α-淀粉酶抑制剂（α-amylase inhibitor，α-AI）属于糖苷酶抑制剂的一种，是具有抑制α-淀粉酶作用的生物活性物质，能与α-淀粉酶分子上的相对应的部位结合并改变α-淀粉酶分子构象，使α-淀粉酶的活性降低或者丧失[1]，国外称之为“starch blocker”[2]。全球第 11大死因的糖尿病是一种复杂的慢性病，据调查数据显示，2019年，全球共有4.63亿人患有这种以血糖水平升高（高血糖）为特征的代谢紊乱[3]。其中，2型糖尿病（diabetes mellitus type 2，T2DM）占糖尿病总病例的90%以上。α-AI能够抑制人体内α-淀粉酶的作用，进而可以抑制体内的淀粉水解过程，从而降低血糖水平，故α-AI在治疗糖尿病以及减肥等方面具有极大的潜力[4]；然而，由于商业化合成的α-AI有一定的副作用，如引起腹胀、腹泻和腹痛等胃肠道不良症状[5]，因此，天然获取的α-AI因其副作用小以及有效性高等特点将会备受青睐。
α-AI可以分为蛋白类和非蛋白类抑制剂[6]，不同来源的抑制剂，其物理化学特性也不同。有研究表明[7]，植物种子是蛋白类α-AI的主要来源。谷物是谷类植物或粮食作物的总称，其涵盖的范围较广，主要是植物种子和果实，包括大米、小麦、小米、大豆等其它杂粮，在食物金字塔中占很大比例，是人类饮食中的主要能量来源[8]。谷物含有丰富的淀粉、蛋白质等，有研究表明，淀粉含量越高，其蛋白类α-AI的含量也越高[9]，因此，谷物是蛋白类α-AI的良好来源。有关淀粉酶抑制剂的研究距今已有80余年的历史，早在1933年Franco等[10]从小麦中分离得到了蛋白类α-AI。随着不断研究谷物对于人体的有益作用，对于谷物中α-AI的研究也逐渐深入。本文对谷物蛋白类α-AI的分离纯化、活性检测方法以及功能特性等方面进行了总结。
1 α-淀粉酶抑制剂的概述
1.1 α-淀粉酶抑制剂的类型
目前，大多数α-AI已从微生物源（主要集中在链霉菌属）、植物源（植物中普遍存在，尤其在谷物种子中含量丰富）获得，少数来自哺乳动物[11]，同时还可以通过化学合成获得。天然存在的α-AI分为3种类型[12]，分别为微生物产生带一个寡生物胺单位的含氮碳水化合物；微生物产多肽，如paim（来自微生物的猪胰腺α-AI）和 Haim（微生物起源人 α-AI）；在谷类、豆类以及其它较高等植物中被发现的大分子蛋白类α-AI。
1.2 蛋白类α-淀粉酶抑制剂的分类
从蛋白序列相似度以及三级结构来看，目前已鉴定出7类天然蛋白类α-AI，其中6类是从谷物中提取[13]，即 the knottin-like type，the γ-thionin-like type，the cereal type，the kunitz type，the thaumatin-like type，the lectin-like type；另一类是微生物代谢物[14]，即the microbial type。上述7类抑制剂的分子量从3 kDa到23 kDa不等，表明该类型抑制剂具有丰富的结构和功能多样性。
1.3 α-淀粉酶抑制剂与α-淀粉酶的作用方式
1.3.1 互补型
α-淀粉酶抑制剂占据靶酶的识别位点与结合部位，并与靶酶的活性基团形成氢键进而封闭靶酶的活性中心[15]。如大麦的α-AI，该抑制剂为一种双功能淀粉酶抑制剂，既能够抑制植物内源性的α-淀粉酶，又可以抑制昆虫来源的α-淀粉酶。
1.3.2 相伴型
α-淀粉酶抑制剂与靶酶分子并列相伴，并在与靶酶的活性基团形成氢键的同时，封锁靶酶与底物的结合部位[16]。小麦、小米和大米等中存在此类抑制剂，该类抑制剂可以抑制哺乳、昆虫以及细菌中的α-淀粉酶。
1.3.3 覆盖型
以类似线性分子的网络形式覆盖到靶酶活性中心附近的区域上，从而阻止靶酶的活性中心与底物接触而使靶酶失活[17]。豆类植物存在此类抑制剂，该类抑制剂可以抑制来源于哺乳、昆虫以及真菌中的α-淀粉酶。
