桑黄（Phellinus igniarius）为我国珍贵的药用真菌[1]，主要寄生于桑树、杨树等树干上[2]，因其子实体颜色鲜黄而称桑黄，其味微苦、性寒，药用历史悠久，主要用于止泻、崩漏带下、脾虚泄泻，主要活性成分包括多糖（8%～12%）、黄酮、香豆素、麦角甾醇、三萜类、生物碱及多酚等[3]，现代药理学研究表明，桑黄菌丝体胞外多糖和菌丝体内多糖混合物具有一定的抗肿瘤[4]、提高免疫力、抗炎[5]、抗突变、清除自由基[6]、抑制黄嘌呤氧化酶活性以及肝纤维化抑制作用[7]，因此桑黄多糖成为真菌研究领域的一大热点。目前桑黄多糖主要是采用溶剂提取、酶解、超声和微波辅助等方法提取[8]，桑黄多糖因极性较强，因此多采用水、乙醇等溶剂提取[9]，史玉宝等[10]对木瓜蛋白酶辅助提取桑黄多糖的提取工艺进行优化，结果显示酶解法可以通过减少纤维素等成分的干扰从而提高多糖提取效率，超声可以破坏细胞壁结构产生空化效应，程伟等[11]根据中心组合设计原理优化超声波协同纤维素酶法提取桑黄多糖工艺，可在一定程度上提高桑黄多糖的提取率。
低共熔溶剂（deep eultectic solvents，DES）是一种新型提取溶剂[12]，相对于传统溶剂和离子液体，具有无毒性、低挥发性、高热稳定性、能耗低、合成简单等优点[13-14]，目前DES在天然植物提取和分离方面具有独特优势[15-16]，作为经济且新型的绿色溶剂，广泛应用于医药化工和食品领域的分离、提取和合成，如已用于从薯蓣皂苷中提取多糖，试验结果表明DES作为溶剂的超声波破碎法要优于水的超声提取和典型的热回流提取方法[17]。但到目前为止，未见其应用于桑黄子实体多糖的提取报道。因此为了进一步提高桑黄子实体多糖的提取效率，提高资源利用率，本试验以产自西藏的桑黄为研究对象，超声波辅助DES萃取，通过星点-响应面法优化提取工艺，并通过对其体外抗氧化和抗癌活性进行评价，为桑黄多糖产品的进一步开发和利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 仪器与设备
紫外-可见分光光度计（UV-1800PC-DS2）：上海美谱达仪器有限公司；冷冻干燥机（FD-1A-50）：江苏天翎仪器有限公司；高速离心机（TG18G-Ⅱ）：上海冰都电器有限公司；中药粉碎机（F-1000）：上海新诺仪器集团有限公司；电子天平（LE204E）：上海右一仪器有限公司；超声波提取器（DSDZ1440）：无锡鼎实电子科技有限公司；电热鼓风干燥箱（DHG9030A）：上海一恒科学仪器有限公司。
1.2 材料
桑黄（浅肝褐色至暗灰色，干燥粉碎过60目筛）：沈阳源生堂药业有限公司；人源宫颈癌HepG2215、肝癌SMMC-7721：上海雅吉生物科技有限公司；乳腺癌MDAMB415、肺癌AE1201、胃癌BGC823细胞：无锡博慧斯生物医药科技有限公司；比色噻唑蓝（colorimetric thiazoyl blue，MTT）试剂盒：上海歌凡生物科技有限公司；1，1-二苯基苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：合肥博美生物科技有限责任公司；氯化胆碱、葡萄糖、无水乙醇、浓硫酸、苯酚、乙醇、乙二醇、1，2 丙二醇、丙三醇、1，3-丁二醇、1，6-己二醇、山梨醇、木糖醇、硫酸亚铁、水杨酸、H2O2（均为分析纯）：徐州市科翔化学试剂有限责任公司。
1.3 方法
1.3.1 多糖含量测定方法
选用硫酸-苯酚法测定多糖含量。精密称取110℃干燥至恒重的葡萄糖2.000 g，用水溶解定容于100 mL量瓶中，得葡萄糖标准溶液（20.00 mg/mL）。分别精密量取 1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 标准溶液至 20 mL量瓶中，加入4 mL 5%苯酚溶液、10 mL浓硫酸，立即摇匀，置40℃水浴锅中保温30 min放冷，定容。同法配制空白作为参比，于490 nm波长处测定各溶液吸光度A，绘制A-C（mg/mL）曲线。得到的标准曲线为A=0.089C+0.002 27，R2=0.974 4，线性范围为 0～10 mg/mL。
