超声波辅助pH偏移处理对猪肝蛋白结构及乳化特性的影响

陆今明1,彭松林1,杨凯麟1,耿宏庆1,尚永彪1,2*

(1.西南大学食品科学学院,重庆 400715;2.川渝共建特色食品重庆市重点实验室,重庆 400715)

摘 要:该文探讨不同方法改性处理对猪肝蛋白(porcine liver protein,PLP)结构功能特性的影响。通过超声波处理、pH偏移处理和超声波辅助pH偏移处理对PLP进行改性,测定改性PLP的溶解度、表面疏水性、乳化特性、巯基含量、粒径、Zeta电位、一级和三级结构等指标及其变化情况。结果表明,超声处理会使PLP粒径减小,溶解度与Zeta电位绝对值增大;将PLP溶液调至pH3随后调回至中性(pH3-7),会使PLP粒径增大,溶解度与Zeta电位绝对值下降,超声辅助pH偏移处理后(pH3U-7)会使蛋白粒径下降,溶解度与Zeta电位绝对值增加但效果并不明显;将PLP溶液调至pH9随后调回至中性(pH9-7)及加入超声处理(pH9U-7)会使蛋白粒径减小,溶解度及Zeta电位绝对值增大。酸碱pH偏移及超声复合处理均降低PLP的荧光强度、活性巯基含量。电泳结果显示,pH3-7可能导致PLP的二硫键聚集,pH9-7对电泳条没有明显影响,超声的加入不会进一步改变电泳条带。相较于对照组,超声处理、pH9-7组和pH9U-7组均提高PLP乳化活性和乳液稳定性,而pH3-7及pH3U-7组的乳化活性与乳液稳定性降低。

关键词:超声波;pH偏移;猪肝蛋白;分子结构;乳化特性

猪肉是全球消费最多的肉类产品,与此同时猪肝、猪肺等副产品产量也随之增加。猪肝中蛋白质含量高达20%且富含必需氨基酸,营养价值高。但因猪肝具有特殊的腥味且嘌呤和胆固醇含量较高,因此,在实际工业生产中猪肝通常会被加工成饲料,在食品工业中也仅有少量被加工成猪肝糜和猪肝香肠等产品,这影响了猪肝的开发利用,其价值难以得到充分的体现。猪肝蛋白(porcine liver protein,PLP)是猪肝的主要成分,猪肝蛋白资源的有效利用是猪肝资源开发的关键。然而,有研究报道从肝脏中分离的蛋白功能特性较差[1],蛋白质的加工过程通常需要热力干燥,因此会进一步降低其功能特性,阻碍了其在食品中的应用。

为扩大天然食品中蛋白质的应用,通常会采用物理、化学和生物方法改善蛋白功能特性。其中,超声波被认为是改变液体介质中食品成分性质的一种非热处理加工技术,超声过程中产生的空化作用会改变蛋白质结构,空化和湍流的结合能减小蛋白的粒径,且与传统的热处理相比,超声对加工食品的营养和感官影响更小。丁景[2]研究超声波对水溶性猪肝蛋白乳化特性的影响,发现随着超声波功率升高和时间延长,水溶性猪肝蛋白的乳化活性及其稳定性均表现先增加后减小趋势。除物理处理外,pH偏移处理也能改变蛋白的结构及功能特性。pH偏移处理是将蛋白质暴露在碱性或酸性条件下一段时间使蛋白质发生去折叠,然后调节pH值至中性,使蛋白质发生重折叠,重新折叠的蛋白质往往不能恢复到原本构象,从而引起蛋白质结构与功能的变化。pH偏移处理是一种通过改变电荷的方式来调控蛋白分子间及分子内静电排斥作用力,从而使蛋白发生结构改变的化学修饰方法。pH偏移技术对蛋白的营养价值破坏较小,过程操作简单,参数易于控制。目前pH偏移处理技术的研究多用于植物蛋白改性领域[3],在动物内脏蛋白质改性中的应用研究相对较少。Lu等[4]研究肌原纤维蛋白(myofibrillar protein,MP)在 pH11-7、pH11.5-7和 pH12-7碱性 pH 偏移条件的界面流变性能,结果表明与未处理MP相比,重折叠MP的分子变化导致蛋白质向O/W界面的吸附速度加快,被吸附的蛋白分子间相互作用增强,界面膜的弹性提高,表明碱性pH偏移调控界面行为可能是一种适用于食品工业中肉蛋白乳剂的开发方法。Lu等[1]研究不同pH值条件下琥珀酰化鸡肝蛋白(chicken liver protein,CLP)结构与乳化特性之间的关系,结果表明随着pH值的升高,CLP的溶解度和吸油能力增加,有利于其乳化性能的改善。