2 谷物蛋白类α-淀粉酶抑制剂的分离纯化
蛋白质以及多肽的纯化普遍采用柱层析法[18]。亲和层析、凝胶过滤层析和离子交换层析是最常用的蛋白以及酶的纯化方法[19-20]。根据原料特性的不同，分离方法也有所不同，图1是从植物中分离蛋白类淀粉酶抑制剂的过程。随着新兴技术的不断发展，谷物蛋白类α-AI的分离纯化方法也逐渐多样化，表1介绍了谷物蛋白类α-AI不同的分离纯化方法。
图1 植物蛋白类淀粉酶抑制剂的分离纯化步骤
Fig.1 Separation and purification steps of plant protein amylase inhibitors
表1 谷物蛋白类α-淀粉酶抑制剂的分离纯化方法比较
Table 1 Comparison of separation and purification methods of cereal protein α-amylase inhibitors
分离原理 分离方法 优缺点分子结合 亲和分离法 载量大、高效快速，目标物纯度、回收率高；亲和配体要求较高且成本大、适用范围有限电荷强度；分子量简单快速且易操作；目标物纯度、回收率较低、条件优化繁琐肽键破裂 蛋白水解法 操作简单；纯化目标组分较难流体溶解能力与其密度关系色谱法 简单易操作、目标物纯度高；耗时、得率较低无机反应 无机吸附法 简单省时，能去除大量杂质；适用条件限制性较大水合作用；溶解度双水相萃取法；三相分配法超临界CO2萃取法目标物纯度、活性高，环保；制备成本较高，耐高温目标物适合
2.1 亲和分离法
2.1.1 亲和沉淀法
通过将配体偶联到水溶性聚合物来形成生物偶联物，配体-聚合物复合物选择性地结合粗提液中的目标蛋白，通过简单改变环境（如：pH值、温度、离子强度或添加某些试剂）从溶液中沉淀出蛋白质-聚合物复合物。最后，再将所需的蛋白质从聚合物中解离[21]。Kumar等[22]提出了1种基于热敏共聚物固定化金属亲和沉淀的从小麦粉中分离纯化蛋白类α-AI的方法，结果表明：1-乙烯基咪唑与N-异丙基丙烯酰胺聚合得到的聚合物具有金属离子与蛋白质抑制剂的特异性相互作用，将聚合物溶解在咪唑缓冲液中用盐诱导沉淀，从该聚合物中回收了单一的蛋白类α-AI，回收率为89%，其分子量为14 000 kDa。同时还发现，抑制剂与Cu（II）-聚合物共轭化合物的结合取决于共聚物中Cu（II）浓度和蛋白质的浓度。Bhat等[23]利用蛋白样多肽融合到蛋白单一的Z型结构域中，从复杂混合物中亲和沉淀纯化得到了单克隆抗体，最终单克隆抗体纯度大于95%，回收率大于80%。
2.1.2 亲和层析法
将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂置于层析柱中，蛋白混合液通过层析柱时，与固相吸附剂有亲和能力的蛋白质被吸附并滞留在层析柱中，其它杂蛋白直接流出，再选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的目标蛋白洗脱下来[24]。El-lat[25]通过硫酸铵分级沉淀和DEAE-Sephadex G-25柱层析从两种小麦中分离纯化得到分子量为16、24 kDa的蛋白类α-AI，分离出的抑制剂在 40 °C～50 °C 时活性最高，在80°C以下稳定，并且在较宽的pH值范围内（2～12）稳定。Maghsoudi等[26]采用乙醇沉淀和壳聚糖珠柱亲和层析的方法从白豆中纯化得到了富含蛋白类α-AI的组分，该组分对猪胰腺α-淀粉酶具有较强的抑制活性且具有明显的热稳定性，即使在60℃孵育30 min，其抑制率仍可达80%左右。Bharadwaj等[27]通过缓冲液提取、硫酸铵分级分离、CM-纤维素和sephadex G-75层析从浸泡过的黧豆种子中纯化得到了蛋白类α-AI。纯化后的抑制剂特异性抑制活性为61.18，纯度为36.68倍，得率为14.01%。同时，该抑制剂对人唾液α-淀粉酶活性有抑制作用且具有较好的热稳定性，在65℃时仍可保持80.50%的活性。