1.3.2 多糖提取率的计算
精密称取2.000 g桑黄粉末加入100 mL的具塞试管中，加入含水量为30%、摩尔比为1∶2的DES溶剂80 mL，放入超声仪中，设定超声功率为90 W、超声时间为30 min，超声结束后置于50℃水浴锅内，提取60 min，经纱布过滤后再经滤纸过滤，滤液经80%乙醇沉12 h，4 000 r/min离心20 min，沉淀复溶，冷冻干燥得粗多糖，用水溶解定容于100 mL量瓶，精密移取1.0 mL供试液，按1.3.1方法测定供试液A，平行测定3次，得到多糖浓度C（mg/mL），按下列公式计算多糖提取率。
式中：1为供试液移取体积，mL；100为供试液稀释倍数；1 000为换算倍数；m为样品质量2.000 g。
1.3.3 DES的制备与筛选
DES的制备见表1。
表1 低共熔溶剂的制备
Table 1 Preparation of eutectic solvent
试验号 氢键受体 氢键供体 摩尔比Ⅰ氯化胆碱 乙醇 1∶2Ⅱ氯化胆碱 乙二醇 1∶4Ⅲ氯化胆碱 1，2丙二醇 1∶3Ⅳ氯化胆碱 丙三醇 1∶3Ⅴ氯化胆碱 1，3-丁二醇 1∶2Ⅵ氯化胆碱 1，6-己二醇 1∶1Ⅶ氯化胆碱 山梨醇 1∶1Ⅷ氯化胆碱 木糖醇 1∶1
在25℃条件下将氢键受体和氢键供体按表1中的摩尔比置于密封具塞锥形瓶内，90℃恒温加热搅拌，直至形成清澈透明的液体。精密称取8份2.000 g桑黄粉末于100 mL具塞锥形瓶中，各加入60 mL8种含水量30%的DES，置于超声波中，超声功率90 W，超声时间30 min，超声结束后置于50℃水浴锅内，提取60 min，按照1.3.2方法测定桑黄多糖的提取率。
1.3.4 单因素试验设计
精密称取2.000 g桑黄粉末置于100 mL具塞锥形瓶中，加入含水量0%～80%、摩尔比为2∶1～1∶4的DES（氯化胆碱 ∶丙三醇），使液固比为 10∶1（mL/g）～50∶1（mL/g），超声功率设定为30 W～150 W，超声时间设定为20 min～50 min，超声结束后，样品于20℃～60℃水浴加热 60 min。分别考察摩尔比（2∶1、1∶1、1∶2、1 ∶3、1 ∶4）、含水量（0%、15%、30%、45%、60%）、液固比[10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1（mL/g）]、超声功率（30、60、90、120、150 W）、超声时间（20、30、40、50、60 min）、提取温度（20、30、40、50、60 ℃）对桑黄多糖提取率的影响。
1.3.5 Box-Behnken试验设计
在单因素试验基础上，根据Box-Behnken设计原理，选择对多糖提取率Y影响较大的液固比A、提取温度B、超声功率C作为自变量进行提取工艺优化。设计因素与水平见表2。
表2 Box-Behnken设计因素与水平
Table 2 Box-Behnken design factors and levels
水平 因素A液固比（mL/g） B提取温度/℃ C超声功率/W-1 30∶1 40 60 0 40∶1 50 90 1 50∶1 60 120
1.3.6 桑黄多糖活性研究
将试验制得的桑黄多糖经核酸沉淀溶液（nucleic acid precipitation solution，TCA）法去蛋白、H2O2去除色素、透析袋除小分子后配成20 mg/mL的溶液[18]，备用。
1.3.6.1 DPPH自由基清除率的测定