本研究将超声波改性处理与pH偏移改性处理相结合,测定改性PLP的溶解度、表面疏水性、乳化特性、巯基含量、粒径、Zeta电位、一级和三级结构等指标及其变化情况,为猪肝资源的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

新鲜猪肝:市售;透析袋(分子截留量8 000 Da~14 000 Da):北京怡美妙科技有限公司;一级玉米油:山东三星玉米科技有限公司;SDS-PAGE凝胶试剂盒:北京索莱宝科技有限公司。

1.1.2 试剂

无水磷酸二氢钠、无水磷酸氢二钠、5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)、考马斯亮蓝R-250:上海麦克林生化科技有限公司;氢氧化钠、乙二胺四乙酸、甲醇、无水乙醇:成都市科隆化学品有限公司;盐酸、酒石酸钾钠、冰醋酸:宁波大川精细化工有限公司;五水硫酸铜:广东光华科技有限公司;8-苯胺基-1-萘磺酸铵:上海源叶生物科技有限公司;甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠、牛血清蛋白:德国Biofroxx公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TGL-16高速冷冻离心机:四川蜀科仪器有限公司;JS39D-250多功能食品加工机:浙江苏泊尔股份有限公司;XHF-D内切式匀浆机、SCIENTZ-1500F超声波分散仪:宁波新芝生物科技股份有限公司;EMS-20磁力搅拌水浴锅:常州朗越仪器制造有限公司;UV-5100紫外可见分光光度计:上海元析仪器有限公司;PowerPacTM Basic小型垂直电泳仪:美国Bio-Rad公司;LGJ-10真空冷冻干燥机:北京松源华兴科技发展有限公司;ZEN3690马尔文激光粒度分析仪:英国马尔文仪器有限公司;PHS-4C+酸度计:成都世纪方舟科技有限公司;F-2500荧光分光光度计:日本日立公司;BX53荧光正置显微镜:日本OLYMPUS公司。

1.3 试验方法

1.3.1 猪肝蛋白的提取

参照Steen等[5]的方法并稍作修改。用绞肉机将猪肝打成猪肝泥,随后加入3倍体积的由磷酸二氢钠与磷酸氢二钠配制而成的缓冲溶液(0.05 mol/L、pH7.4),用匀浆机以10 000 r/min匀浆1.5 min;将匀浆物离心20 min(9 000 r/min、4℃)后过 4层纱布收集滤液,所得沉淀用绞肉机搅碎后继续加入缓冲溶液,重复上述操作2次,将3次所得的滤液合并后用透析袋透析脱盐48 h(4 h换水1次),冷冻干燥60 h即为猪肝蛋白,通过凯氏定氮法测定蛋白含量(N以6.25计算)为(87.67±0.80)g/100 g,用密封袋将PLP封好后置于-18℃冰箱保存备用。

1.3.2 猪肝蛋白浓度的测定

参考Cui等[6]的试验方法,使用双缩脲试剂测定PLP溶液蛋白质浓度。

1.3.3 样品处理

用超纯水配制10 mg/mL PLP溶液,冰水浴磁力搅拌30 min使其充分溶解。

pH偏移处理:用2 mol/L HCl和2 mol/L NaOH分别将PLP溶液的pH值调节至3和9,在冰水浴磁力搅拌下处理30 min,然后用相应的碱或酸将pH3和pH9的蛋白溶液pH值调至7,冰水浴磁力搅拌下平衡15 min,将处理样品记为pH3-7和pH9-7。

