大豆作为我国重要的农作物产品之一,是豆制品、食用油的主要来源,目前我国大豆的年消耗量超过亿吨[1-2]。大豆皮作为大豆的重要组成部分,占大豆质量的5%~10%[3-4],在大豆加工及利用过程中,大豆皮通常作为加工副产物,用于饲料或有机肥,造成资源的严重浪费[5-6]。大豆皮富含纤维素和半纤维素,是制备膳食纤维的理想原料。膳食纤维根据其溶解性可分为可溶性膳食纤维(soluble dietary fiber,SDF)及不可溶性膳食纤维(insoluble dietary fiber,IDF),其中水溶性膳食纤维含量较低,水溶性膳食纤维具有调节肠蠕动、改善肠道菌群、调节血糖、血脂等多种生理功能[7-11]。目前SDF制备方法主要包括物理法、化学法、酶法及生物发酵[12-15],其中物理法及化学法成本低、操作简便,但SDF转化率低、品质较差,同时存在一定污染;生物发酵制备SDF的成本及对设备要求较高;酶法制备SDF反应条件温和、专一性强、转化率高[16-18]。目前,关于酶法制备大豆皮膳食纤维的报道较少。本研究以纤维素酶及半纤维素酶作为水解酶,利用单因素及响应面试验,优化大豆皮酶解工艺,制备大豆皮SDF并研究其理化特性,以期为大豆皮资源综合利用提供参考。
大豆皮:山东圣旺新材料有限公司;纤维素酶(10万U/g):武汉盛瑞源生物科技有限公司;半纤维素酶(10万U/g):青岛海维森生物科技有限公司;植物油(花生油):山东鲁花集团有限公司;其他试剂均为国产分析纯。
COMECT多功能粉碎机:武汉提沃克科技有限公司;PWN125DZH电子天平:青岛东飞科仪环保科技有限公司;DT5-4B型台式离心机:北京新时代北利医疗器械有限公司;DHG-9023A鼓风台式电热恒温干燥箱:浙江纳德科学仪器有限公司;H13970电热恒温水浴锅:河北慧采科技有限公司;RE-52A旋转蒸发仪:济南爱来宝仪器设备有限公司。
1.3.1 制备流程
大豆皮经蒸馏水反复清洗、除杂,室温(25℃~30℃)下干燥至恒重,粉碎过40目筛,得到大豆皮粗粉,以纤维素酶∶半纤维素酶=1∶1(质量比)作水解酶进行酶解(45℃、5 h),乙醇沉淀,沉淀复溶后喷雾干燥,即得大豆皮SDF。
1.3.2 单因素试验
以纤维素酶∶半纤维素酶=1∶1(质量比)作为水解酶,以大豆皮SDF得率为考察指标,分别考察料液比、酶添加量、酶解时间、酶解温度、pH值对大豆皮SDF得率的影响。
1.3.3 响应面优化
结合单因素试验结果,利用Design Expert进行Box-Behnken试验设计,优化料液比、酶添加量、酶解时间、酶解温度及pH值,确定最优酶解工艺条件。
1.3.4 SDF理化性质的测定
1.3.4.1 大豆皮SDF持水力的测定
参考文献[19]中的方法,称取适量大豆皮SDF粉末加入50 mL蒸馏水,室温20℃~25℃搅拌24 h,3 000 r/min离心10 min,弃去上清液,测定大豆皮SDF质量,计算大豆皮SDF持水力,计算公式如下。
持水力/%=(m3-m2-m1)/m1×100
式中:m1为大豆皮SDF粉末质量,g;m2为离心管质量,g;m3为大豆皮SDF与离心管总质量,g。
1.3.4.2 大豆皮SDF膨胀力的测定
参考文献[20]中的方法,称取适量大豆皮SDF粉末置于10 mL干燥量筒中,记录其原始体积V1;加蒸馏水至刻度,室温(20℃~25℃)条件下静置12 h,测定其吸水后体积V2,计算大豆皮SDF膨胀力,计算公式如下。
膨胀力/(mL/g)=(V2-V1)/m1
式中:m1为大豆皮SDF粉末质量,g;V1为原始体积,mL;V2为吸水后体积,mL。
1.3.4.3 大豆皮SDF持油力的测定
参考文献[21]中的方法,称取适量大豆皮SDF粉末放入离心管中,加入10 mL植物油,每10 min搅拌1次,共计浸泡1 h,3 000 r/min离心10 min,弃去上清液,测定大豆皮SDF质量,计算大豆皮SDF持油力,计算公式如下。
持油力/%=(m2-m1)/m2×100
式中:m1为大豆皮SDF粉末质量,g;m2为剩余残渣的质量,g。
响应面试验设计及分析采用Design Expert 8.0,采用SPSS 22.0进行显著性分析,采用Origin 8.6绘图。
2.1.1 料液比对大豆皮SDF得率的影响
设定酶添加量为0.85%、酶解时间为5 h、酶解温度为45℃、酶解pH值为4.6,分别考察料液比为1∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35(g/mL)时大豆皮 SDF得率,结果如图1所示。
图1 料液比对大豆皮SDF得率的影响
Fig.1 Effect of different feed liquid ratio on the yield of soybean skin SDF