参照谢燚林[19]的方法，将 200 μL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液与 3 mL 不同浓度（1、2、4、8、16、32 mg/mL）样品溶液混匀，避光反应30 min，517 nm波长测定其吸光度A1，不加样品的0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液与乙醇溶液分别测定其吸光度为A2和A0，以同等浓度的VC做阳性对照。DPPH自由基清除率按下式计算[20]。
1.3.6.2 羟基自由基清除能力测定
参照李国峰等[21]的方法测定羟基自由基清除能力，在试管中依次加入500 μL 9.0 mmol/mL硫酸亚铁溶液、0.025%H2O2溶液、2 mL 不同浓度（1、2、4、8、16、32 mg/mL）的样品溶液以及500μL 9.0 mmol/mL水杨酸溶液，混匀后在37℃水浴中避光反应30min，510nm处测定器吸光度A，平行测定3次，取平均值，以同等浓度的VC做阳性对照。羟基自由基清除率按下式计算。
式中：A1为加入样品溶液的吸光度；A2为不加样品溶液的吸光度；A0为加入同体积乙醇溶液的吸光度。
1.3.6.3 MTT法测定多糖对不同肿瘤细胞增殖的抑制作用
分别将人源宫颈癌HepG2215、肝癌SMMC-7721、乳腺癌MDAMB415、肺癌AE1201和胃癌BGC823细胞，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。取对数生长期的肿瘤细胞，于37℃、5%CO2的细胞培养箱中孵育 24 h 后，分别加入不同浓度（1、8、16、32、64、128、256 μg/mL）的样品溶液 30 μL，继续培养 24 h，小心吸取上清液，加入90 μL新鲜培养液和10 μL MTT（500 μg/mL）继续培养 4 h，每孔加入 150 μL 甲瓒溶解液，完全溶解后，测量490 nm处各孔的吸光度A。平行测定3次，同时进行空白组和对照组测定。按下式计算细胞生长抑制率（%），并经GraphPad Prism 8.2.1计算半数抑制浓度（IC50）。
1.4 数据处理
采用Excel 2016进行数据整理及作图，所有试验均重复3次，数据结果用平均值±标准差表示；采用Design-expert 11.0.3软件进行响应面试验设计并进行数据分析，采用IBM SPSS 22进行显著性分析和方差分析，P＜0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 低共熔溶剂的体系优化
低共熔溶剂具有极性和黏度的可调节性，在一定极性和黏度条件下，可以对目标物质起到增溶作用，直接影响目标物质的提取效率，因此，选择适合的低共熔溶剂在提升提取效率方面效果明显。本研究筛选DES-Ⅰ～DES-Ⅷ对桑黄多糖提取率的影响，结果见图1。
图1 不同低共熔溶剂对桑黄多糖提取率的影响
Fig.1 Effects of different eutectic solvents on the extraction rate of polysaccharides
由图1可知，8种低共熔溶剂对桑黄多糖的提取率依次为 DES-Ⅳ＞DES-Ⅶ＞DES-Ⅷ＞DES-Ⅴ＞DES-Ⅵ＞DES-Ⅲ＞DES-Ⅱ＞DES-Ⅰ。DES-Ⅳ的提取率最高，达到11.26%，而DES-Ⅰ的提取率最低，仅有9.02%。DES-Ⅳ能够提高桑黄多糖提取率的原因可能是由于该组合的扩散力、极性与桑黄多糖较接近，有利于多糖的溶解和扩散，后续将选择DES-Ⅳ作为低共熔溶剂考察其对桑黄多糖提取率的影响。
2.2 提取工艺的单因素结果
2.2.1 DES摩尔比对桑黄多糖提取率的影响
DES摩尔比对桑黄多糖提取率的影响见图2。
图2 DES摩尔比对桑黄多糖提取率的影响
Fig.2 Effect of DES molar ratio on extraction rate of polysaccharides
由图2可知，当DES-Ⅳ摩尔比由2∶1到1∶4时，多糖提取率先增大后减小，可能是由于随着丙三醇的增加，使DES体系的黏度降低，扩散力增强，更利于多糖的溶出。而随着丙三醇加入比例的进一步增大，使DES体系极性减小，其与多糖之间的极性差距增大，降低了多糖的溶解度，使提取率逐渐减小。因此，选择DES-Ⅳ摩尔比为1∶2进行后续试验。