超声波处理:将蛋白溶液进行超声波处理,超声波频率为20 kHz,变幅杆直径15 mm,超声功率300 W,超声程序为工作3 s,停止3 s,处理总时长5 min。超声波处理过程中对样品进行冰浴降温处理,处理完毕后蛋白样品温度均在30℃以下,记为U。

超声波辅助pH偏移处理:将蛋白溶液pH值调整为3和9后进行超声波处理,随后用相应的碱或酸将溶液pH值调至7。冰水浴磁力搅拌下平衡15 min,记为pH3U-7和pH9U-7。

对照:蛋白溶液pH值调整为7后,在冰水浴磁力搅拌30 min。

所有处理完毕的蛋白样品用塑封膜封口,置于4℃冰箱保存,72 h内使用。

1.3.4 蛋白溶解度的测定

参考Agyare等[7]的方法。将处理过的PLP溶液用超纯水稀释成2.5 mg/mL,冷冻离心15 min(5 500 r/min、4℃),取上清液,用双缩脲法测定PLP溶解度。将离心前溶液中蛋白的浓度和离心后上清液蛋白的浓度(mg/mL)分别命名为C0和C1,蛋白溶解度计算公式如下。

1.3.5 表面疏水性的测定

参考 Yu 等[8]方法,采用 8-苯氨-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS)荧光探针法测定PLP的表面疏水性并稍作修改。将PLP溶液浓度调至0.25 mg/mL,于4.0 mL蛋白溶液中加入20 μL 8 mmol/L ANS溶液,避光振荡均匀15 min后,用荧光光度计测定其荧光强度。设定激发波长390 nm,发射波长400 nm~600 nm,两种狭缝宽度均为5 nm,电压为400 mV。

1.3.6 乳化活性指数的测定

参考Pearce等[9]和Agyare等[7]的方法并稍作修改。配制2.5 mg/mL蛋白溶液,取2.0 mL大豆油和6.0 mL蛋白溶液于塑料离心管中,10 000 r/min匀浆30 s后立即从离心管底部吸取50 μL乳液,加入5 mL 0.1%十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)溶液,混合均匀后用紫外可见分光光度计在500 nm处测定其吸光度,记作A0。以50 μL超纯水加入5 mL 0.1%SDS溶液作为空白对照。PLP乳化活性指数(emulsifying activity,EAI)计算公式如下。

式中:ρ为油相体积分数(油的体积/乳化体系的体积);φ为蛋白质浓度,0.0025g/mL;A0为乳化液在0 min时的吸光度;稀释倍数为101。

1.3.7 乳液稳定性的测定

参考Lu等[1]的方法并稍作修改,使用紫外分光光度计于500 nm处测定30 min乳液的浊度(A500)值,以此来表示乳液的乳化稳定性。

1.3.8 乳液光学显微镜观测

从均质好的乳液底部立即取出10 μL乳液置于荧光正置显微镜下,在10倍目镜、10倍物镜的视野条件下观察并拍照。

1.3.9 活性巯基的测定

参考Beveridge等[10]与Gao等[11]的方法测定PLP中的游离巯基含量,并稍作修改。将PLP用缓冲液[0.086 mol/L三羟甲基氨基甲烷、0.09 mol/L甘氨酸和4 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA),pH8]稀释为浓度 1 mg/mL 的蛋白溶液。将3 mL蛋白溶液与0.03 mL 4 mg/mL 5,5'-二硫双-2-硝基苯甲酸[5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid),DNTB]溶液振荡混匀,于30℃避光水浴30 min,使用紫外分光光度计于412 nm测定吸光度,以缓冲液和蛋白溶液为空白,活性巯基含量计算按公式如下。

式中:A412为蛋白溶液在412 nm处的吸光度;D为稀释因子;C为蛋白质浓度,1 mg/mL;73.53由 106/1.36×104计算,其中 1.36×104为摩尔吸收率。

