传统酸菜是生鲜菜上固有微生物在一定条件下发酵产生乳酸及各种风味物质而成[1-2]。乳酸菌群在酸菜的发酵体系中发挥主导作用[3]，其发酵产生的酸、醇、酯等呈味物质，赋予了酸菜特有的风味及口感[4]；乳酸菌代谢产生的乳酸和细菌素等物质可以抑制发酵体系中腐败菌的生长[5]；酸菜中的乳酸菌及其代谢物还具有助消化、调节肠道菌群、降血脂等生理功效[6-7]；酸菜中的乳酸菌还可以降解亚硝酸盐[8]。但是自然发酵的酸菜，因为参与作用的微生物种类多，缺少性能优良的专用乳酸菌酸菜发酵剂，产品易出现不稳定、腐烂率高、亚硝酸盐含量偏高等问题[9-11]。
富源酸菜是云南省富源县境内特有的一种酸菜，以萝卜或小油菜为主要原料，添加玉米面和饮用水，经发酵而成的具有地方风味的水酸菜，其加工方式与其他地方的酸菜有所不同，产品具有发酵周期短、酸丝长、黏稠滑腻和酸度高等特点，可直接食用或作为酸菜猪脚、红豆酸汤的配料，备受当地人喜爱，2016年被列入曲靖市非物质文化遗产名录[12]。目前富源酸菜生产仍以自然发酵为主，也同样存在自然发酵酸菜共性的问题，严重制约了富源酸菜推广和标准化生产。相关研究显示，直投式乳酸菌发酵的富源酸菜可以在一定程度上解决以上问题[13]，但是不同区域的不同菌种和菌株发酵特性存在显著差异[14-15]，而乳酸菌性能决定了酸菜的品质，尤其在酸菜发酵中产酸、耐酸耐盐和降解亚硝酸盐的能力[16]，所以选择适合的富源酸菜发酵菌种很关键。因此，从传统自然发酵富源酸菜中筛选本土优质的乳酸菌菌种，既能保证富源酸菜特殊的风味，又能提升富源酸菜的质量安全和推动其标准化生产。
本研究通过对云南富源县境自然发酵酸菜发酵液进行乳酸菌分离、纯化、发酵性能试验及鉴定，以期获得适合于富源酸菜标准化生产的菌种，为实现富源酸菜高品质规模化生产提供菌种资源和研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
菌源：云南富源县竹园镇及老厂镇自然发酵的红萝卜丝黏酸菜、白萝卜丝黏酸菜、小油菜黏酸菜。
MRS液体培养基:北京奥博星生物技术有限责任公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、Qiagen凝胶回收试剂盒、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂和引物：上海生工生物工程股份有限公司；氯化钠、亚硝酸钠、碳酸钙（均为分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司。
1.2 主要仪器与设备
TU1900紫外可见分光光度仪：北京普析通用仪器有限公司；PHS-3C型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；ME103电子分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；UPT-I-20T超纯水机：上海优普实业有限公司；TH2-C恒温摇床：太仓市实验设备厂；3730XL测序仪、2720 thermal cycler PCR仪:美国Applied Biosystems公司；DYCP-31DN DNA电泳槽、DYY-5稳压电泳仪：北京六一仪器厂；FR980凝胶成像仪：上海复日科技仪器有限公司；5415D高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司。
1.3 方法
参考罗强等[17]的方法，采集样品6份：选择发酵品质良好的酸菜，将坛中萝卜丝或小油菜与汁液充分混匀后，用无菌移液枪将汁液转移至灭菌瓶中，低温保存备用。
1.3.1 菌株分离及形态鉴定
参照王鑫宇[18]的方法，采用稀释涂布平板法，取1mL酸菜汁用0.85%无菌生理盐水梯度稀释10-1～10-6制备系列浓度的酸菜汁，混合均匀。依次选择10-3～10-6的稀释样品，分别取1 mL用涂布器涂布于MRS-CaCO3固体培养基，在38℃无氧条件下恒温培养箱中培养48 h～72 h，从MRS-CaCO3固体培养基上挑出有明显溶钙圈的单菌落，再经过3次划线分离培养；用革兰氏染色和过氧化氢酶试验法，将分离后无杂菌的菌株涂布于MRS固体培养基上，在38℃无氧条件下恒温培养箱中培养24h～36 h，观察长出的单菌落形态，挑取单菌落进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验，将革兰氏染色阳性和过氧化氢酶阴性的细菌在显微镜下观察其菌株形态特征并记录。得到的菌株经过3次划线分离，直到菌落镜检无杂菌，用MRS液体培养基进行传代培养。同时接种在MRS斜面培养基上于4℃冰箱保存菌种备用。
1.3.2 菌株发酵性能测定
1.3.2.1 乳酸菌产酸速度和产酸量的测定
将传代培养后的乳酸菌在MRS液态培养基中活化至109CFU/mL，以0.2%的接种量转接到MRS液体培养基中，在38℃的恒温培养箱中培养24 h，用pH计测量pH值，以空白MRS液体培养基作为对照。产酸量测定按照GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》[19]。
1.3.2.2 乳酸菌降解亚硝酸盐能力的测定
将活化的菌株按照2%的接种量接入5 mL的MRS液体培养基中，该培养基含有200 μg/mL亚硝酸钠并且已灭菌，38℃培养24 h，参照国家标准GB 5009.33—2016《食品安全国家标准食品中硝酸盐与亚硝酸盐的测定》[20]测定亚硝酸钠含量。计算菌株的亚硝酸盐降解率。
