我国沙棘资源丰富，种植面积占全世界沙棘种植总面积的99%以上[1-2]。目前沙棘果主要应用于果汁的生产，榨汁后会产生20%的沙棘果残渣。据报道，我国沙棘产业每年可产生近百万吨的沙棘果渣[3-4]。这些果渣包括果皮、种子、残余果肉等，在这些果渣中仍然含有很多的有效物质，如黄酮、维生素B1、维生素B2、维生素C、维生素E、氨基酸、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、鞣质、糖、三萜及甾体类等[5]。这些被废弃的果渣不仅会造成资源的浪费，而且还会造成环境的污染。研究表明，沙棘果渣中的主要成分为天然多糖，且植物多糖是一种具有良好生物活性的天然抗菌剂和天然生物防腐剂。目前在工业生产中，已经有很成熟技术可以提取出副产物中的多糖[6]。
纳米银作为一种新型抗菌活性材料，以其自身抗菌功能特性较好、抗菌谱较广泛，且抗菌不容易引起宿主细胞感染产生抗耐药性反应等优点受到广泛关注[7-10]。由于天然多糖的生物相容性极佳，当其与纳米银协同使用时能够减少纳米银的用量，从而使纳米银的生物毒性降低[11-15]。因此，本试验以富含多糖的沙棘果渣为原料，选择大肠杆菌和白色葡萄球菌为食源性致病菌的代表，用单因素试验优化合成沙棘果渣多糖-纳米银工艺流程，并研究沙棘果渣多糖-纳米银对两种致病菌的抑制效果，为沙棘果渣的开发利用提供参考，同时可以为寻找新的可替代传统化学抑菌剂的植物源抑菌剂提供新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
沙棘果渣多糖：哈尔滨商业大学生物催化与发酵实验室自制；牛肉膏：北京奥博星生物技术有限责任公司；蛋白胨：北京索莱宝科技有限公司；琼脂：北京兰杰柯科技有限公司；大肠杆菌、白色葡萄球菌：哈尔滨商业大学生物催化与发酵实验室；NaCl：天津市鼎盛鑫化工有限公司；氢氧化钠：天津市大陆化学试剂厂；硝酸银：天津市科密欧化学试剂开发中心；盐酸：广东省精细化学品工程技术研究开放中心。以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
H2050R高速冷冻离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司；PHS-3C型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；W201B恒温水浴锅：上海申胜生物技术有限公司；UV5100B型紫外/可见分光光度计：上海元析仪器制造有限公司；PerkinElmer100傅立叶红外光谱：美国PerkinElmer公司；Nano-ZS90马尔文激光粒度仪：英国马尔文仪器有限公司；JJ200精密电子天平：美国双杰兄弟有限公司；FDU-1200真空冷冻干燥机：东京理化器械株式会社；LDZX-50KB高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；LRH-70F恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；SMP6酶标仪：美谷分子仪器（上海）有限公司；MIRA4扫描电镜：泰思肯有限公司。
1.3 方法
1.3.1 单因素试验设计
将浓度为50 mmol/L的硝酸银溶液和1 mg/mL沙棘果渣多糖溶液按0.5∶1的体积比混合，并在pH7和25℃条件下反应4 h，然后用波长365 nm的紫外光照射10 min辅助生成纳米银。在上述工艺条件基础上，以对沙棘果渣多糖-纳米银的紫外可见光谱和粒径影响为指标，进行单因素试验。分别考察反应时间（4、8、12、16、20、24 h）、反应温度（25、30、35、40、45 ℃）、硝酸银和沙棘果渣多糖的体积比（0.5∶1、1.0∶1、1.5∶1、2.0 ∶1、2.5∶1）、pH 值（7、8、9、10、11）、紫外照射时间（10、20、30、40、50、60 min）对沙棘果渣多糖-纳米银的紫外可见光谱和粒径影响。反应完成后10 000 r/min离心30 min，反复离心2次，去除上清液，收集沉淀，得到棕褐色沉淀即沙棘果渣多糖-纳米银复合粒子，冻干后置于-4℃冰箱备用。