1.3.10 粒径分布及Zeta电位的测定

参考吴佳[12]的方法并稍作修改。将所有样品用超纯水分别配制成1 mg/mL PLP溶液,用粒度分析仪测定,记录其粒径分布。Zeta电位测定:将所有样品稀释成1 mg/mL PLP水溶液,用粒度分析仪测定其电位。

1.3.11 聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)的测定

参考Li等[13]的方法并适当修改。按照SDS-PAGE凝胶试剂盒制作浓度分别为12%、5%的分离胶与浓缩胶。将蛋白样品(2.5 mg/mL)与上样缓冲液按体积比4∶1混合密封后,于100℃煮沸5 min后待其自然冷却。取20 μL注入浓缩胶泳道中,浓缩电压为60 mV,分离电压为80 mV。凝胶用考马斯亮蓝R-250染色,然后脱色并使用照相机拍照。

1.3.12 紫外可见分光光谱的测定

参考王立等[14]的方法并稍作修改。配制0.25mg/mL PLP溶液,在室温25℃条件对PLP溶液进行紫外可见光谱扫描,以超纯水的光谱作为空白光谱。紫外条件:扫描范围200 nm~500 nm,扫描速度300 nm/min,步长1 nm。

1.3.13 荧光光谱的测定

参考Gao等[11]的方法并稍作修改。用超纯水配制0.25 mg/mL PLP溶液,用荧光分光光度计对PLP溶液三级结构进行分析。荧光条件:光程为1 cm的石英比色皿,激发波长为280 nm,发射光谱范围为300 nm~460 nm,激发和发射狭缝宽度为5 nm,电压为400 mV,扫描速度为300 nm/min。

1.3.14 数据处理

每个处理组进行3次平行试验,结果以平均值±标准差表示。Excel 2016进行数据处理,Origin 2018 pro软件进行绘图,SPSS Statistics 25.0进行显著性分析,P<0.05表明结果具有显著差异。

2 结果与分析

2.1 超声波辅助pH偏移处理对PLP溶解度的影响

蛋白质溶解度与蛋白质乳化性等功能特性密切相关,溶解度是蛋白其他功能性质的基础。不同处理对PLP溶液溶解度的影响试验结果见图1。

图1 超声波辅助pH偏移处理对PLP溶解度的影响
Fig.1 Effect of ultrasonic treatment combined with pH-shifting on solubility of PLP

由图1可知,不同pH偏移处理对PLP的溶解度有不同的影响,与对照组溶解度(41.76%)相比,pH9-7组溶解度显著增加至53.60%(P<0.05),其原因可能是碱性条件下破坏了蛋白的疏水相互作用,从而提升了蛋白溶解度;而pH3-7组使PLP溶解度显著降低(P<0.05),原因可能是酸性环境下,蛋白分子为适应环境发生了去折叠现象,在pH值调回中性的重折叠过程中,经过等电点时,蛋白颗粒间相互碰撞、聚集沉淀,形成较大颗粒,继续调回中性时的电荷作用不足以使沉淀的蛋白再次溶解,从而降低了PLP的溶解度[15]。中性条件下进行超声处理,PLP溶解度显著提升至72.89%(P<0.05);经过酸性pH偏移处理的2个处理组中,超声处理组与未超声处理组相比,PLP溶解度有所提高但无显著差异(P>0.05);经过碱性pH偏移处理的2个处理组中,超声处理组与未超声处理组相比,PLP溶解度得到显著提升(P<0.05),且与对照组相比PLP的蛋白质溶解度提高了近1倍,其原因可能是由于空化作用产生机械冲击导致蛋白质结构部分展开,使疏水和静电相互作用以及氢键等非共价相互作用遭到破坏,并且增强蛋白质和水分子之间相互作用[16]。以上结果表明,碱性pH偏移过程中结合超声波处理,在提升蛋白溶解度方面具有协同作用。此试验结果与Silventoinen等[17]研究pH偏移和超声处理对大麦分离蛋白溶解度的影响中得到的结果类似。