2.2.2 DES含水量对桑黄多糖提取率的影响
DES含水量对桑黄多糖提取率的影响见图3。
图3 DES含水量对桑黄多糖提取率的影响
Fig.3 Effect of DES water content on extraction yield of polysaccharides
为了调节DES的黏度，需要添加一定量的水降低黏度，增大溶出物质的扩散力，由图3可知，提取率在含水量为30%左右达到最大，这可能是由于随着含水量的增大，DES与多糖之间的氢键作用力逐渐降低，减少了多糖的溶解度。因此选择低共熔溶剂的含水量为30%。
2.2.3 液固比对桑黄多糖提取率的影响
液固比对桑黄多糖提取率的影响见图4。
图4 液固比对桑黄多糖提取率的影响
Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on extraction yield of polysaccharides
由图 4 可知，液固比在 10 ∶1（mL/g）～40∶1（mL/g）提取率逐渐增加，液固比为50∶1（mL/g）时桑黄多糖提取率有所下降，可能是由于溶剂量越大，在溶解时可形成较大的浓度差，利于多糖溶解。但当溶剂量继续增大时，细胞间空隙容纳量趋向饱和，提取率不再明显增加，因此，后续试验选择液固比30∶1（mL/g）～50 ∶1（mL/g）。
2.2.4 超声功率对桑黄多糖提取率的影响
超声功率对桑黄多糖提取率的影响见图5。
图5 超声功率对桑黄多糖提取率的影响
Fig.5 Effect of ultrasonic power on extraction yield of polysaccharides
由图5可知，提取率在30 W～90 W迅速增加，在90 W～150 W开始缓慢下降，可能是由于超声功率过低，对细胞壁的破碎作用较弱，不利于多糖溶出。而随着超声功率的增大，增大溶剂的空化效应，利于多糖溶出，但当超声功率增大到一定程度时，有可能会导致桑黄多糖结构分解，降低提取率。因此后续试验选择超声功率60 W～120 W。
2.2.5 超声时间对桑黄多糖提取率的影响
超声时间对桑黄多糖提取率的影响见图6。
图6 超声时间对桑黄多糖提取率的影响
Fig.6 Effect of ultrasonic time on extraction yield of polysaccharides
由图6可知，超声时间在20 min～30 min时，桑黄多糖提取率呈上升趋势，超过30 min后提取率下降，可能是因为超声时间越长，形成的空化效应越明显，对桑黄细胞壁的破坏效果更强，提取率越高。但是超声时间过长，其产生的温度较高，使得部分多糖被分解，提取率下降，因此最佳超声时间为30 min。
2.2.6 提取温度对桑黄多糖多糖提取率的影响
提取温度对桑黄多糖提取率的影响见图7。
图7 提取温度对桑黄多糖提取率的影响
Fig.7 Effect of extraction temperature on extraction yield of polysaccharides
由图7可知，提取温度对桑黄提取率的影响较大，在20℃～50℃条件下提取率明显增加，在60℃时提取率开始下降。其原因可能是随着温度的升高，溶剂分子的运动加速，促进桑黄干粉与溶剂的接触程度，有利于多糖的溶出，但当温度进一步升高时，使部分多糖成分出现降解，提取率下降，因此，后续试验选择提取温度40℃～60℃。
2.3 响应面试验设计与结果
2.3.1 模型建立与数据拟合
响应面试验结果见表3。
表3 Box-Behnken设计试验结果
Table 3 Box-Behnken design experiment schedule and results
