新疆是多民族聚居区，本地区牧民自古以来就有制作和食用发酵乳制品的习惯，这些传统发酵乳制品中蕴藏着极为丰富的优质乳酸菌资源，赋予了产品良好的感官品质和风味特性。乳酸菌是一类广泛存在于各种发酵食品中的有益微生物，其产生的胞外蛋白酶对食品发酵过程中的风味形成及品质改善起关键作用[1]，其在发酵乳、肉制品中的作用尤为突出。发酵肉制品中的肌肉蛋白质在乳酸菌胞外蛋白酶的作用下分解为多肽、氨基酸等风味前体物质，改善发酵肉制品的特征风味与品质特性，提升肉制品的营养价值，同时确保产品的安全性与稳定性[2-4]。在发酵乳制品生产中，乳酸菌蛋白酶能够分解乳蛋白产生多肽及氨基酸，提高胃蛋白酶的活性，促进损伤的肠黏膜上皮修复等，同时还能提升乳制品的品质和营养价值[5-6]。
细菌生物膜是一种有组织的、具有功能性的细菌群体，是由菌体细胞及其分泌至胞外的大分子物质组成的微生物集合体[7]。生物膜的形成能使细菌具有良好的稳定性和对不利环境的抗逆性，如果赋予有益细菌（如乳酸菌）这些特性，将使其能更好地在生产和实践中发挥作用[8-9]，乳酸菌生物膜的形成为其生存环境提供机械稳定性，提高了菌体的抗逆性，保护了生物膜中的乳酸菌。同时，生物膜的形成也赋予乳酸菌多重功能特性，具有极高的应用价值和广阔的应用前景[10-11]。因此，开展乳酸菌生物膜的相关研究可为其在生产上的进一步应用提供理论指导，使它们在改善人类健康方面发挥更大的作用。
乳酸菌在发酵肉、乳制品过程中，发酵制品的内环境会随发酵进程的延长和加工方式的不同而有所差异，如乳酸菌产酸使体系pH值下降，不同的盐添加量和不同温度的影响等均可能改变体系的发酵特性[12-13]。不同加工条件可使乳酸菌生物膜形成能力发生改变，同时也影响着菌株的产酶活力及酶的活性等特性。酶的催化能力与其活性部位和空间结构有关，完整的二级和三级结构可维持酶活性中心的空间构象，一旦二级和三级结构受到破坏，酶的催化活性即会丧失[14]。加工条件（如盐浓度、体系pH值、加工温度）会对酶的活性部位与空间结构造成不可逆破坏，改变菌体自身的合成及代谢进程，同时也影响其生物膜形成能力，故不同加工条件胁迫下乳酸菌胞外产酶活力的性质及生物膜形成能力均会受到一定的影响[15]。因此，探索加工条件胁迫下乳酸菌的产酶活性与其生物膜形成能力之间的关系，为进一步开发利用乳酸菌生物膜提供思路，同时也对发酵乳制品形成优良的风味和提升品质特性具有重要意义。
本课题组在前期研究中发现植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）zwq9是生物膜强阳性菌株[16]，经初步分析，该菌株具有良好的产胞外蛋白酶活力。本研究以该菌株为研究对象，探索不同加工条件胁迫下该乳酸菌的生物膜形成能力与其产胞外酶特性，探讨乳酸菌生物膜的形成与其产酶特性的关系，为深入发掘利用新疆特色乳制品中的乳酸菌资源提供思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
生物膜阳性植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）zwq9：塔里木大学食品科学与工程学院畜产品加工课题组分离自新疆传统发酵乳制品老酸奶。
MRS肉汤培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司；WHB细胞培养板：上海卧宏生物科技有限公司；蛋白酶K（40 U/mg）：德国Merck公司；高碘酸钠：福晨（天津）化学试剂有限公司；福林酚：上海源叶生物科技有限公司；L-酪氨酸：天津市光复精细化工研究所；干酪素：天津市北联精细化学品开发有限公司；其他试验所需试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
多功能酶标仪（Synergy H1）：美国BioTek仪器有限公司；电热恒温培养箱（HPX-9162MBE）、立式压力蒸汽灭菌器（50SII）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；高速冷冻离心机（TGL-bR）：上海安亭科学仪器厂；电热鼓风干燥箱（101型）：北京市永光明医疗仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 细菌生长曲线的测定
挑取单菌落接种至MRS液体培养基，37℃下培养12 h，按体积比1∶100的接种比例将培养12 h的菌液接种至新鲜的MRS液体培养基中，前12 h每隔1 h测定培养液590nm处的吸光度，同时测定培养24、36 h和48 h后培养液在590 nm处的吸光度。每组试验重复3次。
1.3.2 生物膜形成能力检测