2.2 超声波辅助pH偏移对PLP表面疏水性的影响

表面疏水性的大小与蛋白质乳化特性密切相关,可以利用蛋白质暴露的疏水氨基酸残基含量来表征蛋白质的疏水性[18]。超声波辅助pH偏移对PLP表面疏水性的影响如图2所示。

图2 超声波辅助pH偏移处理对PLP表面疏水性的影响
Fig.2 Effect of ultrasonic treatment combined with pH-shifting on surface hydrophobicity of PLP

由图2可知,相较于对照组,经过处理后PLP表面疏水性提升明显。在仅pH偏移处理中,pH3-7组的表面疏水性较pH9-7组显著增加(P<0.05),表明PLP可能在酸性偏移过程中变性程度更大,重折叠程度更小,从而使表面疏水基团更多的暴露于蛋白质分子表面;pH9-7组表面疏水性较对照组差异显著(P<0.05),但增幅不及pH3-7组,可能是因为碱性环境下PLP未严重变性,使PLP具有较高的重折叠程度。唐小丹[19]在研究酸或碱处理对罗非鱼水溶性蛋白表面疏水性的影响时也发现,与对照组相比,酸碱处理后罗非鱼蛋白表面疏水性均有提高。pH3U-7组与pH3-7组表面疏水性未表现出明显差异,酸性条件下的超声,使PLP更能适应酸性环境,但在pH值调回中性的重折叠过程中,依然会产生聚集沉淀。单独超声处理(U)、碱性pH偏移条件下超声(pH9U-7)明显提高了PLP表面疏水性,超声处理的加入使原本的蛋白聚集体分散,暴露出更多的疏水氨基酸,而碱性pH偏移条件下使PLP远离等电点而具有较高的静电互斥作用,超声处理使PLP表面疏水性进一步增加。类似的研究结果也出现在超声处理豌豆蛋白[20]中。

2.3 超声波辅助pH偏移对PLP乳化活性的影响

乳化活性(EAI)的大小表示蛋白质在界面上吸附能力的强弱,是蛋白重要的功能指标。超声波辅助pH偏移处理对PLP乳化活性的影响如图3所示。

图3 超声波辅助pH偏移处理对PLP乳化活性的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic treatment combined with pH-shifting on emulsifying activity of PLP

如图3所示,相较于对照组,碱性pH偏移蛋白(pH9-7)的EAI显著提高(P<0.05),而酸性pH 偏移蛋白(pH3-7)的 EAI显著降低(P<0.05),其原因可能是pH3-7组降低了蛋白的溶解度,使其不能更好地包裹油脂[11];碱性pH偏移条件下的PLP有更高的溶解度,有利于蛋白质在油水界面中更均匀、有效地展开和分散,从而提高蛋白的乳化活性[8]。对照组超声处理的加入,使PLP的乳化活性显著提高(P<0.05),而在pH3U-7组条件下,乳化活性相较于pH3-7组有一定程度提高,但无显著性差异(P>0.05),pH9U-7组的乳化活性在pH9-7组的基础上进一步提高。研究表明,超声波改善蛋白质的乳化活性,是因为超声能提高溶解度,使蛋白粒径朝着更小的方向移动[11]

2.4 超声波辅助pH偏移对PLP乳液稳定性的影响

超声波辅助pH偏移处理后PLP乳液稳定性如图4所示。

图4 超声波辅助pH偏移处理对PLP乳液稳定性的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic treatment combined with pH-shifting on the stability of PLP emulsion

如图4所示,与对照组的乳液稳定性相比,pH3-7组显著降低了乳液稳定性(P<0.05),pH9-7组显著提高了乳液稳定性(P<0.05);在pH偏移条件下,超声处理显著提高了乳液稳定性(P<0.05),且pH3U-7组的乳液稳定性低于pH9U-7组乳液稳定性。超声处理能提高蛋白质乳液稳定性,原因可能是超声波破坏了使蛋白聚集的非共价键作用力,使蛋白质结构展开,暴露出较多的疏水基团,有利于其在油-水界面中的重排、相互作用以及在油-水界面中形成更稳定的膜[11]。以上结果说明碱性pH偏移联合超声可以提高PLP乳液稳定性,而酸性pH偏移处理不利于PLP乳液的形成与稳定。