试验号 A/(mL/g） B/℃ C/W Y/%1 30∶1 60 90 12.25±0.62 2 40∶1 60 120 11.91±0.35 3 30∶1 40 90 10.57±0.45 4 40∶1 50 90 12.83±0.42 5 40∶1 50 90 12.71±0.51 6 40∶1 50 90 12.77±0.38 7 30∶1 50 60 9.34±0.36 8 40∶1 50 120 11.19±0.43 9 50∶1 50 120 9.78±0.31 10 40∶1 50 90 12.80±0.34 11 50∶1 50 60 10.82±0.40 12 50∶1 40 90 11.59±0.42 13 40∶1 40 60 11.21±0.47 14 40∶1 40 120 10.61±0.36 15 40∶1 60 60 11.34±0.42 16 50∶1 60 90 11.35±0.39 17 40∶1 50 90 12.60±0.37
通过回归分析，得出桑黄多糖提取率的回归方程为Y=12.80+0.099 5A+0.358 7B+0.001 7C-0.480 0AB-0.571 1AC+0.292 5BC-1.24A2-0.101 7B2-1.45C2。
2.3.2 响应面分析
方差分析结果见表4。
表4 Box-Behnken响应面模型方程对多糖提取率的方差分析
Table 4 Variance analysis of Box-Behnken response surface model equation for polysaccharides
来源 平方和 自由度 均方 F P模型 19.27 9 2.14 80.49 ＜0.000 1 A液固比 0.055 6 1 0.055 6 2.09 0.191 3 B提取温度 1.03 1 1.03 38.70 0.000 4 C超声功率 0.000 0 1 0.000 0 0.000 7 0.979 4 AB 0.921 6 1 0.921 6 34.64 0.000 6 AC 0.707 0 1 0.707 0 26.58 0.001 3 BC 0.342 2 1 0.342 2 12.86 0.008 9 A2 5.11 1 5.11 192.14 ＜0.000 1 B2 0.039 0 1 0.039 0 1.47 0.265 2 C2 8.18 1 8.18 307.55 ＜0.000 1残差 0.186 2 7 0.026 6失拟项 0.080 7 3 0.026 9 1.02 0.472 2绝对误差 0.105 5 4 0.026 4总和 19.46 16
由表4可知，模型P＜0.000 1为极显著，说明该模型有效可靠。本次模型的失拟项P值为0.472 2，说明无明显失拟因素存在，可以代替试验真实点对试验结果进行分析。决定系数（R2）和调整系数（RAdj2）分别为0.970 4和0.958 1，说明该模型具有良好的稳定性及准确性。B、AB、AC、BC、A2、C2项的 P＜0.05，说明对多糖提取率具有显著影响。由F值可知，3个因素对桑黄多糖提取率影响的主次顺序为B＞A＞C。
2.3.3 提取工艺的响应面分析与优化
二维等高图与三维响应面曲线图见图8。曲线延因素轴向的图形倾斜度越大，表明该因素对因变量影响越大，反之则影响越小。
图8 各因素交互作用对多糖提取率影响的响应面
Fig.8 Response surface diagram of interaction of various factors on polysaccharides
由图8可知，桑黄多糖提取率随着液固比和提取温度的增加呈先增大后减小的趋势，说明在一定的提取温度下，桑黄多糖的溶解能力和提取液的扩散能力得到极大值。液固比与超声功率图形变化较为对称，说明液固比与超声功率对提取率的影响较为一致，即当其中一个因素一定时，随着另一个因素的增加，提取率逐渐上升后趋于平缓，在该因素达到一定值时，提取率可达最大值。这可能由于超声功率较大时，会产生“饱和效应”，影响多糖溶出。在超声功率一定时，提取率随着提取温度的增大呈先迅速增大后缓慢减小的趋势，而超声功率对提取率的影响较为平缓，这与方差分析结果一致。