参照文献[17-18]的方法，采用微量板半定量法对植物乳杆菌zwq9的生物膜形成能力进行检测。按体积比1∶100的接种比例将培养12 h的菌液30 μL接种至3 mL培养基，充分混匀，吸取200 μL至96孔板中，37℃恒温静置培养48 h后测定培养液在590 nm处的吸光度，倾出培养液，用无菌水洗板4次。56℃烘干固定1 h，50 μL 0.5%结晶紫染色5 min，自来水冲洗除去多余染液，37℃晾干，再用酶标仪测定其在490 nm处的吸光度。当OD490大于4.0时仪器显示为OVRFLW，即默认此时OD490值为4.0。所有生物膜形成检测试验均重复3次。
1.3.3 生物膜组分分析
参照Rohde等[19]及李英等[20]的方法并略做改动，同1.3.2中采用96孔板法检测分析植物乳杆菌zwq9生物膜的组分，将培养后的培养板取出，测定其在590 nm处的吸光度后轻轻倾出培养液，用无菌水洗板洗去未黏附细菌后，分别向培养板中加入20 μL 1 mg/mL蛋白酶K，37℃孵育2h，或向培养板中加入50μL 50 mmol/L高碘酸钠，37℃孵育2 h，以不加蛋白酶K或高碘酸钠的处理组为对照组，用酶标仪测定490 nm处的吸光度。每组试验重复3次。
1.3.4 发酵条件胁迫体系的构建
根据乳酸菌的发酵特性，分别建立乳酸胁迫体系、温度胁迫体系和盐胁迫体系。1）乳酸胁迫体系：分别向初始液体培养基中加入一定量的乳酸，使乳酸的终浓度为0%、0.2%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、3.0%；2）温度胁迫体系：将接种后的培养液分别置于10、20、30℃和40℃条件下培养；3）盐胁迫体系：分别向初始液体培养基中加入一定量的NaCl，使NaCl的终浓度为0%、1%、2%、4%、6%、8%、10%。分别分析不同胁迫体系条件下植物乳杆菌zwq9的生物膜形成能力及其产酶活力。
1.3.5 产蛋白酶活力的测定
取培养结束后的发酵液5mL于4℃下10000r/min离心10 min，收集上清液即为粗酶液[21]；参照GB/T 23527—2009《蛋白酶制剂》中的福林法对植物乳杆菌zwq9粗酶液的蛋白酶活力进行测定。将不同稀释梯度的粗酶液与1%酪蛋白溶液充分混合均匀，置于40℃水浴中加热20 min，加入2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸终止反应。20℃静置10 min后5 000 r/min离心15 min，取1 mL上清液与5 mL碳酸钠溶液、0.5 mL福林酚溶液混合，40℃显色20 min，测定680 nm处的吸光度。以酪氨酸标准溶液绘制标准曲线，计算粗蛋白酶的活力。本研究所得酪氨酸标准曲线为y=0.010 8x+0.001 8（R2=0.999 6）。蛋白酶活力的定义：在最适条件下，每分钟内水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸所需的酶量定为一个活力单位（U）。
1.4 数据处理与分析
本研究所得试验数据采用SPSS 22进行统计分析，One-way ANOVA和Duncan’s多重比较用于分析不同处理组之间的差异，显著水平为P＜0.05；所有试验至少重复3次，结果表示为平均值±标准差。
2 结果与分析
2.1 植物乳杆菌zwq9的生长曲线及其生物膜形成能力
图1为植物乳杆菌zwq9的生长曲线及其生物膜形成能力。
图1 植物乳杆菌zwq9生长曲线及其生物膜形成能力
Fig.1 Growth curve and biofilm formation of L.plantarum zwq9
如图1A所示，植物乳杆菌zwq9的生长曲线呈典型的“S”型，能较清晰地区分延滞期、对数期和稳定期，其中0～4 h为细菌生长的延滞期，4 h～10 h为对数期，随后逐渐进入稳定期。该菌株的生长符合细菌分批培养的典型生长规律。如图1B所示，植物乳杆菌zwq9具有极强的生物膜形成能力，经微量板半定量法检测其OD490值高于4.0，这与文献研究结果保持一致[16-17]。
2.2 植物乳杆菌zwq9的生物膜组分分析
图2为植物乳杆菌zwq9的生物膜组分分析。
图2 植物乳杆菌zwq9的生物膜组分分析
Fig.2 The component analysis of the biofilm formed by L.plantarum zwq9
如图2所示，不同处理对植物乳杆菌zwq9的生物膜有不同影响，与对照组相比，采用高碘酸钠处理后，生物膜的OD490值无显著变化（P＞0.05），而经蛋白酶K处理后，其OD490值显著降低（P＜0.05），蛋白酶K处理后生物膜的OD490值仅为对照组的13.64%，表明在zwq9的生物膜结构中，胞外蛋白质可能发挥着重要作用。
2.3 不同胁迫条件对植物乳杆菌zwq9生长及生物膜形成的影响
