黑果腺肋花楸[Aronia melanocarpa（Michx.）Elliott]又称不老莓或野樱莓，蔷薇科腺肋花楸属、多年生落叶灌木，原产于北美，广泛分布于美国中西部，在欧洲多个国家已经有多年的引种栽培历史。黑果腺肋花楸1990 年开始从朝鲜引进我国，大面积种植于辽宁省西北部半干旱地区。黑果腺肋花楸于2018 年9 月被国家卫生健康委员会列入新食品原料[1]，果实含有黄酮、花青素、多酚和多糖等活性物质，具有抗氧化、抗炎、防衰老、降血糖、抗肿瘤、抗抑郁、治疗肥胖症、防止尿路感染等功效，在欧美地区广泛应用于医药和功能性食品行业[2-7]。
姚利阳等[8]研究者对黑果腺肋花楸多糖含量进行了分析检测，结果表明黑果腺肋花楸多糖含量高于野生蓝莓和蓝靛果，含量高达1.764 mg/g。于淼[9]研究发现，黑果腺肋花楸多糖由阿拉伯糖、D-甘露糖、L-葡萄糖和鼠李糖4 种单糖组成。周雪艳等[10]对黑果腺肋花楸叶子多糖进行了研究，结果表明多糖由葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、阿拉伯糖7 种单糖组成。以上研究结果表明，黑果腺肋花楸果实与叶子多糖组成差异明显。黑果腺肋花楸多糖能显著提高急性肝氧化损伤小鼠肝脏中过氧化氢酶（catalase，CAT）活性、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，降低丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量，具有体内强抗氧化活性[11]。黑果腺肋花楸具有多种生物活性，但对其多糖的结构和活性研究很少，尤其鲜见对肠道益生菌生长的影响方面的报道。
多糖具有多种药理活性，能够作为碳源被益生菌吸收，加强益生菌对肠道细胞黏附作用，还可以增加低pH 值胃酸胁迫环境下益生菌的存活率。已报道的植物多糖，如白术多糖[12]、菜籽多糖[13]、橡子多糖[14]、枸杞多糖[15]、蒲公英多糖[16]和黄参多糖[17]等能够有效促进益生菌繁殖与生长，同时平衡肠道微生态环境；部分植物多糖，如辣木叶多糖和猴头菇多糖还可在胃酸胁迫下，使益生菌存活率大幅提高[18-19]。但目前鲜见黑果腺肋花楸多糖对益生菌生长作用及胃肠液耐受性等的报道。
因此，本研究考察不同浓度黑果腺肋花楸多糖对益生菌（嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和乳双歧杆菌）生长作用及模拟人体胃肠液环境下的耐受性的影响，为进一步开发黑果腺肋花楸功能食品提供数据支撑。
1 材料与方法
1.1 菌粉
益生菌粉（嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和乳双歧杆菌）：天津小薇生物科技有限公司。
1.2 材料与试剂
黑果腺肋花楸（鲜果）：市售；苯酚、浓盐酸、稀硫酸（均为分析纯）、无水乙醇（99.5%）：天津市江天化工有限公司；2.5 L 厌氧产气包、2.5 L 圆底立式厌氧培养袋：青岛海博生物技术有限公司；胃蛋白酶（酶活为1∶3 000）：河南万邦化工科技有限公司；胰酶（酶活为1∶4 000）：上海麦克林生化科技有限公司；低聚果糖：浙江一诺生物科技有限公司。
1.3 仪器与设备
HCB-900V 垂直层流洁净工作台：青岛海尔生物医疗股份有限公司；LDZX-75KBS 立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；BPC-250F 生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；PB160Z-S 电子天平：岛津国际贸易有限公司；BCD-321W 冰箱：博西华家用电器有限公司；RE-2000A 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；ALPHA 1-4 冻干剂：德国Marin Christ 公司；FE20 实验室pH 计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DF-101S 集热式恒温磁力搅拌器：巩义市予华仪器有限责任公司。
1.4 方法
1.4.1 黑果腺肋花楸多糖制备
将黑果腺肋花楸干果粉碎、研磨、过80 目筛，得到的粉末在40 倍的75 ℃热水中煮提90 min，过滤、3 600 r/min，10 min 条件下离心，得到上清液[20]。将得到的提取液，转移至高度真空的旋转蒸发仪内，50 ℃隔膜真空泵减压浓缩至原体积的1/5，得到浓缩溶液，用质量分数为95%的乙醇溶液沉淀，3 600 r/min，离心15 min，得到粗多糖沉淀[21]，继续采用Sevage 法除蛋白，透析袋透析7 h，得到精制多糖。将得到的黑果腺肋花楸粗多糖进行-58 ℃冷冻干燥20 h～24 h，得到黑果腺肋花楸粗多糖粉末。
1.4.2 多糖含量测定