1.3.2.3 乳酸菌耐酸的生长测定
参照李小艳等[21]的方法，将MRS液体培养基pH值分别调为 2、3、4、5、6，将经过活化的菌株按照 2%的接种量接入上述的MRS液体培养基中，在38℃的恒温培养箱中培养24 h，采用紫外分光光度计测定其在600 nm波长的吸光度（OD600）。
1.3.2.4 乳酸菌耐盐的生长测定
将MRS液体培养基中分别添加NaCl，使其浓度分别为 0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL，将经过活化的菌株按照2%的接种量接种上述的MRS液体培养基中，在38℃的恒温培养箱中培养24 h，采用紫外分光光度计测定OD600值。
1.3.3 菌株分子生物学鉴定
参照丁冯玲等[22]的方法，采用16S rDNA序列同源相似性分析做菌种鉴定，测序引物序列如表1所示。
表1 测序引物序列
Table 1 Sequence of the primer
名称 序列5'→3' 扩增序列 PCR长度/bp 7F 1540R CAGAGTTTGATCCTGGCTAGGAGGTGATCCAGCCGCA 16S rDNA 1 500 27F 1492R AGTTTGATCMTGGCTCAGGGTTACCTTGTTACGACTT 16S rDNA 1 500
1.3.4 优质菌株的应用
将筛选出来的优质菌株进行纯种发酵试验，并与自然发酵的富源酸菜进行比较。
富源酸菜纯种发酵的工艺流程：萝卜清洗、切丝→入缸→倒入玉米面、山泉水的混合物（已灭菌）→接入菌种→密封发酵→成品。
乳酸菌接种量为萝卜质量的0.2%，在38℃接种，保温发酵5 h后移至常温发酵7 d。每天测定酸菜发酵液的总酸、pH值、亚硝酸盐含量，并进行感官评价。请10位专业人员参照表2进行感官评分，理化检测参考文献[19-20]的方法。
表2 酸菜的感官评分标准
Table 2 Standards of sensory evaluation of Fuyuan pickle
类别 评分标准 评分组织形态 差别极大 8（与新鲜原料相比）（20分） 差别大 11差别小 14略有差别 17基本一致 20气味（20分） 无发酵香 8略有发酵香 11有发酵香 14香味稍浓或稍淡 17香味适宜 20口感（20分） 无酸味 8微酸味 11酸味刺激 14酸味较柔和 17酸味柔和 20脆性（20分） 软 8较软 11略有脆性 14有脆性 17脆性足 20色泽（20分） 暗淡伴有白花 8暗淡无白花 11略有光泽 14有光泽 17光泽度好 20
1.4 数据分析
所有试验数据均重复进行3次，结果取平均值。用Excel 2010绘制图表，用SPSS19.0进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 乳酸菌的分离纯化
6份酸菜汁样品中经过分离培养、革兰氏染色和过氧化氢酶试验，菌落形态和生物学鉴定结果见表3。
表3 乳酸菌菌落形态及生物学鉴定
Table 3 Colony morphology of the isolated strains and biological identification
注：+表示阳性；-表示阴性。
菌株编号 菌落特征 格兰氏染色过氧化氢酶N1 圆形、不透明、微白色、边缘整齐、菌落较小、平滑、中间隆起、透明圈超大+ -N2 圆形、不透明、微白色、边缘整齐、菌落较大、有凹凸感、中间隆起、有透明圈+ -N3 圆形、不透明、白色、边缘不整齐、菌落平整、有透明圈+ -N4 圆形、不透明、白色、边缘整齐、菌落平整、有透明圈+ -
根据《乳酸菌分类鉴定及实验方法》[23]和《常见细菌系统鉴定手册》[24]，6个样品中均有4株菌落特征类似的菌株，经生物学初步鉴定均为乳酸菌。
2.2 菌株产酸速度和产酸量的测定
将N1、N2、N3、N4 4个菌株以2%接种量接种24 h后的pH值变化如图1所示。
图1 菌株接种24 h的pH值变化
Fig.1 pH value of the liquid of the pickle fermented with different strains for 24 h
由图1可知，菌株pH值均下降，空白对照的pH值为5.95，其中N1菌株pH值最小，为4.01，N3菌株pH值在4个菌株中最大，为5.03。说明N1菌株产酸速度快。
将N1、N2、N3、N4 4个菌株以2%接种量接种24 h后的产酸量如图2所示。
图2 接种24 h菌株的产酸量
Fig.2 Acid production of strains inoculated for 24 h
由图2可知，其中N1菌株产酸量最大，达到1.10%，N3菌株产酸量最小，为0.51%。说明N1菌株产酸速度快，产酸量高。
2.3 菌株降解亚硝酸盐能力的测定
将N1、N2、N3、N44个菌株用含有亚硝酸钠的MRS液体培养基培养24 h，降解亚硝酸效果如图3所示。
图3 菌株降解亚硝酸盐的量
Fig.3 Amount of nitrite degraded by strains
由图3可知，不同种类的乳酸菌降解能力不一样，其中N1菌株降解效果最好，可以将亚硝酸盐含量降低到28.18 μg/mL，降解率为85.91%，降解率最大；N3菌株可以将亚硝酸盐含量降低到31.27 μg/mL，降解率为84.37%，降解率最小。
2.4 菌株耐酸的生长测定
菌株接种24 h后的OD600值如图4。