1.3.2 表征分析
1.3.2.1 紫外可见光谱分析
将1.3.1制得的沙棘果渣多糖-纳米银溶液使用UV5100B型紫外/可见分光光度计进行分析，检测波长范围为300 nm～800 nm。
1.3.2.2 傅里叶红外光谱分析
分别将沙棘果渣多糖和沙棘果渣多糖-纳米银样品冷冻干燥后得到的固体粉末用傅立叶红外光谱仪测定。波长扫描范围为4 000 cm-1～500 cm-1。
1.3.2.3 粒径分析
用马尔文激光粒度仪进行粒径的检测。
1.3.2.4 扫描电镜分析
将少量沙棘果渣多糖-纳米银溶液滴于硅片表面，待样品干燥后，使用MIRA4扫描电镜观察颗粒形态。
1.3.3 抑菌试验
1.3.3.1 制备方法
参考李琴琴[16]的方法制备纳米银，将0.02 mol/L硝酸银溶液和3%聚乙烯吡咯烷酮溶液1∶1（体积比）混合，然后室温24℃搅拌2 h，最后在搅拌的同时，逐滴滴加10 mL的0.01%硼氢化钠溶液，即得到纳米银溶液。
用无菌水将沙棘果渣多糖、化学法制得的纳米银和单因素试验制得粒径最小的沙棘果渣多糖-纳米银这3种样品稀释成不同浓度。
1.3.3.2 抑菌试验方法
抑菌试验采用牛津杯琼脂板扩散法[17]。本试验以白色葡萄球菌和大肠杆菌为试验菌株。取适量菌液在固体培养基表面涂匀，将牛津杯（内径7.8mm）放置在平板上，然后添加 100 μL 不同浓度（5、10、15、20 μg/mL）的沙棘果渣多糖溶液、纳米银溶液和沙棘果渣多糖-纳米银溶液，置于37℃的恒温培养箱中培养，24 h后观察测量抑菌圈直径并记录结果。
1.3.4 最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）的确定
在96孔板中分别添加100 μL的大肠杆菌和白色葡萄球菌菌悬液，再分别添加100 μL不同浓度（1、2、3、4、5、6 μg/mL）的沙棘果渣多糖-纳米银溶液。将 96孔板置于37℃下培养24 h，每间隔1 h通过酶标仪测每孔在600 nm处的吸光值。每孔的最大吸光值和最小吸光值之差（阳性对照组的吸光值差值是最大的）可直接反映出细菌生长的情况，吸光值差值在负值区域表明其对应的处理能完全抑制供试菌的生长，吸光值差值为0时对应的抑菌剂浓度为最低抑菌浓度。根据公式（1）计算吸光值差值（ΔOD）。
式中：ODmax为最大吸光值；ODmin为最小吸光值。
1.4 数据处理
采用SPSS 2019对数据进行统计分析，Origin 2019进行绘图，以上所有试验均重复3次，结果取平均值，并以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 不同反应时间对沙棘果渣多糖-纳米银形成的影响
当反应时间分别为 4、8、12、16、20、24 h 时，对沙棘果渣多糖-纳米银的紫外可见光谱和粒径影响见图1。
图1 不同反应时间对复合颗粒紫外可见光谱和粒径的影响
Fig.1 Effects of different reaction times on UV and particle size of composite particle