2.2 色谱法
色谱法是待分离的物质在固定相和流动相之间分配平衡的过程，利用不同物质在两相之间分配不同的特点，因不同物质随流动相运动速度各不相同，使混合物中的不同组分随着流动相的运动在固定相上完成相互分离[28]。Sun等[29]利用离子交换和排阻色谱相结合的方法，从大麦中纯化获得分子量为22 kDa的α-淀粉酶/枯草杆菌素抑制剂，该抑制剂在pH6、50℃的条件下具有最大的抑制活性。Meera等[30]利用离子交换色谱从Leucas aspera中分离纯化到分子量为28 kDa蛋白类 α-AI，该抑制剂在 pH6～7、温度 30℃～50℃范围内对α-淀粉酶活性较高，有望成为抗糖尿病药物。Wang等[31]采用硫酸铵沉淀、离子交换层析和反相液相色谱分离纯化得到鹰嘴豆成熟种子中的蛋白质类α-AI，它对多种α-淀粉酶均有抑制活性，且对各种α-淀粉酶的抑制活性受温度、pH值、孵育时间、底物浓度和抑制剂浓度的影响较大。
2.3 无机吸附法
有研究人员[32]基于无机吸附剂Zn（OH）2的应用，开发了菜豆蛋白类α-AI纯化的新方法。研究发现，Zn（OH）2与大多数可溶性菜豆蛋白结合，而将α-AI留在溶液中。Zn（OH）2质量分数在1%～2%时，沉淀结合的菜豆α-AI明显较低，而Zn（OH）2质量分数在4%浓度范围内，菜豆中大约98%的蛋白质与沉淀相结合，未与Zn（OH）2结合的富含α-AI的组分再经过二乙氨基乙基柱层析和凝胶过滤层析进一步纯化。该方法比其他提纯方法更快速。
2.4 双水相萃取、三相分配法
双水相萃取（aqueous two phase extraction，ATPE）是一种新型的液-液分离方法，是利用组分在两水相之间分配系数的不同而进行分离提纯的技术[33]。陈晓春等[34]采用新型聚乙二醇/果糖-1，6-二磷酸三钠双水相体系从小麦粉中分离纯化α-AI。该体系由聚乙二醇浓度、果糖-1，6-二磷酸三钠盐浓度、体系pH值等因素共同影响α-AI的分布。在顶相中加入11.7%（质量比）的聚乙二醇2000和19%（质量比）的果糖-1，6-二磷酸三钠，最终得到的α-AI纯度为3.2倍，回收率为79%。该结果证明，用新型聚乙二醇/果糖-1，6-二磷酸三钠双水相体系纯化蛋白类α-AI的可行性。张佰鹏等[35]利用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）/（NH4）2SO4双水相体系萃取白芸豆中的α-AI，当PEG质量分数为12%，（NH4）2SO4的质量分数为 13.3%，NaCl质量分数为0.003%时，分配系数、相比和活力回收率分别为4.40，0.57，71.41%。并且其还讨论了当 PEG、（NH4）2SO4分别一定时对α-AI提取的影响。三相分配（threephase partitioning，TPP）是一种新兴的生物分离技术，它采用了盐析法、等离子沉淀法、共溶剂沉淀法、蛋白质的渗透和共渗沉淀法等多种技术原理结合的集体操作[36]。Saxena[37]等采用TPP技术从龙爪稷粗提物中分离纯化得到一种具有双功能蛋白类α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂。该方法包括在粗提物中加入硫酸铵，然后再加入叔丁醇。在硫酸铵存在下，叔丁醇的加入将蛋白质推出溶液，在上层有机层和下层水之间形成界面沉淀层。此过程分为两步，在第一、二步纯化过程中，淀粉酶抑制剂纯化分别达到8.9倍和20.1倍，回收率分别为83%和39.5%。Hafid等[38]利用TPP技术从番木瓜中提取分离到分子量为23.2 kDa的木瓜蛋白酶。试验结果表明，在 pH 为 6.0、温度为 25 ℃、（NH4）2SO4用量为40%、粗提物∶叔丁醇为1.0∶0.75的条件下，TPP纯化倍数为11.45倍，活力回收率为134%。在pH 6.0，温度为50°C时酶活最大，Km和Vmax参数的最大值分别为10.83 mg/mL和33.33 U/mL。
