant capacity of SDF
字母不同表示具有显著性差异，p＜0.05。
在相同浓度下，Y-SDF 的ABTS+·、DPPH·、·OH清除能力和还原能力有不同程度的升高，说明酶解后抗氧化能力增加。其中，DPPH·水平、·OH 水平和还原能力显著提高，分别提高了16.21%、9.98%、37.58%。ABTS+·清除活性略有升高（3.93%）。综合来看，Y-SDF比K-SDF 表现出更好的抗氧化活性，说明葡甘聚糖酶的酶解处理可以提高SDF 的抗氧化活力。Mw 被广泛认为是影响抗氧化活性的主要因素。低分子量的物质由于具有更多的还原性羟基和更大的比表面积，能够更好地结合自由基。之前的研究证明多糖的抗氧化活性与分子量密切相关，并且报道了低分子量的多糖具备更高的抗氧化活性。推测，Y-SDF 较高的抗氧化能力是由于酶解诱导了较低分子量物质的产生。此外，官能团的暴露、黏度的降低、水溶性的改善也可能是提高抗氧化活性的原因[22]。
2.4 流变特性分析
2.4.1 糊化特性
添加SDF 和麸皮后小麦粉黏度特性的变化见图11。
图11 添加SDF 和麸皮后小麦粉黏度特性的变化
Fig.11 Changes in viscosity characteristics of the wheat flour following the addition of SDF and wheat brans
CK.小麦粉；K-wb.小麦粉+12%空白麦麸；Y-wb.小麦粉+12%酶处理麦麸；K.小麦粉+2%K-SDF；Y.小麦粉+2%Y-SDF。
由图11 可知，与单一小麦粉（CK）相比，添加麦麸和SDF 后，混合物的峰值黏度、最终黏度和回生值发生不同程度的降低。其中添加K-SDF 和Y-SDF 后，混合物的峰值黏度急剧下降，这表明淀粉分子在溶液中的溶胀和浸出减少了，这是由于SDF 通过水分子的竞争抑制了淀粉颗粒的膨胀与糊化。另外，由于Y-SDF分子量较低，更容易进入淀粉分子内部，干扰淀粉分子形成双螺旋结构或结晶。此外，混合体系中较低的回生值可能表示SDF 的加入还会影响淀粉分子在冷却期间的回生。
2.4.2 动态和静态流变特性
添加SDF 和麦麸后小麦粉的动态流变特性的变化见图12。静态流变试验拟合参数见表2。
图12 添加SDF 和麦麸后小麦粉的动态流变特性的变化
Fig.12 Changes in the dynamic rheological properties of the wheat flour following the addition of the SDF and wheat bran
a.储能模量；b.损耗模量；c.损耗因子；d.静态流变。
由图12 可知，动态储能模量（G′描述了弹性，而损耗模量（G″）描述了混合物的黏性响应。在所有混合物中，G'和G″均随频率的增加而增加，其中K 和Y 明显低于CK，表明SDF 的加入抑制了连续网络结构的形成。更重要的是，tanδ 值较高的混合物表现出类似液体的性质。如静态流变试验（图12d）所示，剪切应力和剪切速率之间存在正相关性。用Herschel-Bulkley 模型拟合曲线（表2），流动性指数（n）小于1.0，表明所有混合物均为假塑性，在糊化过程中具有剪切变稀流动性。所有混合物都是触变性的，与CK 相比，K、Y 的触变环形状与面积显著变化，可以看出，添加SDF 导致破坏结构的能量减少[23]。引入SDF 提高了体系的剪切恢复率，抑制了连续凝胶网络结构的形成，其中，YSDF 的影响力更强。
表2 静态流变试验拟合参数
Table 2 Fitting parameters for static rheological test
注：↑表示上升；↓表示下降。
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3 结论
本研究采用葡甘聚糖酶固态酶解麦麸，可显著提高SDF 产量，这可能是由于IDF 的部分降解。同时，还发现所得SDF 表现出更大的抗氧化能力和其他改变的物理化学性质，这可能与酶解后其分子量的分布和减少有关。此外，SDF 的加入显著降低了淀粉糊化过程中的峰值黏度、谷值黏度、回生值和最终黏度，表明它起到了抑制淀粉溶胀能力的作用。同时，经SDF 修饰后面团流变学特性的显著变化为麦麸作为食品配料提供了一种新思路。
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