2.3.1 乳酸胁迫对植物乳杆菌zwq9生长及生物膜形成的影响
乳酸胁迫对植物乳杆菌zwq9生长及生物膜形成的影响如图3所示。
图3 不同乳酸添加量对植物乳杆菌zwq9生长及生物膜形成的影响
Fig.3 Effects of different lactic acid concentrations on growth and biofilm formation by L.plantarum zwq9
如图3所示，当外源乳酸添加量低于0.2%时，植物乳杆菌zwq9的生长及生物膜形成均不受影响，其OD590和OD490值与对照组（乳酸添加量为0%）相比均无显著差异（P＞0.05）；在乳酸添加量为0.4%时，zwq9的生长浊度是对照组的90.51%，而其生物膜形成能力显著降低了36%（P＜0.05）；当乳酸添加量在0.8%以上时，其能够显著抑制zwq9的生长和生物膜的形成（P＜0.05），其OD590和OD490值比对照组均降低了90%以上。
2.3.2 温度胁迫对植物乳杆菌zwq9生长及生物膜形成的影响
温度胁迫对植物乳杆菌zwq9生长及生物膜形成的影响如图4所示。
图4 不同培养温度对植物乳杆菌zwq9生长及生物膜形成的影响
Fig.4 Effects of different culture temperatures on growth and biofilm formation by L.plantarum zwq9
如图4所示，当培养温度低于10℃时，植物乳杆菌zwq9的生长及生物膜形成能力在所有处理组中相对最低；当培养温度提升至30℃时，其生长及生物膜形成情况良好，此时与40℃处理组之间无显著差异（P＞0.05），两组生物膜形成的OD490值均大于4.0，并且均显著高于10℃和20℃处理组（P＜0.05）。
2.3.3 盐胁迫对植物乳杆菌zwq9生长及生物膜形成的影响
盐胁迫对植物乳杆菌zwq9生长及生物膜形成的影响如图5所示。
图5 不同盐浓度对植物乳杆菌zwq9生长及生物膜形成的影响
Fig.5 Effects of different salt concentrations on growth and biofilm formation by L.plantarum zwq9
如图5所示，当NaCl浓度低于4%时，植物乳杆菌zwq9的生物膜形成与对照组（NaCl浓度为0%）无显著差异（P＞0.05），但其生长受到一定影响。与对照组相比，1%NaCl显著增加了植物乳杆菌zwq9的OD590值（P＜0.05），而4%NaCl则显著抑制了植物乳杆菌zwq9的生长（P＜0.05），2%NaCl处理组的 OD590值与对照组无显著差异（P＞0.05）；当NaCl浓度高于 6%时，植物乳杆菌zwq9的生长及其生物膜形成能力均被显著抑制（P＜0.05），当NaCl浓度达到8%时，与对照组相比，其OD590值降低了90%以上，OD490值减小了98%以上。
2.4 不同胁迫条件对植物乳杆菌zwq9产蛋白酶活力的影响
2.4.1 乳酸胁迫对植物乳杆菌zwq9产蛋白酶活力的影响
乳酸胁迫对植物乳杆菌zwq9产蛋白酶活力的影响如图6所示。
图6 不同乳酸浓度对植物乳杆菌zwq9产蛋白酶活力的影响
Fig.6 Effects of different lactic acid concentrations on proteaseproducing activity of L.plantarum zwq9
如图6所示，在乳酸胁迫条件下，随着外源乳酸浓度的增加，植物乳杆菌zwq9产胞外蛋白酶活力呈下降趋势；与对照组（乳酸浓度为0%）相比，当乳酸浓度为0.2%时，菌株的产酶活力显著下降了12.57%（P＜0.05）；当浓度增加至0.4%时，产酶活力显著低于对照组（P＜0.05），仅为对照组的60%；当乳酸浓度增加至0.8%以上时，植物乳杆菌zwq9的产酶活力与对照组相比显著降低（P＜0.05），降低了94%以上。
2.4.2 温度胁迫对植物乳杆菌zwq9产蛋白酶活力的影响
温度胁迫对植物乳杆菌zwq9产蛋白酶活力的影响如图7所示。
图7 不同培养温度对植物乳杆菌zwq9产蛋白酶活力的影响
Fig.7 Effects of different culture temperatures on proteaseproducing activity of L.plantarum zwq9
如图7所示，温度条件对植物乳杆菌zwq9的产胞外蛋白酶活力也有较大影响。随着培养温度的升高，植物乳杆菌zwq9的产酶活力呈先增加再降低的趋势，在30℃时，产酶活力相对最高，显著高于其他处理组（P＜0.05），其次为40℃处理组，但其产酶活力仅为30℃处理组的50.79%。
2.4.3 盐胁迫对植物乳杆菌zwq9产蛋白酶活力的影响