采用紫外-可见分光光度法和苯酚-浓硫酸法，对得到的黑果腺肋花楸总多糖含量进行测定[22]。
标准曲线的绘制：准确称取无水葡萄糖（干燥至恒重）0.010 46 g，定容配制成100 mg/L 标准葡萄糖溶液。采用移液枪吸取标准葡萄糖溶液（100 mg/L）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，分别转移至10 mL 封口比色管内，分辨采用蒸馏水补足至1 mL。称取6.0 g重蒸试剂，加入去离子水溶解，配制成含量为6%的苯酚供试液。在每只具有标准葡萄糖溶液的比色管中分别加入0.5 mL 6%苯酚溶液，混匀后沿壁加入2.5 mL浓硫酸，摇匀，放置室温。在490 nm 下测定吸光值，绘制标准曲线。
样品的测定：准确称取黑果腺肋花楸多糖0.503 97 g，配制成浓度为0.1 mg/mL 的样品溶液。准确量取样品溶液0.5 mL，加蒸馏水至1 mL，加入0.5 mL 6%苯酚溶液，混匀后沿壁加入2.5 mL 浓硫酸，摇匀，放置室温。在490 nm 下测定吸光值，并计算多糖含量，公式如下。
多糖含量/（mg/mL）=C×V1×0.9÷V2
式中：C 为标准葡萄糖溶液浓度mg/mL；V1 为测得样品溶液吸光值对应标准葡萄糖溶液体积mL；0.9 为校正系数；V2 为样品溶液体积mL。
1.4.3 培养基配制
MRS 基础培养基配方：蛋白胨10.0 g，牛肉粉膏10.0 g，酵母浸出汁粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，醋酸钠5.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，吐温80 0.1 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05 g，蒸馏水1 000 mL，pH 值为6.4 左右。经过高压蒸汽灭菌锅（121 ℃，15 min）灭菌，备用。
1.4.4 菌种的活化
将1 mg 菌粉溶解在生理盐水中，配制成浓度为1 mg/mL 溶液，用涂布法将嗜酸乳杆菌接种于MRS 固体培养基中，在37 ℃的温度下，恒温培养24 h。从培养的菌落中挑取嗜酸乳杆菌菌落，在MRS 液体培养基中恒温培养24 h，制备出活化后的嗜酸乳杆菌菌液。鼠李糖乳杆菌和乳双歧杆菌活化方法同上。
1.4.5 活菌计数及存活率计算
活菌计数根据GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》中乳杆菌计数方法。称取样品1.0 g，与9.0 mL 生理盐水混合，搅拌均匀后，10 倍稀释，选取稀释2 个～3 个梯度，用移液枪取100 μL 于MRS 固体培养基进行培养，每组测试3 个平行样品，培养皿反向放入厌氧培养气囊中，37 ℃恒温厌氧培养（72±6）h 后，并进行活菌计数及存活率计算。存活率/%=消化后活菌数/初始活菌数。
1.4.6 3 种益生菌生长曲线的检测
取0.1 mL 活化的益生菌，接种于20 mL 培养基中（平行3 管），37 ℃培养箱中培养，检测0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h 的菌液在600 nm 处的吸光值，并获得生长曲线。测得嗜酸乳杆菌菌液、鼠李糖乳杆菌和乳双歧杆菌生长至稳定期的时间。
1.4.7 黑果腺肋花楸多糖对3 种益生菌体外生长的影响
将3 种益生菌各0.5 mL 接种至MRS 对照培养基与分别添加1%、2%、4%、6%、8%、10%、12%黑果腺肋花楸多糖的MRS 对照培养基中。再将上述培养基分别于37 ℃培养箱中培养至稳定期时间后，各取1 mL 菌液根据预试验测定结果进行相应的稀释，并进行活菌计数和存活率计算。每个样品测试3 次，取平均值。
1.4.8 3 种益生菌在模拟胃液、肠液中的耐受性试验
采用MRS 培养基作为空白基础培养基；同时采用8%黑果腺肋花楸多糖代替MRS 培养基中葡萄糖，作为样品组。将嗜酸乳杆菌菌液、鼠李糖乳杆菌和乳双歧杆菌进行活化，并取0.5 mL 进行接种，形成初始培养基，再取1 mL，进行稀释涂布，37 ℃恒温培养48 h后计数，为0 h 的活菌数。将初始培养基，放入37 ℃培养箱中恒温培养3 h/8 h。取出培养基，取1 mL 稀释，涂布后，37 ℃恒温培养48 h 后计数，为3 h 的菌数。每组试验重复3 次，然后分别计算3 h/8 h 后存活率。
1.4.9 体外模拟胃肠液消化
1.4.9.1 消化液的配制
体外模拟胃液：将0.1 mol/L 磷酸钾缓冲液的pH值分别调至1.5、2.5、3.5，加入胃蛋白酶（10 g/L），混合均匀后过0.22 μm 无菌膜，即可得到模拟胃液[23]。
体外模拟肠液：将0.1 mol/L 磷酸钾缓冲液的pH值调至6.8，加入胰酶（10 g/L），猪胆盐（3 g/L），混合均匀后过0.22 μm 无菌膜，即可得到模拟肠液[24]。
