南极磷虾（Euphausia superba）是一种体积很小的甲壳类动物，主要分布在南极附近海域。虽然南极磷虾的体型小且生长缓慢，但生物密度非常高，生物蕴藏量巨大，总量可以达到6.5 亿t～10 亿t[1]。同时，南极磷虾具有蛋白质含量高且脂肪含量低的特点，因此南极磷虾种群非常适合作为人类的蛋白质资源库。
南极磷虾油是从南极磷虾中提取的，其主要成分为磷脂、虾青素以及Ω-3 型多不饱和脂肪酸[主要为二十碳五烯酸（eicosapentaenioc acid，EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）][2]。南极磷虾油中含有大量以磷脂形式存在的EPA 和DHA[3]，磷脂可以快速通过细胞膜，大大提高细胞对DHA 和EPA 的吸收和利用程度，所以，以南极磷虾油为基础开发的功能性食品具有较好的应用前景。
2 型糖尿病（diabetes mellitus type 2，T2DM）是由于胰岛素缺乏或相对缺乏而导致血糖偏高的一种慢性代谢疾病，主要临床症状为“三多一少”，即多饮、多食、多尿、体质量减轻。糖尿病会引发多种并发症，包括神经性疾病、心脑血管疾病、肾脏疾病以及视网膜疾病等，严重的可能会导致失明和肾衰竭等。所有糖尿病患者中，2 型糖尿病患者较为常见。糖尿病目前无法治愈，一旦患病，就需要每天通过药物来维持血糖的稳定[4]。并且，随着不断摄入降糖类药物，机体会产生相应的抗药性，药物的疗效会逐步减弱，也会给机体带来一些毒性作用和不良反应[5]。目前，大量实验证实一些天然产物中有降血糖活性成分，而且长时间食用不会对机体造成危害[6]。因此，从天然产物中开发具有辅助降血糖功效的产品成为了当前研究的热点之一。
目前，南极磷虾油的生理功能主要集中在保护心脑血管健康[7]、保护神经健康[8]和改善骨质疏松[9]、改善大脑功能等方面[10]。南极磷虾油中有多种具有降血糖功效的活性成分，如多不饱和脂肪酸、虾青素、生育酚和类黄酮等[11]，但南极磷虾油的降血糖功效还缺少实验数据支持。
通过高脂高糖饮食结合注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）的方法构建2 型糖尿病小鼠模型后，灌胃不同剂量的南极磷虾油，通过小鼠糖代谢相关指标来验证南极磷虾油对2 型糖尿病小鼠的降血糖功效；通过分析小鼠的抗氧化能力、抗炎能力、胰岛素分泌及胰岛素抵抗情况等相关指标变化，探究南极磷虾油对于2 型糖尿病小鼠降血糖作用的相关机制。
1 材料与方法
1.1 动物、材料与试剂
SPF 级C57BL/6J 雄性小鼠[4 周龄，体质量（15.0±1.4）g]：华兴（郑州）实验动物养殖场，许可证号SCXK（豫）2019-0002。
南极磷虾：中国海洋大学海洋生命学院动物生物学研究室自主捕捞；高脂高糖饲料：江苏协同医药生物工程有限责任公司；链脲佐菌素：北京索莱宝科技有限公司；二甲双胍：中美上海施贵宝制药有限公司；糖化血红蛋白 （glycosylated hemoglobin type A1c，HbA1c）检测试剂盒、空腹胰岛素（fasting insulin，FINS）检测试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性检测试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）活性检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性检测试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量检测试剂盒：南京建成生物工程研究所有限公司；无水乙醇（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
酶标分析仪（DNM-9602）：北京普朗新技术有限公司；高速冷冻离心机（Sorvall ST 16R）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；旋转蒸发仪（R-3）：瑞士Buchi 公司；真空干燥箱（101）：上海市仪器仪表厂；高速分散器（XHF-D）：宁波新芝生物科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 南极磷虾油的提取