盐胁迫对植物乳杆菌zwq9产蛋白酶活力的影响如图8所示。
图8 不同盐浓度对植物乳杆菌zwq9产蛋白酶活力的影响
Fig.8 Effects of different salt concentrations on proteaseproducing activity of L.plantarum zwq9
如图8所示，在不同盐浓度胁迫体系中，随着NaCl添加浓度的增加，植物乳杆菌zwq9的产胞外蛋白酶活力也整体呈先升高后降低的趋势，添加1%NaCl能够显著增加zwq9的产酶活力（P＜0.05），产酶活力比对照组提高了43.80%，并且添加2%和4%NaCl处理组的产酶活力也显著高于对照组（P＜0.05）；当NaCl浓度高于8%时，zwq9的产酶活力显著低于其他处理组（P＜0.05），与对照组相比降低了90%以上。这表明较低浓度NaCl（≤4%）的添加能够在一定程度上提高zwq9的产蛋白酶活力，而高浓度NaCl（≥8%）的添加几乎完全抑制了菌株的产酶活力。
2.5 相关性分析
采用SPSS 22对不同胁迫条件下植物乳杆菌zwq9的生长量（OD590值）、生物膜形成能力（OD490值）和产蛋白酶活力进行Pearson相关性分析，结果如表1所示。
表1 Pearson相关性分析
Table 1 Pearson correlation analysis
注：** 表示差异极显著，P＜0.01。
产蛋白酶活力乳酸胁迫体系项目 生长量 生物膜形成能力生长量 1 0.995** 0.975**生物膜形成能力 0.995** 1 0.990**产蛋白酶活力 0.975** 0.990** 1温度胁迫体系生长量 1 0.808 0.752生物膜形成能力 0.808 1 0.875产蛋白酶活力 0.752 0.875 1盐胁迫体系生长量 1 0.983** 0.945**生物膜形成能力 0.983** 1 0.958**产蛋白酶活力 0.945** 0.958** 1
由表1可知，在乳酸和盐胁迫条件下，植物乳杆菌zwq9的生长量、生物膜形成能力和产蛋白酶活力之间均呈极显著正相关关系（P＜0.01）。
3 讨论与结论
新疆地区由于其独特的地理环境及历史文化等因素，发酵肉、乳制品是优质乳酸菌资源的重要来源，尤其是亟待充分开发利用的生物膜阳性乳酸菌资源。西热娜依·阿布力克木等[22]从新疆阿图什市和乌什县传统酸奶分离获得57株乳酸菌，其中生物膜阳性菌38株，占73%，并且发现生物膜的形成能力与酸奶的拉丝特性呈正相关关系。本课题组前期从新疆特色酸奶及奶疙瘩等乳制品中分离获得110株乳酸菌，其中生物膜阳性乳酸菌70株，占比63.64%[16]；远高于其他学者所报道的其他地区和来源乳酸菌的生物膜形成能力[23-24]。
细菌生物膜是由细菌细胞及其分泌至胞外的大分子物质所组成的集合体，其组分通常包括胞外多糖、胞外蛋白、核酸及少量其他物质，但不同种类细菌生物膜的组分及各组分的作用有较大差异[7，25-26]。李英等[20]对2株表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）的生物膜组分分析发现，菌株ATCC 35984的生物膜主要为胞外多糖，而临床分离株5-121-2的生物膜中胞外蛋白起主导作用。金黄色葡萄球菌（S.aureus）ATCC 29213的生物膜中，胞外蛋白含量最高，胞外多糖的含量相对最低[27]。在副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的生物膜中，胞外蛋白的含量与生物膜的形成呈正相关，而胞外多糖的含量与生物膜的形成不具有相关性[28]。而本研究结果显示在植物乳杆菌zwq9的生物膜中，胞外蛋白所起的作用比胞外多糖更为重要。乳酸菌是一类富产胞外多糖的细菌，该类多糖在食品工业应用广泛，而胞外多糖又是乳酸菌生物膜的组成部分，但产量高并不一定参与到乳酸菌的生理活动中，这与纪亚楠[29]的研究结果相一致。在不同胁迫体系中，乳酸菌生物膜形成无明显变化时，其胞外多糖产量却明显降低，二者并未呈正相关关系。
在发酵乳、肉制品生产过程中，体系内存在的多种胁迫因素等会促进或抑制乳酸菌的产酶活力和生物膜形成能力，这些胁迫因素中最常见的有酸胁迫、温度胁迫和盐胁迫。这些因素不仅是菌体生长的重要控制条件，同时也关系到菌体的产酶活性及生物膜的形成能力。Sharma等[30]指出，体系的pH值影响微生物的产酶和营养物质的细胞膜运输，这可能是由于在最适pH值时，质子在化学渗透中的动力受体系pH值的影响，微生物的相对代谢效率较高，故产酶能力提升。体系温度不仅影响与菌体产酶相关的细胞代谢，而且和酶与底物蛋白的反应速率、分子作用强度及相关理化特性密切相关[31]。