1.4.9.2 模拟胃消化
将不同样品置于20.0 mL 不同pH 值模拟胃液环境中，37 ℃、90 r/min 厌氧条件下模拟胃液消化。于0、1.0、2.0、3.0 h 时取样，采用稀释涂布平板计数法对活菌进行计数，并计算存活率。
1.4.9.3 模拟肠消化
将不同样品置于80.0 mL pH 值为6.8 模拟肠液环境中，37 ℃、120 r/min 厌氧条件下模拟肠液消化。于0、2.0、4.0、6.0、8.0 h 时取样，采用稀释涂布平板计数法对活菌进行计数，并计算存活率。
1.5 数据分析
试验数据统计分析采用SPSS 13.0，用graphpad prism、Excel 2013 进行做图和分析。
2 结果与分析
2.1 3 种益生菌生长曲线
通过紫外-可见分光光度法和苯酚-浓硫酸法测得黑果腺肋花楸多糖的含量为80.86%。经紫外检测，无蛋白和DNA 的特征吸收峰。嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和乳双歧杆菌的生长曲线如图1 所示，
图1 嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和乳双歧杆菌的生长曲线
Fig.1 Growth curve of Lactobacillus acidophilus，Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus bifidum
由图1 可知，3 种益生菌在4 h 都处在迟滞期。4 h以后，3 种菌都逐步进入指数期。嗜酸乳杆菌在14 h 左右进入稳定期，鼠李糖乳杆菌和乳双歧杆菌在12 h 左右进入稳定期。因此，在研究黑果腺肋花楸多糖对3种益生菌体外生长影响试验与模拟肠胃试验中，3 种乳酸菌的菌种最佳培养时间分别为14 h（嗜酸乳杆菌）、12 h（鼠李糖乳杆菌）、12 h（乳双歧杆菌）。
2.2 黑果腺肋花楸多糖对3 种益生菌体外生长的影响
嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和乳双歧杆菌的培养基中分别加入不同含量多糖后，不同益生菌OD 值结果见图2。
图2 黑果腺肋花楸多糖含量对3 种益生菌的生长影响
Fig.2 Effect of polysaccharide content in Aronia melanocarpa on the growth of three probiotics
不同小写字母表示组内差异显著，p＜0.05。
由图2 可知，在培养基中添加1%的黑果腺肋花楸多糖，3 种益生菌的生长量均明显增加。对组内数据进行对比，当培养基中黑果腺肋花楸多糖多糖含量由1%增加至8%时，嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和乳双歧杆菌的生长量均增长明显，达到显著性差异（p＜0.05）；黑果腺肋花楸多糖含量为8%～12%时，嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的菌液OD 值基本不变，趋于平稳，无显著差异（p＞0.05），而乳双歧杆菌菌液OD 值逐渐下降，且趋势显著（p＜0.05）。表明8%为浓度界限，小于8%浓度的黑果腺肋花楸多糖可显著促进益生菌的生长，但浓度达到或者超过8%时，可能会导致培养基渗透压过高，导致菌株脱水，益生菌生长状态变差，OD 值表现为平稳或者降低。因此后期进行耐胃肠液以及胆盐试验时，采用8%浓度的黑果腺肋花楸多糖代替葡萄糖。与山药多糖（12.5%浓度，双歧杆菌数量增加最显著）相比，只需更低的黑果腺肋花楸多糖量即可促进双歧杆菌的数量增加[25]，但是与猴头菇多糖（7.0%浓度，保加利亚乳杆菌数量增加显著）和辣木叶多糖（2.0%浓度，保加利亚乳杆菌增加显著）相比[18-19]，需要更多的黑果腺肋花楸多糖量才促进乳杆菌的数量增加。以上数据表明黑果腺肋花楸多糖与其它多糖相比，结构不同，对益生菌增殖展现出的作用浓度亦不尽相同。
2.3 添加黑果腺肋花楸多糖对3 种益生菌对模拟胃液环境的耐受性
人体胃液pH 值随着进食的食物种类和时间变化，范围在1.5～3.5 左右[26]。参考人体胃消化时间为3 h左右，因此设计变化范围为0～3 h。本试验中0 h 时活菌数均为100%，pH3.5 和2.5 的模拟胃液中，益生菌存活率未有明显降低。消化0、1、2、3 h 后，活菌数仍维持在9.29 lg（CFU/g）～9.32 lg（CFU/g）之间，添加黑果花楸腺肋多糖与未添加多糖无明显差异。当pH1.5 时，消化3 h 后，裸益生菌和添加低聚果糖益生菌的活菌数都降为0，但添加8%黑果腺肋花楸多糖益生菌活菌数仍保持较高水平，结果如图3、图4 和图5 所示。
图3 不同添加物对嗜酸乳杆菌在pH1.5 模拟胃液存活率的影响