2.3.4 最佳工艺条件的验证试验
预测最佳提取工艺条件为液固比39.3∶1（mL/g）、提取温度57.6℃、超声功率87.44 W，预测提取率为12.99%。按优选的提取工艺经校正后选用以下条件进行3次验证试验：液固比39∶1（mL/g）、提取温度58℃、超声功率为90 W，桑黄多糖的提取率分别为13.16%、13.27%、12.90%，相对标准偏差为1.20%，平均值为13.11%，与预测值误差为0.91%，说明该模型预测较好，试验优化工艺参数可靠。
2.4 桑黄多糖抗氧化活性分析
不同浓度的桑黄多糖和VC对DPPH自由基、羟基自由基的清除率见图9。
图9 不同浓度的桑黄多糖和VC对DPPH自由基、羟基自由基的清除率
Fig.9 Scavenging rate of DPPH and hydroxyl radical by different concentration of polysaccharides and VC
如图4所示，桑黄多糖清除DPPH自由基和清除羟基自由基的能力与浓度呈正相关，但均低于VC的清除能力，当浓度由1 mg/mL增大到32 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率分别为5.26%、12.38%、21.94%、39.46%、63.25%、71.32%，对羟基自由基的清除率分别为3.53%、7.66%、13.24%、21.38%、39.77%、51.26%。高浓度的桑黄多糖对DPPH自由基和羟基自由基的清除率明显高于低浓度的桑黄多糖，说明桑黄多糖的抗氧化活性均有一定的量效关系。当浓度为32 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率为VC的79.2%，对羟基自由基的清除率为VC的89.6%。
2.5 桑黄多糖对不同肿瘤细胞增殖的抑制作用
桑黄多糖对不同肿瘤细胞增殖的抑制作用见图10。
图10 桑黄多糖对5种人源肿瘤细胞株增殖的影响及IC50值
Fig.10 Effects of polysaccharides on proliferation and IC50 values of 5 human tumor cell lines
由图10可知，桑黄多糖对5种人源宫颈癌HepG-2215、肝癌 SMMC-7721、乳腺癌 MDAMB415、肺癌AE1201和胃癌BGC823肿瘤细胞均有一定的抑制作用，且均呈一定的量效正相关性，其中对人源宫颈癌HepG2215、肝癌SMMC-7721的IC50值最低，分别为81.19、127.40 μg/mL，表明 HepG2215 和 SMMC-7721对桑黄多糖的抑制作用最为敏感。
3 结论
本研究经过筛选和比较不同DES的组合对桑黄多糖提取的影响，以桑黄多糖提取率为指标，经过单因素试验以及Box-Behnken设计优化提取工艺，得到最优提取条件：DES含水量30%、超声时间30 min、液固比为39∶1（mL/g）、提取温度58℃、超声功率90 W，在该条件下桑黄多糖提取率可达13.11%。试验结果表明，加入DES可以成为天然产物提取的可持续和有效方案，且提取方法操作简单、高效环保、绿色节能，能保持多糖的原有性质，为后续桑黄多糖药理活性的进一步研究提供基础依据。同时考察纯化后的桑黄多糖的抗氧化活性，结果显示桑黄多糖具有一定的抗氧化活性且与质量浓度呈量效关系。通过考察桑黄多糖对5种人源细胞增殖的抑制率，结果显示桑黄多糖提取物具有较强的体外抗肿瘤能力，尤以抑制HepG-2215和SMMC-7721细胞增殖作用最强，这提示桑黄多糖在治疗宫颈癌和肝癌方面具有良好的应用前景，为桑黄健康产品的研发提供理论依据。
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