2.5 蛋白水解法
蛋白类α-AI也含有小分子肽，这些小分子肽主要是通过蛋白酶水解来提取分离的。在水解过程中内肽酶首先发挥作用，其次是外肽酶（主要是三肽基和二肽基肽酶、氨基肽酶和羧肽酶）发挥作用。上述过程产生的多肽可以通过胃肠进一步消化，产生序列和长度不等的多肽，其中一些多肽与生物活性有关[39]。当提取蛋白质时，碱法溶解后用等电点沉淀法使其沉淀，大约90%～95%的蛋白质可以被分离出来。利用不同的蛋白酶来水解蛋白质提取生物活性肽，并利用不同截留分子量的超滤膜分离得到不同的多肽组分，同时测定各水解多肽组分对α-淀粉酶的抑制率来确定活性组分分布，最后结合凝胶色谱法、离子交换色谱法等来进行相应的纯化[40]。Rang等[41]提出了一种从白菜豆种子得到蛋白类α-AI的酶解制备方法，该方法主要包括热处理、酶解、等电沉淀和70%乙醇沉淀等过程，用风味酶酶解后将酶解液进行等电点沉淀，最终该方法的杂蛋白损失和纯化倍数虽较低（分别为85.84%和4.74），但α-AI活性得率（67.12%）远高于色谱法，这对于实际应用至关重要，同时该方法还可以进行扩展。Uraipong[42]利用4种蛋白酶对米糠蛋白进行酶解，结合超滤以及离子交换层析进行分离活性组分，最终发现利用蛋白水解后活性显著增强，且活性与蛋白水解度呈正相关。碱性蛋白酶以及复合蛋白酶酶解后的水解物对于α-淀粉酶的抑制活性与标准抗糖尿病药物阿卡波糖相当，有望作为一种抗糖尿病的膳食或营养补充剂。Olusegun等[43]利用蛋白酶对豇豆种子进行酶解，α-淀粉酶抑制实验表明，胃蛋白酶水解物具有较好的抑制活性[IC50=（0.127±0.012）mg/mL]，胃蛋白酶水解物表现出较高的结合亲和力（ki=0.089 mg/mL）。
2.6 超临界二氧化碳萃取法
超临界二氧化碳萃取法是利用超临界状态下的二氧化碳对某些特殊天然产物具有特殊的溶解作用，利用超临界二氧化碳的溶解能力与其密度之间的关系，即利用压力和温度对超临界二氧化碳溶解能力的影响而进行的[44]。米切尔·什科普等[45]将研磨后的白菜豆在真空压力条件下，利用超临界二氧化碳对其进行提取除杂，同时留下豆块，然后用去离子水保温该豆块，得到包含第一固体组分和第一液体组分的第一白菜豆悬浮液。将上述两组分分离，随后用去离子水保温第一固体组分，即得到第二白菜豆悬浮液。将第二固体、液体组分分离，然后使第一和第二液体组分混合以获得最终液体组分溶液。对最终液体组分溶液进行热交换而获得浓缩白菜豆提取物，对浓缩白菜豆提取物进行干燥，即可获得纯化α-AI。Arumugham等[44]利用超临界二氧化碳作为溶剂从乳清分离蛋白中分离出α-乳清蛋白和β-乳球蛋白蛋白。结果表明，最佳的制备条件为压力8 MPa和温度55℃。需要注意的是，利用超临界二氧化碳萃取时要考虑到温度和压力对蛋白类物质的活性以及结构可能产生的影响。
现阶段，对于蛋白类α-AI的分离纯化方法不断涌现，虽然植物蛋白类淀粉酶抑制剂与谷物蛋白类α-AI方法相似，但应根据物料特性、溶解度以及等电点等特性进行分离纯化，可以将以上介绍的方法有效结合使用，但在纯化过程中，需要将蛋白类α-AI的活性作为分离纯化的重要参考指标之一。
3 谷物蛋白类α-淀粉酶抑制剂的检测