Fig.3 Effects of different compounds on the survival rate of Lactobacillus acidophilus in simulated gastric juice at pH1.5
图4 不同添加物对鼠李糖乳杆菌在pH1.5 模拟胃液存活率的影响
Fig.4 Effects of different compounds on the survival rate of Lactobacillus rhamnosus in simulated gastric juice at pH1.5
图5 不同添加物对乳双歧杆菌在pH1.5 模拟胃液存活率的影响
Fig.5 Effects of different compounds on the survival rate of Lactobacillus bifidus in simulated gastric juice at pH1.5
由图3、图4 和图5 所示，0 h 时活菌数均为100%，消化3h 后，添加黑果腺肋花楸多糖的嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和乳双歧杆菌存活率分别可达95.88%、64.45%、65.43%，与裸菌和添加低聚果糖相比（3 h 后，存活率为0），保护作用尤为显著。同时与辣木叶多糖和猴头菇多糖相比，在pH 值为1.5 条件下，黑果腺肋花楸多糖的益生菌存活率可达95.88%，而辣木叶多糖和猴头菇多糖在pH 值为3 条件下，益生菌存活率仅为70%～86%[18-19]。结果表明，当pH1.5 时，黑果腺肋花楸多糖明显提高了益生菌对模拟胃液的耐受性。这可能是由于多糖与菌体胞壁多糖组成成分相似，提高了胞壁多糖的黏附作用，阻止了菌体接触酸胁迫环境，进而减少了对H+的吸收，使得细胞维持在正常pH 值范围内[27]；激活了谷氨酸脱氢酶，从而提高了益生菌的耐酸能力。
2.4 添加黑果腺肋花楸多糖对3 种益生菌对模拟肠液环境的耐受性
肠道内各种酶等多种成分都会对益生菌的存活造成威胁。食物在人体肠液中存留的时间为8 h 左右，因此设计试验时间变化范围为0～8 h，pH6.8 时益生菌对模拟肠液环境的耐受性结果如图6、图7 和8 所示。
图6 不同添加物对嗜酸乳杆菌在pH6.8 模拟肠液存活率的影响
Fig.6 Effects of different compounds on the survival rate of Lactobacillus acidophilus in simulated intestinal fluid at pH6.8
图7 不同添加物对鼠李糖乳杆菌在pH6.8 模拟肠液存活率的影响
Fig.7 Effects of different compounds on the survival rate of Lactobacillus rhamnosus in simulated intestinal fluid at pH6.8
图8 不同添加物对乳双歧杆菌在pH6.8 模拟肠液存活率的影响
Fig.8 Effects of different compounds on the survival rate of Lactobacillus bifidus in simulated intestinal fluid at pH6.8
由图6、图7 和图8 可知，裸益生菌和添加低聚果糖的益生菌，消化8 h 后，存活率都有所降低。添加8%黑果腺肋花楸多糖的益生菌经过肠液消化2 h 后，活菌数迅速升高，消化8 h 时，添加多糖的嗜酸乳杆菌和乳双歧杆菌活菌数逐渐降低，但活菌数仍为109 CFU/g以上，存活率在130%～133%之间。这可能是由于部分益生菌黏附在多糖表面，短时间被多糖保护，而经过长时间则保护作用减弱，活菌数也随之减少，这与其它科研人员报道的肠道益生菌生长数据相符[28]。数据表明，黑果腺肋花楸多糖可以明显提高益生菌在肠液中的耐受性，这可能与多糖结构与谷氨酸脱氢酶的活力有关。但鼠李糖乳杆菌经过8 h 消化后，存活率与低聚果糖相当，仅略优于低聚果糖。
3 结论
黑果腺肋花楸多糖可促进嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和乳双歧杆菌的生长，当多糖浓度达到8%时，促进生长效果达到最佳。同时黑果腺肋花楸多糖可有效提高嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和乳双歧杆菌对模拟胃肠液的耐受性，尤其在pH 值为1.5 的模拟胃液中，效果最好，显著优于低聚糖。本研究可为黑果腺肋花楸多糖对益生菌的保护作用提供有利的数据支持，尤其对胃酸较多人群服用益生菌提供了益生元保护剂新思路，但黑果腺肋花楸多糖促进益生菌生长的作用机制还有待进一步深入研究。
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