2.5 超声波辅助pH偏移对PLP乳液显微结构的影响

通过显微镜观察乳液液滴能直观了解乳液粒径的大小及分布情况,可以用来表征乳液的稳定性。超声波辅助pH偏移处理后PLP乳液状态如图5所示。

图5 超声波辅助pH偏移处理对PLP乳液显微结构的影响(200 μm)
Fig.5 Effect of ultrasonic treatment combined with pH-shifting on microstructure of PLP emulsion(200 μm)

如图5所示,对照组乳液液滴明显大于超声、pH9-7组和pH9U-7组,而pH3-7组形成的液滴较对照组大而零散分布,在超声的作用下液滴粒径有所减小,但零散分布的状态没有改变。与仅碱性pH偏移处理(pH9-7)蛋白乳液相比,碱性pH偏移-超声复合处理(pH9U-7)的蛋白乳液液滴密度大,分布均匀,粒径范围变窄。通常情况下制成乳液的蛋白粒径越小,其在乳液的界面覆盖速度越快,吸附速率越高。此结果也证明了碱性pH偏移-超声复合处理有更好的乳液稳定性。

2.6 超声波辅助pH偏移对PLP活性巯基的影响

超声波辅助pH偏移处理对PLP活性巯基的影响如图6所示。

图6 超声波辅助pH偏移处理对PLP活性巯基的影响
Fig.6 Effect of ultrasonic treatment combined with pH-shifting on active sulfhydryl group of PLP

如图6所示,pH偏移和超声波处理均影响PLP中活性巯基(R-SH)的含量。与对照组相比,酸、碱性pH偏移均使活性巯基含量显著下降(P<0.05),酸、碱性条件下R-SH含量较低可能是由于二硫键的产生。在酸、碱性条件下,硫代基团更容易与巯基离子发生反应,加速氧化过程。在pH偏移条件下,超声处理后PLP中R-SH含量均有一定程度降低,但无显著差异(P>0.05),这可能与超声功率、处理时间有关[20]。仅超声处理会使活性巯基显著下降(P<0.05),原因可能是超声处理能诱导二硫键形成,同时超声可以使水分子产生自由基[21],进而可以氧化敏感官能团,如将R-SH氧化成亚磺酸[22]。Pezeshk等[20]在研究pH偏移处理结合超声波处理对虹鳟鱼副产物蛋白质结构和功能特性的影响时,发现超声波使虹鳟鱼副产物蛋白中R-SH含量出现不同程度下降。Figueroa-gonzález等[23]在研究超声辅助pH偏移处理苋菜蛋白时,也发现酸碱性pH偏移均使活性巯基显著降低,超声处理进一步降低活性巯基含量,与本试验结果一致。

2.7 超声波辅助pH偏移对PLP粒径分布和Zeta电位的影响

超声波辅助pH偏移对PLP粒径分布和Zeta电位的影响如图7所示。

图7 超声波辅助pH偏移处理对PLP粒径分布和Zeta电位的影响
Fig.7 Effect of ultrasonic treatment combined with pH-shifting on particle size distribution and Zeta potential of PLP

蛋白质粒径的大小会影响蛋白质的溶解度和乳化性等功能特性。如图7A所示,对照组粒径主要集中在100 nm~1 000 nm和1 000 nm~10 000 nm,pH3-7处理组粒径分布范围明显向右移动,其原因可能是PLP在酸性环境下,为适应环境蛋白分子发生去折叠,在pH值调回中性的重折叠过程中,经过等电点时,为疏水基团聚集创造了条件使其聚集沉淀,形成较大颗粒,继续调回中性的过程中作用力不足以使沉淀的蛋白再次溶解;也有可能是PLP内部疏水基团暴露并通过疏水相互作用等作用力形成较大聚集体。而在pH9-7组及pH9U-7组中,蛋白的粒径分布较对照组均明显向左移动,其原因可能是在远离等电点的碱性pH9条件下,蛋白质之间产生了更强的静电斥力,阻碍了蛋白质聚集物的形成,并且超声过程中产生的空化作用力及剪切力会使得蛋白质聚集体中的非共价键断裂,导致蛋白粒径减小。研究结果与Fang等[24]发现大豆分离蛋白在pH12碱性条件和超声处理5 min的条件下蛋白粒径减小的结论一致。