目前，对于α-AI的检测项目主要包括其活性、含量纯度及相对分子质量等。蛋白质类α-AI的含量、纯度和相对分子质量都可依照蛋白质的测定方法进行，其活性可以通过直接测定淀粉水解还原糖生成量以及间接测定淀粉剩余量来表征。现阶段，蛋白类α-AI抑制活性的测定方法常用碘比色法和3，5-二硝基水杨酸比色法。随着现代新兴技术的不断发展，一些快速简便的方法被发现并应用于蛋白类α-AI的筛选检测，如：高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测（highperformance anion-exchange chromatography coupled with pulsed amperometric detection，HPAEC-PAD）法[46]、电泳法[47]、微孔法[48]等。
3.1 直接法
直接法是通过测定试验组（α-淀粉酶+淀粉，添加α-AI）与对照组（α-淀粉酶+淀粉，不添加 α-AI）各自反应过后还原糖的生成量来表征α-AI的活性。试验组还原糖生成量越少，表明α-AI抑制α-淀粉酶水解淀粉的作用越强。
3.1.1 高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法
高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法（HPAECPAD）是以离子交换树脂为固定相，氢氧化钠或氢氧化钠-醋酸为流动相，在淀粉酶抑制剂存在或不存在的情况下，测定淀粉酶对淀粉作用产生单糖的含量。Mosca等[46]采用HPAEC-PAD法对膳食补充剂菜豆中α-AI的含量和活性进行了检测。结果证明该方法是一种灵敏度高，准确性好的快速检测方法。Joyce等[49]以HPAEC-PAD法快速量化通过内切木聚糖酶消化释放的阿拉伯木聚糖，并表征4种冷季型牧草中的阿拉伯木聚糖结构，并对浓度范围、检测限、定量限、保留时间和相对响应因子等方面进行方法验证。
3.1.2 3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法
3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法：试验组加入可溶性淀粉、α-淀粉酶以及α-AI，对照组不加α-AI，其他条件一致，反应完成后加入3，5-二硝基水杨酸，沸水浴后取出反应液室温冷却，测定吸光度值。该方法调整抑制剂溶液及α-淀粉酶溶液的浓度或用量，吸光度在0.4～0.7为宜。赵蓉等[50]建立DNS比色法测定从白芸豆中分离纯化α-AI活性的方法。最终确定在470 nm，2 mL DNS试剂以及反应时间5 min条件下结果最好。该方法平均回收率为99.95%（n=9），精密度实验RSD=1.01%。该方法具有简便、快捷、重复性良好等特点，适用于常规α-AI的测定。
3.1.3 微孔法
3，5-二硝基水杨酸（DNS）微孔法是基于DNS（3，5-二硝基水杨酸）比色法之上，对于检测波长、显色剂用量、显色时间等因素进行优化，该方法可大幅度降低试剂和时间的消耗，简化实验操作，更快速地对于α-AI进行常规检测。钟颖颖等[51]利用该方法对白芸豆中的α-AI进行了活性测定，最佳试验条件为测定波长 482 nm、DNS 用量 80 μL、反应时间 15 min、静置时间10 min。Negrulescu等[52]提出了一种基于DNS比色，适用于微量滴定板，并在改进的微波处理水浴中检测了蜂蜜样品及葡萄酒样品还原糖的方法。该方法结果准确，减少了检测时间和试剂用量，降低了检测的整体成本，且可同时分析多个样品，是一种高通量的检测技术。
3.1.4 血糖监测法
消化道中α-AI的存在可以延缓淀粉的消化和吸收，这对缓解餐后血糖升高具有重要意义。α-AI的体内活性可以通过肠道和血液中的葡萄糖水平来表征。研究人员[53]在一项研究中，采用肠腔外翻来测量小肠对葡萄糖吸收的方法，去除脂肪和肠系膜碎片后，在肠腔内加入葡萄糖和抑制剂进行体外培养，并在不同采样时间测定血糖水平。结果表明，分子量小于1 kDa的蛋白质水解物抑制了α-淀粉酶活性，降低了小肠对葡萄糖的摄取。Mojica等[54]利用高血糖大鼠模型，通过饲喂黑豆提取的蛋白类α-AI，最后通过测量大鼠血液中的血糖水平来评价黑豆α-AI对大鼠血糖的调控作用。