由图1可知,随着溶剂量的增加,大豆皮SDF得率呈现先升高后降低的趋势,分析其原因可能为溶剂量过小,反应不完全、反应体系黏稠度较高,使SDF溶出、扩散困难;溶剂量过大,反应体系中SDF浓度过低,沉淀不彻底。综上,溶剂过多或过少均可导致SDF得率降低,当料液比达到1∶20(g/mL)时,大豆皮SDF得率最高,因此选择料液比1∶20(g/mL)进行后续试验。
2.1.2 酶添加量对大豆皮SDF得率的影响
设定酶解时间为5 h、酶解温度为45℃、酶解pH值为4.6、料液比为1∶20(g/mL),分别考察酶添加量为0.70%、0.75%、0.80%、0.85%、0.90%及0.95%时大豆皮SDF得率,结果如图2所示。
图2 酶添加量对大豆皮SDF得率的影响
Fig.2 Effects of different enzyme additions on the yield of soybean skin SDF
由图2可知,随着酶添加量的增加,大豆皮SDF得率呈现先升高后降低的趋势,分析其原因可能为随着酶添加量的增加,酶解反应速率提升,反应更加彻底。但酶添加过量可导致部分SDF被进一步水解,从而导致SDF得率降低。研究结果显示,当酶添加量达到0.85%时,大豆皮SDF得率最高,因此选择酶添加量为0.85%进行后续试验。
2.1.3 酶解时间对大豆皮SDF得率的影响
设定料液比为1∶20(g/mL)、酶解温度为45℃、酶解pH值为4.6、酶添加量为0.85%时,分别考察酶解时间为 2、3、4、5、6 h及 7 h 时大豆皮 SDF 得率,结果如图3所示。
图3 酶解时间对大豆皮SDF得率的影响
Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of soybean skin SDF
由图3可知,随着酶解时间的延长,大豆皮SDF得率呈现逐渐升高的趋势,分析其原因可能为长时间酶解为酶解反应提供了足够的反应时间,然而,在酶解反应完成后,延长酶解时间对SDF得率不再产生影响。当酶解时间达到5 h后,大豆皮SDF得率不再发生明显变化,因此选择酶解时间5 h进行后续试验。
2.1.4 酶解温度对大豆皮SDF得率的影响
设定料液比为 1∶20(g/mL)、酶解时间为 5 h、酶解pH值为4.6、酶添加量为0.85%时,分别考察酶解温度为 35、40、45、50、55℃及 60℃时大豆皮 SDF得率,结果如图4所示。
图4 酶解温度对大豆皮SDF得率的影响
Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of soybean skin SDF
由图4可知,随着酶解温度的升高,大豆皮SDF得率呈现先升高后降低的趋势,分析其原因可能为随着酶解温度的升高,水解酶活力逐渐增强,SDF得率也随之升高,当温度过高时,会导致酶活力降低或失活,降低SDF得率。研究结果显示,当酶解温度达到45℃时,大豆皮SDF得率最高,因此酶解温度选择为45℃。
2.1.5 pH值对大豆皮SDF得率的影响
设定料液比为 1∶20(g/mL)、酶解时间为 5 h、酶解温度为45℃、酶添加量为0.85%时,分别考察pH值为 4.0、4.6、5.2、5.8、6.4 及 7.0 时大豆皮 SDF 得率,结果如图5所示。
图5 酶解pH值对大豆皮SDF得率的影响
Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis pH on the yield of soybean skin SDF
由图5可知,随着pH值的升高,大豆皮SDF得率呈现先升高后降低的趋势,分析其原因可能为pH值可通过改变水解酶空间构型对酶活力产生重要影响,pH值过高或过低均可导致水解酶活力降低,影响SDF得率。研究结果显示,当pH值为4.6时,大豆皮SDF得率最高,因此酶解pH值选择为4.6。
2.2.1 酶解工艺响应面优化
结合单因素试验,发现酶解温度及酶解pH值相对固定(水解酶的最适温度及最适pH值相对固定),因此选取料液比(A)、酶添加量(B)、酶解时间(C)作为考察因子,以SDF得率(Y)为考察指标,利用Box-Behnken Design模式设计试验来优化大豆皮SDF酶解工艺,试验因素及水平见表1,响应面设计试验结果及方差分析见表2、表3。
表1 因素及水平
Table 1 Factors and levels
水平 因素A料液比/(g/mL)B酶添加量/%C酶解时间/h-1 1∶15 0.80 4 0 1∶20 0.85 5 1 1∶25 0.90 6
表2 Box Behnken试验方案与结果
Table 2 Box Behnken test scheme and results