Zeta电位可以反映溶液蛋白的表面电荷大小,通常Zeta电位绝对值较高的体系,分子间的互斥效应明显,不易发生聚集。如图7B所示,观察电位绝对值发现,与对照组(20.1 mV)相比,pH3-7组电位绝对值显著下降至17.2 mV(P<0.05),其原因可能是PLP粒径增大,包埋了部分带电氨基酸;而pH9-7组电位绝对值显著增加到22.9 mV(P<0.05),可能是由于碱性偏移条件下蛋白侧链结构展开,使更多的带电基团暴露。超声后的PLP电位绝对值均比未超声时有所增加,可能是由于超声处理后破坏PLP非共价键作用,将更多带电氨基酸暴露在蛋白分子表面。研究结果与Li等[13]在研究超声-pH偏移处理菜籽蛋白时电荷变化趋势基本一致。

2.8 超声波辅助pH偏移对PLP SDS-PAGE的影响

SDS-PAGE能表示蛋白的种类及分子量分布情况。超声波辅助pH偏移处理后PLP SDS-PAGE结果如图8所示。

图8 超声波辅助pH偏移处理对PLP SDS-PAGE的影响
Fig.8 Effect of ultrasonic treatment combined with pH-shifting on SDS-PAGE of PLP

如图8所示,观察对照组发现,PLP分子量主要集中在 10 kDa~15 kDa与 25 kDa~200 kDa,在高于 40 kDa范围内有较深的条带,说明PLP有较高的分子量。与对照组相比,碱性pH偏移处理(pH9-7)同对照组相比无明显差异,而pH3-7组蛋白电泳条带变得模糊,浓缩胶顶部有更深的条带,推测其原因可能是酸性pH偏移处理(pH3-7)形成的二硫键造成了蛋白质聚集,有研究报道酸性pH偏移-超声处理苋菜蛋白也有类似高分子量蛋白质聚集体的形成[23]。pH3-7组、pH9-7组在超声处理后,蛋白电泳条带没有明显变化,说明超声波辅助pH偏移处理并没有改变蛋白一级结构。在研究超声波处理紫贻贝蛋白[25]及乌贼蛋白[26]时也发现了超声波处理并未导致蛋白一级结构发生变化。

2.9 超声波辅助pH偏移对PLP三级结构的影响

超声波辅助pH偏移处理PLP紫外光谱和内源荧光光谱如图9所示。

图9 超声波辅助pH偏移处理对PLP三级结构的影响
Fig.9 Effect of ultrasonic treatment combined with pH-shifting on the tertiary structure of PLP

紫外光谱和蛋白质内源荧光光谱的变化反映了PLP三级结构的变化情况。如图9A所示,对照组与处理组在290 nm处出现特征吸收峰,经超声波辅助pH偏移处理后该特征吸收峰面积发生明显改变,峰面积大小依次为pH3-7组、pH3U-7组、对照组、U组、pH9-7组和pH9U-7组,这可能是由于PLP经过超声辅助pH偏移处理后PLP侧链氨基酸结构遭到破坏,导致PLP三级结构改变,从而造成了紫外光谱的变化。如图9B所示,对照组有最大的荧光强度,pH偏移处理的蛋白荧光强度均有所下降,且pH3-7组与pH3U-7组有更低的荧光强度,其原因可能是由于酸性pH偏移较碱性pH偏移的蛋白构象变化更大[27];也可能是由于碱性pH偏移处理的蛋白未经过等电点的沉淀,具有更高的重折叠能力,因此内源荧光强度下降较小。所有pH偏移处理条件下,超声处理均使PLP内源荧光强度进一步降低,说明蛋白质原先的聚集状态被进一步改变,使通常包埋在蛋白质结构内的色氨酸残基等疏水基团暴露在周围的亲水环境中,进而发生“荧光淬灭”现象,导致其荧光强度下降。相关研究也发现pH偏移-超声波联合处理会使虹鳟鱼副产物蛋白荧光强度降低[20]