3.2 间接法
间接法是通过测定试验组（α-淀粉酶+淀粉，添加α-AI）与对照组（α-淀粉酶+淀粉，不添加 α-AI）各自反应后，淀粉的剩余量来表征α-AI的活性。试验组淀粉剩余量越多，表明α-AI抑制α-淀粉酶水解淀粉的作用越强。
3.2.1 碘-淀粉比色法
试验组加入可溶性淀粉、α-淀粉酶以及α-AI，对照组不加α-AI，空白组不加α-淀粉酶和α-AI，其他条件一致，根据吸光度的差异计算抑制剂的相对活度。谢雨杉等[55]利用此方法通过对淀粉液浓度和反应温度系列试验条件进行研究，确定α-AI的碘-淀粉比色法的最佳试验条件为：淀粉液浓度2.5%，反应最适温度40℃。此方法精密度为RSD=1.82%，平均回收率为99.03%（n=6）。由上可见，该检测方法简便、快捷、重复性好，可用于α-AI活性的常规检测。
3.2.2 电泳法
电泳法是基于提取蛋白在含有淀粉的凝胶上进行电泳分离，然后在α-淀粉酶溶液中孵育后凝胶电泳检测α-AI，最终通过碘与未消化的淀粉结合的染色方法显示α-AI。Fossum等[56]利用淀粉-聚丙烯酰胺凝胶对生物材料中淀粉酶抑制剂进行检测，该方法比Bernfeld法更加方便。Giri等[57]建立了一种利用凝胶电泳分离蛋白质类淀粉酶抑制剂的方法，该方法可以筛选单独的淀粉酶抑制剂对于各种淀粉酶的特异性。Fontanini等[58]优化了一种淀粉-聚丙烯酰胺凝胶双向分离的二维非变性体系，该方法可以提高蛋白条带的分辨率，并且在不需要纯化的情况下分离复杂蛋白质混合物中的单一抑制组分，并且可以分离和鉴定抑制斑点。毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）是一种全自动定量分析方法，具有分辨率高、分析时间短、样品用量少等优点，非常适合蛋白质的分离。毛细管电泳已成为临床、法医学和生物医学领域蛋白质分析的常规方法，同时也可用于从植物组织中提取蛋白质和对多肽进行分离[59]。在亲和毛细管电泳法中，配体以递增的浓度进入缓冲液中，并获得蛋白质溶液的色谱图。观察到的迁移时间（或峰面积）变化是配体与蛋白质分子发生相互作用，与已经得到的图谱比较来确定配体与蛋白质是否结合；在孵育方法中，蛋白质和配体在同一溶液中孵育，然后进行电泳，配体与蛋白质形成稳定的复合物，则复合物的峰可能与其他物质分离开[60]。Hamdan等[61]利用毛细管电泳法对植物中的α-AI筛选，结合紫外验证，最终发现了7种具有明显α-淀粉酶抑制效果的抑制剂，该方法后期结合质谱，则可能会将抑制剂相关的结构信息解析。Hodek等[62]建立了一种利用毛细管电泳研究淀粉与α-淀粉酶反应动力学的方法，用此方法对木犀草素、杨梅素和槲皮素单一以及混合作用抑制α-淀粉酶效果进行了研究，发现它们对α-淀粉酶的抑制没有协同作用。该方法适用于多种化合物及其混合物的快速检测，也适用于植物提取物的检测。
目前，对α-淀粉酶体外抑制活性的检测已经相当成熟，然而，α-淀粉酶的体内抑制活性检测还需进一步加强。随着计算机技术的进步，通过分子模拟将抑制剂和淀粉酶结合起来，已经成为筛选检测淀粉酶抑制剂的一种重要方法。蛋白类α-AI检测方法的比较见表2。
表2 蛋白类α-AI检测方法的比较
Table 2 Comparison of detection methods for protein α-amylase inhibitors
方法 原理 优缺点直接法 高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测（HPAEC-PAD）法脉冲安培检测 简单、灵敏、干扰少，复杂混合物适用；试验条件要求较高、经济实用性较低3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法 光电比色 灵敏度高，利于比较不同抑制剂活性及量效关系；结果准确性、系统稳定性较差微孔法 光电比色 简单高效、方便节约；条件优化较复杂血糖监测法 光电比色 直观性强、快速；取样较繁琐，体内外影响因素较多间接法 电泳法 络合反应 高效快速、灵敏，适用多种复杂蛋白混合物；试验操作要求较高碘-淀粉比色法 光电比色 操作简便、快速，经济实用；半定量法、灵敏度低，试验条件要求高