庞丰平等[32]通过Plackett-Burman试验及响应面分析得出，瑞士乳杆菌（L.helveticus）的最优产蛋白酶条件为发酵温度36℃、起始pH6.65、发酵时间16 h，此时蛋白酶活力为22.59 U/mL。宋园亮等[33]对一株分离自云南豆豉中乳酸菌的产蛋白酶条件进行分析，发现起始pH5.0、35℃发酵培养36 h，菌株的产蛋白酶活力可达32.50 U/mL。乳酸菌生物膜的形成也与体系的pH值和温度密切相关。赵佳伟等[34]指出植物乳杆菌RS66CD在NaCl质量浓度为53 g/L、40℃培养24 h时，菌株的生物膜形成量最大。纪亚楠[29]研究发现，不同乳酸菌生物膜形成的最佳条件不同，植物乳杆菌5-4-1生物膜形成的最佳条件为培养基pH7.5、培养温度44℃、NaCl质量分数1.5%，而对于乳酸片球菌（Pediococcus lactis）TG1-1-10，培养基 pH7.5、培养温度30℃、NaCl质量分数4.5%时，其生物膜形成能力最强。在本研究中，植物乳杆菌zwq9的生物膜形成能力及其产蛋白酶活力也受到培养基pH值和培养温度的影响。植物乳杆菌的乳酸发酵属于同型乳酸发酵，在其发酵过程中，随着发酵时间的延长，乳酸在发酵液中逐渐积累导致pH值降低，进而导致其生长量、生物膜形成能力及产蛋白酶活力均降低，尤其是当乳酸添加量高于0.8%时，乳酸菌的生物膜形成能力和产蛋白酶活力与对照组相比均降低90%以上。有学者指出，在乳酸菌的发酵进程中，随着体系中乳酸等酸性物质的累积，乳酸菌细胞的生长及代谢活动被抑制，同时高浓度的酸使细胞质中积累大量质子，最终影响乳酸菌的增殖能力和各种生物活性功能[29]。培养温度过高或过低均不利于乳酸菌的生长和代谢机能，在10℃时，植物乳杆菌zwq9的生长量、生物膜形成能力和产蛋白酶活力均被抑制，而当培养温度为40℃时，植物乳杆菌zwq9的产蛋白酶活力显著降低（P＜0.05），但其生长及生物膜形成能力与30℃相比无显著差异（P＞0.05）。在低温胁迫条件下，冷刺激会造成乳酸菌细胞的机械性损伤，导致细胞流动性变差，甚至引起DNA损伤，最终导致乳酸菌生长及代谢活动减缓甚至停滞[35-36]；而在高温胁迫下，可能会引起乳酸菌细胞内蛋白质的变性和沉降，还会使细胞内核糖体、RNA等多种大分子物质的稳定性下降，改变细胞膜的流动性等，进而影响乳酸菌的生理特性及代谢活动[37-38]。
外界盐胁迫条件对乳酸菌细胞的存活、增殖、代谢途径及活力均有较大影响，进而改变乳酸菌的发酵特性。有学者分析了盐胁迫体系中嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和瑞士乳杆菌的产酶活力的变化，发现盐胁迫可使两种乳酸菌细胞活力下降、产酶活力升高，体系中游离氨基酸含量增加[39]；而随着盐浓度的进一步增加，高盐胁迫条件使乳酸菌的产酶活力迅速降低，细胞存活力也急剧下降，细胞膜的完整性遭到严重破坏[40]。对于乳酸菌生物膜，有学者指出，较低浓度的Na+能够通过影响体系渗透压平衡，促进生物膜形成相关基因表达，补偿生物膜表型不稳定等，促进生物膜的形成[34，41-42]。这与本研究的结果较为相似，添加1%NaCl能够显著增加植物乳杆菌zwq9的生长量（P＜0.05），并显著增强其产酶活力（P＜0.05）（可能对其生物膜形成能力也具有一定的增强效应，但由于所用仪器最高限值的影响在本研究中的数据未显示）。根据目前已有关于乳酸菌耐盐机制的研究结果，植物乳杆菌的耐盐机制主要包括相容性溶质调控系统和糖酵解关键酶调控系统[43]，在相容性溶质调控系统中，随着NaCl添加量的增加，植物乳杆菌zwq9在细胞内积累相容性物质（如甘氨酸甜菜碱、海藻糖、脯氨酸等），这些物质在维持细胞正常渗透压的同时，也在一定程度上改变了乳酸菌的合成与代谢通路，进而影响其生长、生物膜形成及胞外酶的产生等[43-44]；另一方面，一定浓度NaCl的添加会诱导植物乳杆菌糖酵解途径（Embden-Meyerhof-Parnas，EMP）相关基因 pfk、fba、pgk、ldh等的表达量上调，使EMP途径更为高效地进行[45]，进而导致植物乳杆菌的生长特性和发酵特性发生改变，影响其生长、生物膜形成和产蛋白酶活力。
综上，本研究从生物膜形成及产生胞外蛋白酶方面着手，发现在不同胁迫条件下，植物乳杆菌zwq9的生物膜形成能力与其产胞外蛋白酶活力紧密相关，二者呈极显著正相关关系（P＜0.01），两种代谢活动均随乳酸菌细胞在不同胁迫条件下生理特性的改变而发生变化，这为进一步开发利用优质乳酸菌资源提供参考思路。
[1] CHEW L Y,TOH G T,ISMAIL A.Application of proteases for the production of bioactive peptides[M]//Enzymes in Food Biotechnology.Amsterdam:Elsevier,2019.