3 结论

本试验主要探究超声波辅助pH偏移处理对猪肝蛋白(PLP)结构和乳化特性的影响,以期为猪肝蛋白作为乳化剂在食品中的应用提供参考。由试验结果可知,相较于对照组,碱性pH偏移处理提高了PLP的乳化活性及乳液稳定性,处理后的PLP粒径减小,溶解度及Zeta电位绝对值增大,在加入超声复合处理后PLP结构及乳化特性的这一变化更为明显;而酸性pH偏移及超声波辅助酸性pH偏移处理均使PLP乳化活性与乳液稳定性降低,并且导致蛋白粒径增大,溶解度与Zeta电位绝对值下降。酸碱pH偏移及超声复合处理均使PLP的荧光强度及活性巯基的含量降低。综上所述,超声波辅助碱性pH偏移处理可以改善猪肝蛋白的乳化特性,改性后的猪肝蛋白有着作为乳化剂应用于食品工业中的良好前景。

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Effect of Ultrasound-Assisted pH-shifting Treatment on the Structure and Emulsification Characteristics of Porcine Liver Protein

LU Jin-ming1,PENG Song-lin1,YANG Kai-lin1,GENG Hong-qing1,SHANG Yong-biao1,2*
(1.College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China;2.Chongqing Key Laboratory of Speciality Food Co-Built by Sichuan and Chongqing,Chongqing 400715,China)

Abstract:The paper aimed to explore the effects of different modified methods on the structure and function characteristics of porcine liver protein(PLP).PLP was modified by ultrasonic treatment,pH-shifting treatment,and ultrasound-assisted pH-shifting treatment.The solubility,surface hydrophobicity,emulsification property,sulfhydryl content,particle size,Zeta potential,primary and tertiary structure,and their changes in the modified PLP were measured.The results showed that the particle size of PLP decreased and the absolute value of solubility and potential increased after ultrasonic treatment.When the PLP solution was adjusted to pH3 and then returned to neutral(pH3-7),the particle size of PLP increased,and the solubility and absolute potential decreased.After ultrasound-assisted pH-shifting treatment(pH3U-7),the particle size of protein decreased,and the solubility and absolute potential increased,but the effect was not obvious.When the PLP solution was adjusted to pH9,then returned to neutral(pH9-7),and combined with ultrasonic treatment(pH9U-7),the particle size of protein decreased,and the solubility and absolute potential increased.Acid/base pH-shifting and ultrasound-assisted treatment reduced the fluorescence intensity and active sulfhydryl content of PLP.The electrophoresis results showed that pH3-7 may lead to the disulfide bond aggregation of PLP,pH9-7 had no obvious effect on the electrophoresis strip,and the addition of ultrasound did not further change the electrophoresis strip.Compared with the control group,ultrasonic treatment,the pH9-7 and pH9U-7 groups improved the emulsifying activity and lotion stability of PLP,while the pH3-7 and pH3U-7 groups reduced the emulsifying activity and lotion stability.

Key words:ultrasound;pH-shifting;porcine liver protein;molecular structure;emulsification property

DOI:10.12161/j.issn.1005-6521.2023.05.014

作者简介:陆今明(1998—),男(汉),硕士研究生,研究方向:肉类科学。

*通信作者:尚永彪(1964—),男(汉),教授,博士,研究方向:食品蛋白质功能性质。

引文格式:

陆今明,彭松林,杨凯麟,等.超声波辅助pH偏移处理对猪肝蛋白结构及乳化特性的影响[J].食品研究与开发,2023,44(5):89-96.

LU Jinming,PENG Songlin,YANG Kailin,et al.Effect of Ultrasound-Assisted pH-shifting Treatment on the Structure and Emulsification Characteristics of Porcine Liver Protein[J].Food Research and Development,2023,44(5):89-96.

加工编辑:冯娜

收稿日期:2022-07-10