4 谷物蛋白类α-AI的功能特性
4.1 谷物蛋白类α-AI的降血糖作用
2型糖尿病以及由此引发的代谢综合征等问题在医学上是一个难题。以往研究一直认为α-AI对糖尿病患者仅仅是辅助降糖作用，而无直接治疗作用，近几年研究发现，糖尿病病人长时间高血糖状态是导致病人多系统多脏器损害的最主要原因[63]，而α-AI可直接降低餐后血糖含量。因此，其对于预防或者减轻2型糖尿病具有重要作用。GI血糖指数（glycemic index，GI）反映食物对人体血糖水平的影响程度。在临床营养学上，GI的概念主要被用于指导糖尿病人的日常饮食[64]。越来越多的研究表明[65]，通过抑制负责碳水化合物消化的酶来减少碳水化合物的吸收是一种良好的方法，即向食品中添加天然来源的淀粉酶或糖苷酶抑制剂，这些抑制剂通过抑制肠道内淀粉酶或糖苷酶的活力，延缓或阻碍碳水化合物的分解，减少葡萄糖的生成与吸收，降低餐后的血糖水平。
在天然存在的抑制剂中，α-淀粉酶抑制剂得到了极大的关注。自然界中存在的α-AI相比合成的来说，安全性较高，而谷物更是人们经常食用的粮食作物，因此，来自谷物天然的α-AI的生物安全性更高[66]，因而在防控糖尿病及其引起的疾病方面具有更为广阔的前景。杨宁等[67]对受试者进餐前服用白芸豆蛋白提取物对餐后血糖的改变进行研究，发现餐前15 min服用6 g白芸豆蛋白提取物可以有效降低进食白米饭后的血糖反应，血糖水平与服用剂量存在一定关系。在本试验研究范围内，服用最大剂量6 g时，其餐后血糖水平控制效果更佳。Ramli[68]研究了白米、糙米和糯米3种类型米的蛋白提取物对α-淀粉酶的抑制作用。在3种米中，抑制蛋白含量最高的是糙米（0.030±0.002 mg/mL）、糯米（0.006±0.001 mg/mL）和白米（0.005±0.001 mg/mL）次之。从α-淀粉酶的抑制率来看，在麦芽糖释放量最低的3种米中，糙米的抑制率最高（61.22%）。糙米中含有醇溶性的抑制蛋白，具有抑制α-淀粉酶等碳水化合物水解酶的能力，为糖尿病患者的饮食选择提供了参考。Kazumi[69]等发现荞麦中的α-AI白蛋白能够抑制淀粉水解成糖，可以减少餐后血糖升高，有助于预防糖尿病。研究发现，尽管荞麦中α-AI很容易被消化酶水解，但其水解产物仍具有抑制活性，同时其热稳定性好，这表明其在预防糖尿病方面具有很大的潜力。Jhan等[70]对5种次要无麸质谷物进行了化学成分、功能、结构、热学和营养特性的研究，发现高粱对于体外α-淀粉酶的抑制作用最强，显示出良好的抗糖尿病活性。张晓琦等[71]研究发现，连续使用剂量为150 mg/kg的白芸豆α-AI在7d后可明显降低高血糖大鼠的空腹血糖含量；使用剂量达到300 mg/kg时，对高血糖大鼠的糖耐受量具有明显的改善作用。张琪等[72]以45 mg/kg量的小麦α-AI灌胃四氧嘧啶糖尿病小鼠，发现小麦α-AI能够增加四氧嘧啶糖尿病小鼠的淀粉耐量，因此对糖尿病小鼠有降血糖作用，该作用机制可能与小肠内各肠段麦芽糖酶与蔗糖酶的活性有关。
综上所述，谷物蛋白类α-淀粉酶抑制剂通过抑制体内α-淀粉酶水解淀粉，从而达到降血糖的作用，如图2所示。
图2 谷物蛋白类α-AI的降血糖作用
Fig.2 Hypoglycemic effect of cereal protein α-amylase inhibitors
4.2 谷物蛋白类α-淀粉酶抑制剂的减肥作用