[2] TODOROV S D,STOJANOVSKI S,ILIEV I,et al.Technology and safety assessment for lactic acid bacteria isolated from traditional Bulgarian fermented meat product'lukanka'[J].Brazilian Journal of Microbiology,2017,48(3):576-586.
[3] 王俊钢,李宇辉,岳建平,等.不同产蛋白酶乳酸菌对风干牛肉蛋白质降解的影响[J].食品工业科技,2022,43(8):117-123.
WANG Jungang,LI Yuhui,YUE Jianping,et al.Effects of different protease-producing lactic acid bacteria on the degradation of dried beef protein[J].Science and Technology of Food Industry,2022,43(8):117-123.
[4] 黄玉军,周帆,于俊娟,等.高转化大豆异黄酮乳酸菌的筛选及在豆乳中的发酵特性[J].食品研究与开发,2021,42(3):157-162.
HUANG Yujun,ZHOU Fan,YU Junjuan,et al.Screening of lactic acid bacteria with high conversion of soybean isoflavones and fermentation characteristics in soybean milk[J].Food Research and Development,2021,42(3):157-162.
[5] 张伟,金庭飞,黎旭,等.新疆传统乳制品中产蛋白酶乳酸菌的筛选及产酶条件优化[J].中国酿造,2021,40(7):101-106.
ZHANG Wei,JIN Tingfei,LI Xu,et al.Screening of protease-producing lactic acid bacteria from Xinjiang traditional dairy products and optimization of enzymatic production conditions[J].China Brewing,2021,40(7):101-106.
[6] 何捷,曾小群,吕鸣春,等.新疆酸奶中高产蛋白酶与产脂肪酶乳酸菌的筛选[J].食品科学,2015,36(17):130-133.
HE Jie,ZENG Xiaoqun,LÜ Mingchun,et al.Screening of lactic acid bacteria with high protease and lipase activities from Xinjiang traditional yogurt[J].Food Science,2015,36(17):130-133.
[7]HALL-STOODLEY L,COSTERTON J W,STOODLEY P.Bacterial biofilms:From the natural environment to infectious diseases[J].Nature Reviews Microbiology,2004,2(2):95-108.
[8]KUBOTA H, SENDA S, TOKUDA H, et al. Stress resistance of biofilm and planktonic Lactobacillus plantarum subsp.plantarum JCM 1149[J].Food Microbiology,2009,26(6):592-597.
[9]KIEW T Y,CHEOW W S,HADINOTO K.Importance of biofilm age and growth medium on the viability of probiotic capsules containing Lactobacillus rhamnosus GG biofilm[J].LWT-Food Science and Technology,2014,59(2):956-963.
[10]SALAS-JARA M J,ILABACA A,VEGA M,et al.Biofilm forming Lactobacillus:New challenges for the development of probiotics[J].Microorganisms,2016,4(3):35.
[11]ABEE T.KOVÁCS A T,KUIPERS O P,et al.Biofilm formation and dispersal in Gram-positive bacteria[J].Current Opinion in Biotechnology,2011,22(2):172-179.
[12]GE Q F,PEI H J,LIU R,et al.Effects of Lactobacillus plantarum NJAU-01 from Jinhua ham on the quality of dry-cured fermented sausage[J].LWT-Food Science and Technology,2019,101:513-518.
[13]LARANJO M,AGULHEIRO A C,POTES M E,et al.Effects of genotype,salt content and calibre on quality of traditional dry-fermented sausages[J].Food Control,2015,56:119-127.
[14]SHAHRIZAL M,DAIMON Y,TANAKA Y,et al.Structural basis for the function of the β-barrel assembly-enhancing protease BepA[J].Journal of Molecular Biology,2019,431(3):625-635.
[15]HADDAJI N,KHOUADJA S,FDHILA K,et al.Acid stress suggests different determinants for polystyrene and HeLa cell adhesion in Lactobacillus casei[J].Journal of Dairy Science,2015,98(7):4302-4309.
[16]任晓镤,妥彦峰,梁月慧,等.新疆民族特色酸奶及酸奶疙瘩中乳酸菌的分离鉴定及其生物膜形成能力检测[J].塔里木大学学报,2014,26(4):1-7.