将-80 ℃下保存的南极磷虾放于室温下解冻并搅碎成糊状，随后加热使其体内自溶酶失活，用蒸馏水冲洗以去除盐分，去除多余水分后，置于真空干燥箱内60 ℃干燥，干燥完成后按料液比1∶6（g/mL）添加无水乙醇，浸提一定时间后抽滤得到含有南极磷虾油的乙醇溶液，75 ℃条件下减压蒸发，即可得到主要成分为磷脂（质量分数28.9%）、不饱和脂肪酸（质量分数37.6%）、虾青素（质量分数0.33%）的南极磷虾油。
1.3.2 实验分组、造模与灌胃
C57BL/6J 雄性小鼠60 只，环境温度（25±2）℃，相对湿度40%～50%，自然采光条件下适应性喂养7 d后，除空白对照组（blank control group，BCG）外，其余小鼠均开始喂食高脂高糖饲料，喂食4 周后，连续4 d 注射STZ，注射剂量为30 mg/（kg·d）。注射结束72 h 后，对小鼠连续12 h 禁食不禁水，测量小鼠空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）值，连续3 d FBG 值均≥11.1 mmol/L 即可视为糖尿病小鼠造模成功[12]。造模成功后，随机将小鼠分为糖尿病模型组（NCG）、低剂量南极磷虾油组[LDG，100 mg/（kg·d）]、中剂量南极磷虾油组[MDG，250 mg/（kg·d）]、高剂量南极磷虾油组[HDG，500 mg/（kg·d）]和阳性对照组[PCG，二甲双胍75 mg/（kg·d）]。南极磷虾油分别用生理盐水稀释并用高速分散器制成浓度分别为10、25、50 mg/mL 的混浊液，二甲双胍用生理盐水稀释至7.5 mg/mL，以保证每只小鼠每天的灌胃剂量均为0.1 mL/10 g，每天对空白对照组和糖尿病模型组灌胃等体积的生理盐水。
1.3.3 评价指标的测定
连续灌胃糖尿病小鼠8 周，灌胃期间，每周检测小鼠空腹血糖值和体质量。根据《辅助降血糖功能评价方法》（国食药监保化〔2012〕107 号），于灌胃结束的第2 天对小鼠进行口服葡萄糖耐量实验（oral glucose tolerance test，OGTT），检测小鼠灌胃葡萄糖后0、0.5、1.0、2.0 h 的血糖值（mmol/L），分别记为A1、A2、A3、A4，绘制血糖变化曲线并计算曲线下面积（area under the curve，AUC），以此表征小鼠对葡萄糖代谢的综合水平。间隔1 d 后，采小鼠静脉血，检测HbA1c 水平；随后对小鼠进行摘眼球取血，分离血清并检测小鼠FINS水平，计算胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-IR）；随后将小鼠脱颈处死，解剖取小鼠肝脏，测量SOD、GSH-Px、CAT 活性和MDA 含量；以上，相关数据的测量均按照相应试剂盒说明书进行。利用即时聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，Q-PCR）检测炎症相关因子[白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）]的mRNA 相对表达量。QPCR 目的基因的引物序列信息见表1。
表1 Q-PCR 目的基因的引物序列信息
Table 1 Primers for fluorescent quantitative PCR of target genes
?
AUC 计算公式如下。
AUC/（h·mmol/L）=0.25×A1+0.5×A2+0.75×A3+0.5×A4
胰岛素抵抗指数计算公式如下。
1.4 数据统计分析
实验结果以平均值±标准差的形式表示，使用SPSS 26.0 软件进行数据分析，组间数据差异分析均采用单因素方差分析法。
2 结果与分析
2.1 南极磷虾油对2 型糖尿病小鼠体质量的影响
南极磷虾油对2 型糖尿病小鼠体质量的影响见表2。
表2 南极磷虾油对2 型糖尿病小鼠体质量的影响
Table 2 Effect of Antarctic krill oil on the body weight in mice with T2DM