如图1A所示，在波长为420 nm处出现一个较强的吸收峰，为纳米银的特征吸收峰，表明在沙棘果渣多糖的还原作用下，硝酸银被还原成单质状态的纳米银。随着反应时间的延长，紫外吸收峰逐渐升高，反应16 h后，增加幅度基本不变。这可能是由于反应时间越长，沙棘果渣多糖对硝酸银还原反应越充分，而当反应时间达到16 h后，还原反应基本完成，所以16 h后，峰值的增加幅度基本不变。如图1B所示，生成的沙棘果渣多糖-纳米银复合粒子的粒径随着反应时间的延长而减小。这是由于反应时间过短，反应不充分，影响了纳米银复合粒子成核，造成粒子的粒径过大。反应时间越长，反应越充分，所以粒子粒径越来越小。在反应时间为24 h时生成的沙棘果渣多糖-纳米银粒径最小，最小粒径为32.17 nm。所以选择反应24 h为最佳反应时间。
2.1.2 不同反应温度对沙棘果渣多糖-纳米银形成的影响
当反应温度分别为 25、30、35、40、45 ℃时，对沙棘果渣多糖-纳米银的紫外可见光谱和粒径影响见图2。
图2 不同反应温度对复合颗粒紫外可见光谱和粒径的影响
Fig.2 Effects of different reaction temperatures on UV and particle size of composite particle
如图2A所示，当反应温度为25℃～35℃时，随着反应温度的增加，紫外吸收峰也在增加，并在35℃时达到一个最大值。当反应温度为35℃～45℃时，随着反应温度的增加峰值逐渐降低。因为温度会改变反应速度，温度越高反应速度越快，生成的沙棘果渣多糖-纳米银复合粒子也增加，但温度过高可能使硝酸银转化为氧化银，所以温度过高峰值越低[18-19]。因此，35℃为最佳反应温度。如图2B所示，沙棘果渣多糖-纳米银的粒径先减小后增大，但不同反应温度对粒径的整体影响不大，在35℃时生成的沙棘果渣多糖-纳米银的粒径最小，最小粒径为76.9 nm。这是由于温度会影响粒子布朗运动，温度过高布朗运动加快，会加速纳米银粒子的团聚[20]。结合紫外-可见吸收光谱以及实际成本及设备维修率等问题，选择最佳反应时间为35℃。
2.1.3 不同硝酸银和沙棘果渣多糖的体积比对沙棘果渣多糖-纳米银形成的影响
当硝酸银和沙棘果渣多糖的体积比分别为0.5∶1、1.0 ∶1、1.5 ∶1、2.0∶1、2.5 ∶1时，对沙棘果渣多糖-纳米银的紫外可见光谱和粒径影响见图3。
图3 不同体积比对复合颗粒紫外可见光谱和粒径的影响
Fig.3 Effects of different volume ratios on UV and particle size of composite particle
如图3A所示，随着硝酸银溶液体积的增加，紫外吸收峰也在增大，在硝酸银溶液与沙棘果渣多糖溶液体积比为1.0∶1时峰值达到最大值，之后随着硝酸银溶液体积的增加，峰值逐渐减小。所以硝酸银溶液与沙棘果渣多糖溶液体积比为1.0∶1为最佳反应条件。如图3B所示，以0.5∶1的体积比制备的沙棘渣多糖-纳米银颗粒尺寸最小，其最小颗粒直径为55.3 nm。当硝酸银溶液与沙棘果渣多糖溶液的体积比为1.0∶1时的粒径与体积比为0.5∶1时的粒径大小相差甚微。研究表明，硝酸银的含量会影响粒径的大小，硝酸银含量过多，生成的粒子容易聚集，造成粒子粒径过大；而硝酸银含量低，生成的粒子逐渐变成球形，且粒径逐渐变小[21]。所以硝酸银含量越低，所生成沙棘果渣多糖-纳米银的粒径越小。结合图3A结果，选择体积比1.0∶1为最佳反应条件。
2.1.4 不同pH值对沙棘果渣多糖-纳米银形成的影响
当 pH 值分别为 7、8、9、10、11 时，对沙棘果渣多糖-纳米银的紫外可见光谱和粒径影响见图4。
图4 不同pH值对复合颗粒紫外可见光谱和粒径的影响
Fig.4 Effect of different pH values on UV and particle size of composite particle