REN Xiaopu,TUO Yanfeng,LIANG Yuehui,et al.Isolation,identification and detection of the ability of biofilm formation of the lactic acid bacteria isolated from yogurt and yogurt lump with Xinjiang ethnic characteristics[J].Journal of Tarim University,2014,26(4):1-7.
[17]任晓镤,许倩,李明杨,等.酿酒酵母对乳杆菌生长与生物膜形成的影响[J].农业机械学报,2016,47(2):264-269,287.
REN Xiaopu,XU Qian,LI Mingyang,et al.Effects of Saccharomyces cerevisiae on Lactobacillus growth and biofilm formation[J].Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery,2016,47(2):264-269,287.
[18]REN X P,WANG L J,CHEN W.Oxytropis glabra DC.inhibits biofilm formation of Staphylococcus epidermidis by down-regulating Ica operon expression[J].Current Microbiology,2020,77(7):1167-1173.
[19]ROHDE H,BURDELSKI C,BARTSCHT K,et al.Induction of Staphylococcus epidermidis biofilm formation via proteolytic processing of the accumulation-associated protein by staphylococcal and host proteases[J].Molecular Microbiology,2005,55(6):1883-1895.
[20]李英,成李静,陈伟.新疆南疆地区奶牛乳房炎性表皮葡萄球菌生物膜形成依赖型检测[J].新疆农业科学,2015,52(4):754-758.
LI Ying,CHENG Lijing,CHEN Wei.The dependent form of biofilm formation of Staphylococcus epidermidis isolated from the southern Xinjiang[J].Xinjiang Agricultural Sciences,2015,52(4):754-758.
[21]李丹阳,李宇辉,高云云,等.新疆哈萨克族风干肉中产蛋白酶乳酸菌的筛选及酶学特性研究[J].食品与发酵工业,2020,46(9):57-63.
LI Danyang,LI Yuhui,GAO Yunyun,et al.Screening of proteaseproducing lactic acid bacteria from Xinjiang Kazakh air-dried meat and their enzymatic characteristics[J].Food and Fermentation Industries,2020,46(9):57-63.
[22]西热娜依·阿布力克木,穆耶赛尔·玉苏普,努尔古丽·热合曼.南疆传统发酵酸奶中可产生生物膜乳酸菌的筛选及鉴定[J].食品与发酵工业,2017,43(7):128-133.
XIRINAY·Ablikim,MUYESSER·Yusup,NURGUL·Rahman.Screening and identification of lactic acid bacteria forming biofilm in traditional fermented milk in South Xinjiang[J].Food and Fermentation Industries,2017,43(7):128-133.
[23]钟华晨,张悦,顾悦,等.高产生物膜乳酸菌的筛选、鉴定及胞外多糖分泌条件的研究[J].中国食品学报,2021,21(7):76-86.
ZHONG Huachen,ZHANG Yue,GU Yue,et al.Screening and identification of high-producing biofilm lactic acid bacteria and studies on the conditions of extracellular polysaccharide secretion[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2021,21(7):76-86.
[24]靳胜男,舒慧萍,张冬星,等.猪源生物膜乳酸菌的筛选与生物学特性分析[J].黑龙江畜牧兽医,2020(6):92-98,157.
JIN Shengnan,SHU Huiping,ZHANG Dongxing,et al.Screening and biological characteristics analysis of lactobacilli from swine biofilms[J].Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine,2020(6):92-98,157.
[25]王星,张华,张淼,等.乳酸菌生物膜的形成及其影响因素[J].中国乳品工业,2020,48(3):38-40,46.
WANG Xing,ZHANG Hua,ZHANG Miao,et al.Review of the formation of lactic acid bacteria biofilm and its influencing factors[J].China Dairy Industry,2020,48(3):38-40,46.
[26]SEVIOUR T,DERLON N,DUEHOLM M S,et al.Extracellular polymeric substances of biofilms:Suffering from an identity crisis[J].Water Research,2019,151:1-7.
[27]罗俊.二氢杨梅素对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制与清除作用研究[D].广州:广东工业大学,2021.
LUO Jun.Study on the inhibition and removal of dihydromyricetin on Staphylococcus aureus biofilm[D].Guangzhou:Guangdong University of Technology,2021.
[28]李薇.胞外DNA在副溶血性弧菌生物被膜形成过程中作用机制的研究[D].上海:上海海洋大学,2020.
LI Wei.Study on the mechanism of extracellular DNA in biofilm formation of Vibrio parahaemolyticus[D].Shanghai:Shanghai Ocean University,2020.
[29]纪亚楠.环境胁迫对乳酸菌产生物膜、信号分子Al-2及胞外多糖的影响[D].呼和浩特:内蒙古农业大学,2020.
JI Yanan.The effects of environmental stress on the production of biofilm,signal molecule AI-2 and EPS in lactic acid bacteria[D].Hohhot:Inner Mongolia Agricultural University,2020.