试验编号 A料液比/(g/mL)B酶添加量/%C酶解时间/h SDF得率/%1 1∶15 0.80 5 10.2 2 1∶25 0.80 5 8.9 3 1∶15 0.90 5 10.3 4 1∶25 0.90 5 10.2 5 1∶25 0.85 4 9.2 6 1∶15 0.85 6 10.2 7 1∶20 0.90 4 9.8 9 1∶20 0.90 6 10.3 10 1∶15 0.85 4 8.9 11 1∶20 0.85 5 11.9 12 1∶20 0.85 5 12.5 13 1∶20 0.85 5 12.3 14 1∶20 0.80 4 9.4 15 1∶20 0.85 5 12.3 16 1∶20 0.85 5 12.8 17 1∶20 0.80 6 9.8 1∶25 0.85 6 10.1 8
表3 响应面试验结果方差分析
Table 3 Analysis of variance of response surface test results
注:P<0.01表示差异极显著。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 26.22 9 2.91 20.51 <0.000 1 极显著A 0.180 0 1 0.180 0 1.27 0.297 4 B 0.661 3 1 0.661 3 4.65 0.067 9 C 1.20 1 1.20 11.46 <0.000 1 极显著AB 0.360 0 1 0.360 0 2.53 0.155 4 AC 0.040 0 1 0.040 0 0.281 5 0.612 1 BC 0.002 5 1 0.062 5 0.517 6 0.498 2 A2 7.59 1 7.59 53.41 <0.000 1 极显著B2 5.26 1 5.26 37.01 <0.000 1 极显著C2 8.46 1 8.46 59.55 <0.000 1 极显著残差 0.994 5 7 0.142 1失拟项 0.562 5 3 0.187 5 1.74 0.297 5 不显著纯误差 0.432 0 4 0.108 0总离差 27.22 16
各因素交互作用对大豆皮SDF得率影响的响应曲面如图6所示。
图6 各因素交互作用对大豆皮SDF得率影响的响应曲面
Fig.6 Response surface diagram of the influence of the interaction of various factors on the yield of soybean skin SDF
通过响应面进行回归分析,得出大豆皮SDF得率的二次回归方程为Y=12.36-0.150 0A+0.287 5B+0.387 5C+0.3000AB-0.1000AC+0.0250BC-1.34A2-1.12B2-1.42C2。矫正系数R2Adj=0.943 2,预测复相关系数R2=0.951 7,预测相关系数R2(Pred)=0.956 3,与预测复相关系数接近,回归模型极显著(P<0.01);失拟项 P=0.644 6>0.05,差异不显著(P>0.05),说明该回归模型的拟合度较高,试验误差小,可用该模型分析和预测不同条件下大豆皮SDF得率。各因素对大豆皮SDF得率影响因素的顺序为酶解时间>酶添加量>料液比。
2.2.2 工艺验证
利用Design Expert软件建立回归模型,模型结果显示,大豆皮SDF最优酶解工艺:料液比1∶19.766(g/mL)、酶添加量0.856%、酶解时间5.139 h,最优条件下大豆皮SDF得率为12.84%,为验证优化结果的可靠性,对工艺参数进行适当修正:料液比1∶20(g/mL)、酶添加量0.85%、酶解时间5 h,在此条件下,大豆皮SDF得率为12.71%,接近最优条件下大豆皮SDF得率,表明该模型具有良好的预测价值。
持水力、膨胀力及持油力是评价SDF品质的重要指标,较高的持水力、膨胀力及持油力可有效促进胃肠道蠕动,增加对胃肠道有毒物质的吸附能力,促进有毒物质的排出。大豆皮酶解前后理化指标的比较如图7所示。
图7 大豆皮酶解前后理化指标比较
Fig.7 Comparison of physicochemical indexes of soybean hulls before and after enzymatic hydrolysis
由图7可知,与酶解前比较,大豆皮SDF酶解后持水力、膨胀力及持油力均明显升高,其持水力、膨胀力及持油力分别为8.53%、5.22 mL/g及7.14%,表明利用酶法制备的大豆皮SDF具有较好的理化特性。
利用单因素试验结合Box-Behnken试验设计,以大豆皮SDF得率为考察指标,优化大豆皮SDF制备工艺,选用纤维素酶∶半纤维素酶=1∶1(质量比)作为水解酶,最终确定大豆皮SDF酶解的最佳工艺:料液比1 ∶20(g/mL)、酶添加量 0.85%、酶解时间 5 h、酶解温度45℃、酶解pH4.6,该工艺条件下SDF得率与模式预测值较为接近,表明工艺参数较为准确。结果表明,由酶法制备的大豆皮SDF具有良好的理化特性。
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