分组 体质量/g第0 周 第1 周 第2 周 第3 周 第4 周 第5 周 第6 周 第7 周 第8 周LDG 24.4±0.5 24.5±0.7 24.8±0.7 25.4±1.2 25.3±1.1 25.0±0.9 24.7±1.1 24.6±0.7 24.5±1.2 MDG 24.1±0.8 24.3±1.0 24.1±0.9 24.5±0.7 24.3±0.8 24.9±1.1 24.7±1.1 25.1±0.7 25.5±0.5 HDG 23.9±0.7 23.7±0.7 23.8±1.0 24.1±0.9 23.9±1.2 24.4±1.2 24.3±1.1 24.5±0.9 24.8±1.0 NCG 23.2±0.8 23.3±1.2 23.6±1.0 24.1±0.9 24.1±1.3 24.7±1.1 24.5±1.2 24.4±1.6 24.1±1.4 PCG 23.7±0.6 23.9±1.1 23.9±1.0 24.4±0.9 24.6±0.8 24.8±1.2 24.6±1.2 24.9±0.8 25.3±1.1 BCG 23.4±0.8 23.5±0.9 24.1±0.8 24.3±1.0 24.3±1.3 24.2±1.5 24.5±1.3 24.7±1.1 25.1±0.9
由表2 可知，8 周内，各组小鼠体质量无明显波动，均没有出现糖尿病导致体质量减轻的情况，这可能是由于造模期间，小鼠摄入高脂高糖饲料，身体内的脂肪储存量较高，小鼠的体质量较大，与糖尿病会使体质量减轻的作用相拮抗，导致小鼠的体质量并无明显变化。
2.2 南极磷虾油对2 型糖尿病小鼠空腹血糖值的影响
南极磷虾油对2 型糖尿病小鼠空腹血糖值的影响见图1。
图1 南极磷虾油对2 型糖尿病小鼠空腹血糖值的影响
Fig.1 Effect of Antarctic krill oil on fasting blood glucose in mice with T2DM
由图1 可知，灌胃期间，各实验组小鼠的FBG 值均明显高于空白对照组，且NCG 的空腹血糖值整体高于其他组，进一步说明糖尿病小鼠造模成功。灌胃8周时，LDG、MDG、HDG 的空腹血糖值相较于NCG 分别降低了30.1%、42.8%、43.1%，说明南极磷虾油具有降低糖尿病小鼠空腹血糖值的功效。
2.3 南极磷虾油对2 型糖尿病小鼠糖耐量的影响
南极磷虾油对2 型糖尿病小鼠糖耐量的影响见图2 和图3。
图2 南极磷虾油对2 型糖尿病小鼠口服葡萄糖后的血糖值变化的影响
Fig.2 Effect of Antarctic krill oil on the change of blood glucose after oral intake of glucose in mice with T2DM
图3 南极磷虾油对2 型糖尿病小鼠糖耐量曲线下面积的影响
Fig.3 Effect of Antarctic krill oil on area under curve of oral glucose tolerance test in mice with T2DM
小写字母不同表示差异显著，p＜0.05。
由图2 可知，前0.5 h 内，灌胃葡萄糖后，各组小鼠的血糖值均有不同程度的上升，在灌胃0.5 h 后，除NCG 外，其他组小鼠血糖值均在2.0 h 内基本恢复至初始水平，而NCG 灌胃0.5 h 血糖达到最高值后，未来1.5 h 的血糖值只有轻微的降低，并没有恢复至最初水平。由图3 可知，LDG、MDG、HDG 小鼠的AUC 值显著低于NCG（p＜0.05），但显著高于PCG（p＜0.05），其中，MDG 和HDG 无明显差别，但都显著低于LDG（p＜0.05），说明南极磷虾油具有改善小鼠葡萄糖代谢能力、增强机体对血糖浓度适应能力的作用[11]。
2.4 南极磷虾油对2 型糖尿病小鼠糖化血红蛋白水平的影响
南极磷虾油对2 型糖尿病小鼠糖化血红蛋白水平的影响见图4。
图4 南极磷虾油对2 型糖尿病小鼠糖化血红蛋白含量的影响
Fig.4 Effect of Antarctic krill oil on glycosylated hemoglobin content in mice with T2DM
小写字母不同表示差异显著，p＜0.05。
由图4 可知，灌胃结束后，LDG、MDG、HDG 小鼠的糖化血红蛋白水平相比于NCG 显著降低（p＜0.05），但显著高于PCG（p＜0.05），说明南极磷虾油可以降低糖尿病小鼠的糖化血红蛋白水平，进一步验证了南极磷虾油具有改善小鼠糖代谢的功效，但效果相比于二甲双胍来说并不明显，可能是由于南极磷虾油中含有一定量的脂类物质，导致机体内部对于糖化血红蛋白的代谢效果改善不明显[13]。
2.5 南极磷虾油对2 型糖尿病小鼠血清FINS 水平及HOMA-IR 的影响
南极磷虾油对2 型糖尿病小鼠血清FINS 水平及HOMA-IR 的影响见表3。