[30]SHARMA K M,KUMAR R,PANWAR S,et al.Microbial alkaline proteases:Optimization of production parameters and their properties[J].Journal of Genetic Engineering and Biotechnology,2017,15(1):115-126.
[31]ELIAS M,WIECZOREK G,ROSENNE S,et al.The universality of enzymatic rate-temperature dependency[J].Trends in Biochemical Sciences,2014,39(1):1-7.
[32]庞丰平,霍乃蕊.响应面法优化瑞士乳杆菌产蛋白酶培养条件[J].中国调味品,2017,42(4):4-8.
PANG Fengping,HUO Nairui.Optimization of culture conditions of protease produced by Lactobacillus helveticus using response surface methodology[J].China Condiment,2017,42(4):4-8.
[33]宋园亮,张忠华,熊骏,等.元阳豆豉中高产蛋白酶乳酸菌的筛选及其产酶条件的研究[J].中国微生态学杂志,2011,23(1):8-12.
SONG Yuanliang,ZHANG Zhonghua,XIONG Jun,et al.Screening of high-yield proteinase producing lactic acid bacteria from Yuanyang Douchi and its conditions of enzyme production[J].Chinese Journal of Microecology,2011,23(1):8-12.
[34]赵佳伟,敖晓琳,蔡义民,等.金属离子对植物乳杆菌RS66CD生物膜形成及环境耐受性的影响[J].食品与发酵工业,2019,45(21):46-52.
ZHAO Jiawei,AO Xiaolin,CAI Yimin,et al.Effect of metal ions on the biofilm formation and environmental tolerance of Lactobacillus plantarum RS66CD[J].Food and Fermentation Industries,2019,45(21):46-52.
[35]DERZELLE S,HALLET B,FERAIN T,et al.Improved adaptation to cold-shock,stationary-phase,and freezing stresses in Lactobacillus plantarum overproducing cold-shock proteins[J].Applied and Environmental Microbiology,2003,69(7):4285-4290.
[36]雷雨婷,张英华,霍贵成.保加利亚乳杆菌的冷适应性与冷应激蛋白的研究[J].东北农业大学学报,2008,39(5):101-105.
LEI Yuting,ZHANG Yinghua,HUO Guicheng.Study on cold shock proteins and low-temperature response of L.delbrueckii subsp.bulgaricus[J].Journal of Northeast Agricultural University,2008,39(5):101-105.
[37]PRASAD J,MCJARROW P,GOPAL P.Heat and osmotic stress responses of probiotic Lactobacillus rhamnosus HN001(DR20)in relation to viability after drying[J].Applied and Environmental Microbiology,2003,69(2):917-925.
[38]HANSEN M C,NIELSEN A K,MOLIN S,et al.Changes in rRNA levels during stress invalidates results from mRNA blotting:Fluorescence in situ rRNA hybridization permits renormalization for estimation of cellular mRNA levels[J].Journal of Bacteriology,2001,183(16):4747-4751.
[39]HICKEY C D,AUTY M A E,WILKINSON M G,et al.Influence of process temperature and salting methods on starter and NSLAB growth and enzymatic activity during the ripening of cheeses produced with Streptococcus thermophilus and Lactobacillus helveticus[J].International Dairy Journal,2017,69:9-18.
[40]HICKEY C D,FALLICO V,WIKINSON M G,et al.Redefining the effect of salt on thermophilic starter cell viability,culturability and metabolic activity in cheese[J].Food Microbiology,2018,69:219-231.
[41]赵佳伟,敖晓琳,赵珂.金属离子对乳酸菌生物膜形成的影响及其机制研究进展[J].食品科学,2019,40(9):341-346.
ZHAO Jiawei,AO Xiaolin,ZHAO Ke.Progress in understanding the effect and mechanism of metal ions on biofilm formation of lactic acid bacteria[J].Food Science,2019,40(9):341-346.
[42]LIM Y,JANA M,LUONG T T,et al.Control of glucose-and NaClinduced biofilm formation by rbf in Staphylococcus aureus[J].Journal of Bacteriology,2004,186(3):722-729.
[43]林松洋,郝利民,刘鑫,等.乳酸菌耐盐分子机制研究进展[J].食品科学,2018,39(3):295-301.
LIN Songyang,HAO Limin,LIU Xin,et al.Progress in molecular mechanism of salt tolerance in lactic acid bacteria[J].Food Science,2018,39(3):295-301.
[44]GALINSKI E A,TRUPER H G.Microbial behaviour in salt-stressed ecosystems[J].FEMS Microbiology Reviews,1994,15(2/3):95-108.
[45]DONG S J,LIN X H,LI H.Regulation of Lactobacillus plantarum contamination on the carbohydrate and energy related metabolisms of Saccharomyces cerevisiae during bioethanol fermentation[J].The International Journal of Biochemistry&Cell Biology,2015,68:33-41.