现阶段，肥胖问题已经成为人们关注的热点问题，而如何减肥也随之被重视。2016年，全球39%的男性和40%的18岁及以上女性超重，11%的男性和15%的女性肥胖[73]。在过去的40年中，超重和肥胖均显著增加，肥胖与超重逐渐趋于低龄化。α-AI能够抑制α-淀粉酶的活性，进而抑制或者减缓淀粉被转化为糖类的过程，即可减少糖向脂肪转化，增加脂肪消耗以减轻体重，故其在减肥领域有待深入研究。吴永宏等[74]研究发现，高、中剂量的小麦α-AI对于肥胖小鼠的肥胖评定指数以及脂肪湿重均有降低作用，高剂量的作用更加明显，且其减肥效应与其剂量呈正相关。陈一昆等[75]采用高（352 mg/kg）、中（141 mg/kg）、低（70 mg/kg）3 个剂量组的芸豆 α-AI连续灌胃 SD（sprague dawley，SD）大鼠45 d后发现，α-AI均对降低SD大鼠体重、睾丸周围脂肪垫质量及大鼠血液总胆固醇有显著效果（p＜0.05），说明芸豆中的α-AI对于小鼠具有减肥的作用。这有望将芸豆中的α-AI开发为降血糖或者体重控制的膳食补充剂。Wang等[76]采用随机、双盲和对照的研究方法，评价西南地区种植的菜豆对肥胖志愿者的减肥效果。试验结果发现，菜豆蛋白提取物组35 d后平均减重2.24 kg（平均每周0.448 kg），对照组平均减重0.29 kg（平均每周0.058 kg）。体重指数平均下降0.79，体脂平均下降1.53%，皮下脂肪厚度、腰围和臀围均显著减小。结果表明，菜豆蛋白提取物能在短时间内显著降低体重。徐君利[77]对44名志愿者进行分组试验，分为对照组（常规饮食管理）和观察组（常规饮食管理+白芸豆α-AI功能性食品）。最后发现，观察组在90 d时的体重以及身体质量指数（body mass index，BMI）显著低于对照组（p＜0.05），观察组人员的低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDLC）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）指标和粪便脂肪率显著低于对照组（p＜0.05），HDL-C和血糖与对照组不存在显著差异（p＞0.05），说明纳米白芸豆α-淀粉酶抑制剂脂质体功能性食品具有良好的减脂减重、改善血脂的效果。
如图3所示，谷物蛋白类α-淀粉酶抑制剂通过抑制体内的α-淀粉酶水解淀粉，降低葡萄糖的生成，从而抑制血糖转化为脂肪，最终实现减肥的目的。
图3 谷物蛋白类α-AI的减肥作用
Fig.3 Weight loss effect of cereal protein α-amylase inhibitors
5 展望
随着生活水平的提高，人们会出现一系列的疾病问题，如：糖尿病、高血脂、高血压、肥胖症等。对于患有上述疾病的人，为了减少或者避免化学药物带来的副作用以及出于对安全性、高效性的考虑，天然食物源的α-AI成为了更好的选择对象。目前，市场上用于减肥的商品化α-AI产品的制备原料仅限于北美白芸豆，也有对添加α-AI的方便粥以及纳米脂质功能性食品研究，但未进行体内、外的系统化研究验证，因此，这些产品未能在市场上进行推广，对于其他谷物来源的α-AI还有待于进一步的研究开发和利用。目前α-AI在食品中的应用还并不是很广泛，未来发展的方向倾向于开发降糖或者减肥的功能性食品。同时，对于α-AI在人体中发挥相应的作用以及相关的机制应进一步研究阐明。
α-AI对于肥胖、减肥以及潜在的药用作用等方面有重要的意义。本文对于天然的蛋白类α-AI的分离纯化、筛选检测以及功能特性进行了总结阐述，但仅仅依靠本文介绍的制备方法来获得蛋白类α-AI剂耗时耗力，产品成本较高。因此，未来可利用基因工程菌进行大量制备，将表达后的产物进行分离纯化，最终对产物进行生物活性、毒理学等安全性试验后进行利用，降低生产成本。
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