由表3 可知，相较于NCG，LDG、MDG、HDG 小鼠的FINS 水平显著提高（p＜0.05），HOMA-IR 指数显著降低（p＜0.05），相较于PCG，HDG 小鼠的FINS 水平有所提高，LDG、MDG、HDG 小鼠的HOMA-IR 指数显著增高（p＜0.05），说明南极磷虾油可以促进糖尿病小鼠的胰岛素分泌，并改善细胞对胰岛素的敏感程度，进而改善机体的糖代谢水平，但效果略差于二甲双胍，可能是由于二甲双胍有效成分浓度较高，而南极磷虾油的有效成分含量较低，且消化系统对于油脂类成分吸收较差[14]。
表3 南极磷虾油对2 型糖尿病小鼠血清FINS 水平及HOMA-IR的影响
Table 3 Effect of Antarctic krill oil on serum FINS level and HOMA-IR index in mice with T2DM
注：同列小写字母不同表示差异显著，p＜0.05。
组别 FINS 水平/（mIU/L） HOMA-IR LDG 5.42±0.17c 1.12±0.88b MDG 5.47±0.34bc 0.96±0.49c HDG 5.71±0.33b 0.92±0.55c NCG 4.30±0.29d 1.45±0.39a PCG 5.51±0.28bc 0.83±0.29d BCG 8.26±0.35a 0.68±0.33e
2.6 南极磷虾油对2 型糖尿病小鼠抗氧化能力的影响
南极磷虾油对2 型糖尿病小鼠抗氧化能力的影响见图5。
由图5 可知，MDG、HDG 的SOD 活性均显著高于NCG（p＜0.05），但低于PCG（p＜0.05）；HDG 的GSH-Px活性和CAT 活性相对于NCG 均有显著的提高（p＜0.05），且HDG 的CAT 活性与PCG 组相差不大；相较于NCG，LDG、MDG、HDG 的MDA 含量均显著降低（p＜0.05），HDG 的MDA 含量显著低于PCG（p＜0.05），表明南极磷虾油可以通过提高机体SOD、GSH-Px、CAT 活性，降低MDA 含量，清除体内多余自由基，减轻机体的氧化应激损伤[15-16]，提高机体的氧化防御能力，且在提高CAT 活性，降低MDA 含量方面，HDG 要略优于二甲双胍。
图5 南极磷虾油对2 型糖尿病小鼠抗氧化能力的影响
Fig.5 Effect of Antarctic krill oil on antioxidant capacity of mice with T2DM
A.SOD 活性；B.GSH-Px 活性；C.CAT 活性；D.MDA 含量。
小写字母不同表示差异显著，p＜0.05。
2.7 南极磷虾油对小鼠肝脏炎症相关因子mRNA 相对表达量的影响
南极磷虾油对小鼠肝脏炎症相关因子mRNA 相对表达量的影响见图6。
由图6 可知，LDG、MDG、HDG 3 组的IL-1、IL-6、TNF-α 的mRNA 相对表达量相较于NCG 均有显著的降低（p＜0.05），LDG、MDG、HDG 的TNF-α 的mRNA相对表达量相较于PCG 无明显变化（p＞0.05），相较于PCG，LDG、MDG、HDG 的IL-1、IL-6 的mRNA 相对表达量均显著降低（p＜0.05），表明南极磷虾油可以减少炎症相关因子尤其是TNF-α 的释放，从而减轻炎症相关因子对胰岛素信号转导的阻碍[17-18]，达到缓解T2DM的目的[19-20]。
图6 南极磷虾油对2 型糖尿病小鼠炎症相关因子mRNA 相对表达量的影响
Fig.6 Effect of Antarctic krill oil on the relative mRNA expression of inflammation-related factors in mice with T2DM
A.IL-1 mRNA 相对表达量；B.IL-6 mRNA 相对表达量；C.TNF-α mRNA 相对表达量。
小写字母不同表示差异显著，p＜0.05。
3 结论
本文以2 型糖尿病模型小鼠为研究对象，通过灌胃南极磷虾油并测量空腹血糖值、体质量、糖耐量及糖化血红蛋白水平等，结果表明各指标均得到明显改善，说明南极磷虾油具有辅助降血糖的功效。通过测量血清胰岛素含量、胰岛素抵抗指数、抗氧化酶系活性、MDA 含量、炎症相关因子mRNA 相对表达量，结果表明小鼠的胰岛素敏感性、抗氧化能力及抗炎能力均得到改善。综上所述，南极磷虾油可通过改善小鼠的抗氧化能力和抗炎能力，减轻机体的胰岛素抵抗，来调节机体的糖代谢。
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