如图4A所示，随着pH值的增加，紫外吸收峰也在增大，在pH9时峰值达到最大值，随后随着pH值的增加峰值减小。可能是因为随着pH值的升高，沙棘果渣多糖的还原性增强，促使Ag+还原成单质银。但pH值过高导致单质银过多，造成纳米银含量低，进而峰值下降。同时可看出，强碱性条件下峰值更高，弱碱性条件下峰值较低。如图4B所示，在反应溶液pH9时生成的沙棘果渣多糖-纳米银的粒径最小，最小粒径为96.78nm。不同pH值反应溶液所制得的沙棘果渣多糖-纳米银的粒径相比于其他单因素条件下所制得的沙棘果渣多糖-纳米银的粒径较大，原因可能是在调节pH值时，由于硝酸银在碱性条件下容易生成氧化银，导致反应液不稳定。综上所述，pH9为最佳反应条件。
2.1.5 不同紫外照射时间对沙棘果渣多糖-纳米银形成的影响
当紫外照射时间分别为 10、20、30、40、50、60 min时，对沙棘果渣多糖-纳米银的紫外可见光谱和粒径影响见图5。
图5 不同紫外照射时间对复合颗粒紫外可见光谱和粒径的影响
Fig.5 Effect of different UV irradiation times on UV and particle size of composite particle
如图5A所示，随着紫外照射时间的延长，紫外吸收峰也随之增加。如图5B所示，紫外照射时间越长，所制得的沙棘果渣多糖-纳米银的粒径越小，当紫外照射时间达到40 min后，纳米银粒径几乎不变。当紫外照射60 min时，其粒径最小，为44.54 nm。结合紫外可见吸收光谱，在紫外照射时间为60 min时，峰值最高。因此，选择紫外照射60 min为最佳反应条件。
2.2 沙棘果渣多糖-纳米银结构表征
2.2.1 粒径和扫描电镜分析
通过单因素试验结果，确定反应温度35℃、pH9、硝酸银溶液与多糖溶液的体积比1.0∶1、反应时间24h、紫外照射60 min条件下反应制得的纳米银粒径最小，将该条件下制得的沙棘果渣多糖-纳米银用于扫描电镜和粒径表征，结果如图6所示。
图6 沙棘果渣多糖-纳米银的扫描电镜和粒径分析图
Fig.6 SEM image and particle size image of seabuckthorn pomace polysaccharide-silver nanoparticle
由图6可知，沙棘果渣多糖-纳米银粒子的粒径平均粒径为31.77 nm，其形状多呈类球状。图6B中峰（1）的平均粒径在69.14 nm，相对强度为80.3%，表明在沙棘果渣多糖-纳米银溶液中，更多颗粒呈单分散分布。然而，峰（2）的相对强度为19.7%，表明很少有颗粒是多分散的，并且在某些地方出现团聚。
2.2.2 红外光谱分析
将沙棘果渣多糖和沙棘果渣多糖-纳米银进行红外表征，旨在找出沙棘果渣多糖中参与还原纳米银的相关有机基团。沙棘果渣多糖和沙棘果渣多糖-纳米银的红外光谱见图7。
图7 沙棘果渣多糖和沙棘果渣多糖-纳米银的红外光谱
Fig.7 Infrared spectrogram of seabuckthorn pomace polysaccharides and seabuckthorn pomace polysaccharide-silver nanoparticle
如图7所示，在3 312 cm-1附近的特征宽吸收带为沙棘果渣多糖中羟基的拉伸振动，在形成沙棘果渣多糖-纳米银后特征峰红移至3 296 cm-1处，并且特征峰面积有所降低，这可能由纳米银和沙棘果渣多糖结构中羟基之间的相互作用引起的[22]。在沙棘果渣多糖的红外光谱中，在2 918 cm-1处对应于C-H的对称和非对称伸缩振动，该峰在沙棘果渣多糖-纳米银的红外光谱中明显减弱，且1 543 cm-1处出现一个代表C=C伸缩振动的新峰，说明纳米银的生成过程与沙棘果渣多糖中亚甲基有关[14]。在1 632 cm-1处可能是酰胺的羰基拉伸模式。在1 308 cm-1和1 297 cm-1处的尖峰是由于沙棘果渣多糖和沙棘果渣多糖-纳米银中羧基功能的对称拉伸所致。1 014 cm-1和1 002 cm-1处的峰值归因于醇和醚键的C-O-C拉伸[23-24]。
2.3 抑菌试验结果
不同浓度的沙棘果渣多糖、纳米银和沙棘果渣多糖-纳米银对大肠杆菌和白色葡萄球菌进行牛津杯抑菌试验，结果如图8所示。
图8 沙棘果渣多糖、纳米银和沙棘果渣多糖-纳米银对大肠杆菌和白色葡萄球菌的抑菌圈直径
Fig.8 Inhibition zone diameter of seabuckthorn pomace polysaccharides，nano silver，and seabuckthorn pomace polysaccharide-silver nanoparticle against Escherichia coli and Staphylococcus albus
由图 8 可知，当浓度在 5 μg/mL～20 μg/mL 时，化学法制成的纳米银和沙棘果渣多糖-纳米银对大肠杆菌有很好的抑制作用，且沙棘果渣多糖-纳米银的抑制效果最好。两种纳米银抑菌作用都随着浓度的增加而增强，且整体对大肠杆菌的抑制作用强于白色葡萄球菌。Kvítek等[25]研究表明纳米银具有很强的抑菌活性，特别是对革兰氏阳性菌，这可能是由于细菌细胞膜的结构和化学组成的不同。但在此浓度下，沙棘果渣多糖对两种供试菌均没有呈现抑制区域。
2.4 沙棘果渣多糖-纳米银最低抑菌浓度（MIC）的确定
通过文献[26]可知，尺寸更小、表面积更大的纳米银颗粒具有更高的杀菌性能，因其可以增大细菌细胞膜的通透性从而导致细胞死亡。所以本试验测定31.77 nm粒径的沙棘果渣多糖-纳米银对两种供试菌的MIC值，结果见图9。
图9 沙棘果渣多糖-纳米银对两种供试菌的MIC
Fig.9 MICs of seabuckthorn pomace polysaccharide-silver nanoparticle against the two strains
由图9可知，沙棘果渣多糖-纳米银能明显抑制影响大肠杆菌和白色葡萄球菌的生长，且抑菌性随着复合纳米颗粒的浓度升高而增强，ΔOD值在负值区域表明能完全抑制供试菌的生长。在相同浓度下，沙棘果渣多糖-纳米银对大肠杆菌的抑制作用比对白色葡萄球菌的抑制作用强。大肠杆菌的最小抑制浓度为4 μg/mL，白色葡萄球菌的最小抑制浓度为6 μg/mL。
3 结论
本文采用沙棘果渣多糖还原硝酸银中的银单质，以制备沙棘果渣多糖-纳米银，并通过单因素试验得出，1 mg/mL沙棘果渣多糖溶液和50 mmol/L硝酸银溶液，在硝酸银和沙棘果渣多糖体积比1.0∶1、反应温度35℃、pH9时反应24 h后，在365 nm紫外灯下照射60 min条件下，生成的沙棘果渣多糖-纳米银含量最高，粒径最小。经粒度仪和SEM分析可知沙棘果渣多糖-纳米银多为球形，最小平均粒径为31.77 nm。对比分析沙棘果渣多糖、化学法制备的纳米银和沙棘果渣多糖-纳米银三者对大肠杆菌和白色葡萄球菌的抑菌效果，结果表明在较低浓度下，沙棘果渣多糖-纳米银的抑菌效果优于化学法制的纳米银，而沙棘果渣多糖对白色葡萄球菌没有明显抑制作用。两种纳米银对大肠杆菌的抑菌圈直径均大于白色葡萄球菌的抑菌圈直径，这说明大肠杆菌比白色葡萄球菌对两种纳米银更敏感。沙棘果渣多糖-纳米银的最低抑菌浓度测定试验得出对大肠杆菌的MIC为4 μg/mL，对白色葡萄球菌的MIC为6 μg/mL。因此该法成功制备的沙棘果渣多糖-纳米银具有良好的抑菌性能，可以为新型抑菌剂在食品行业中的开发和应用提供参考。
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