图4 菌株耐受pH值的OD600值
Fig.4 OD600of strains under different pH
由图4可知，不同的菌株耐酸程度不同，所有菌株在pH2时OD600值最小，在pH5时OD600值最大。pH值低于3.0以下生长缓慢，其OD600值基本不变；pH值在3.0～5.0之间，菌株生长迅速；在pH值为5.0～6.0时，对菌株生长影响不大。总体菌株对强酸的耐受力不强，对弱酸的耐受力较强。N1菌株在pH3～6之间的MRS液体培养基中OD600值明显高于其他菌株。
2.5 乳酸菌耐盐的生长情况
菌株接种24 h后的OD600值如图5。
图5 菌株耐受氯化钠的OD600值
Fig.5 OD600of strains in the presence of NaCl at different concentration
由图5可知，氯化钠浓度低于0.04 mg/mL时，4个菌株的OD600值随浓度变化很小，说明菌株均可在低于0.04 mg/mL氯化钠溶液中很好地生长；当氯化钠浓度大于0.04 mg/mL时，OD600值开始减小，之后呈上升趋势。但在整个试验中，4个菌株的耐盐性不同，N1菌株生长受盐浓度影响不大，其他3个菌株受盐浓度的影响较为明显。
2.6 16S rDNA序列分析
综合以上发酵性能试验结果，选取表现较为优异的N1菌种进行16S rDNA序列分析，结果见图6。
图6 N1的16S rDNA PCR扩增产物电泳图
Fig.6 Electrophoretogram of PCR product of 16S rDNA of strain N1
由图6可知，所制备的PCR产物条带清晰，片段长为1493 bp，具有典型的16S rDNA特征，符合测序要求。
利用NCBI的BLAST软件，将N1的16S rDNA与GenBank数据库中的16S rDNA基因序列进行了比对，结果见表4。
表4 N1菌株的16S rDNA序列同源相似性分析
Table 4 Homology of 16S rDNA sequence of strain N1
鉴定参考菌 最高分 总分 系列比对/% 相似度/% 登记号Lactobacillus buchneri gene for 16S ribosomal RNA，partial sequence，strain：DG1 2 750 2 750 100 99.93 LC094428.1 Lentilactobacillus buchneri strain MGB0786 chromosome，complete genome 2 745 1 3654 100 99.87 CP043615.1 Lactobacillus buchneri CD034，complete genome 2 745 13 704 100 99.87 CP003043.1 Lactobacillus buchneri NRRL B-30929，complete genome 2 745 13 670 100 99.87 CP002652.1 Lactobacillus sp.strain MSR108 16S ribosomal RNA gene，partial sequence 2 743 2 743 99 99.87 MK491616.1 Lactobacillus dextrinicus partial 16S rRNA gene，strain SN5 2 743 2 743 100 99.80 LN870301.1 Lactobacillus buchneri gene for 16S rRNA，partial sequence，strain：YIT 0077 2 743 2 743 100 99.80 AB429368.1 Lentilactobacillus buchneri strain JCM 1115 16S ribosomal RNA，partial sequence 2 743 2 743 99 99.87 NR_041293.1 Lactobacillus buchneri strain FD1 16S ribosomal RNA gene，partial sequence 2 741 2 741 100 99.80 JN188386.1 Lentilactobacillus buchneri strain ATCC 4005 chromosome，complete genome 2 739 13 619 100 99.80 CP073066.1
由表4可知，该菌株被鉴定为Lactobacillus（乳杆菌属），Lactobacillus buchneri（布氏乳杆菌）。
2.7 优质菌株的应用
优质菌株纯种发酵与自然发酵7 d内pH值、总酸、亚硝酸盐的变化如图7～图9所示。
图7 发酵7 d内pH值变化
Fig.7 Change of pH value within 7 days of fermentation
图8 发酵7 d内总酸含量变化
Fig.8 Change of total acid content within 7 days of fermentation
图9 发酵7 d内亚硝酸盐含量变化
Fig.9 Change of nitrite content within 7 days of fermentation
添加N1菌株的酸菜与自然发酵相比，颜色透亮，有光泽，有独特的酸菜香味，香气浓郁且纯正，脆度高，质量均匀，产酸速度快、产酸量高，亚硝酸盐含量低，亚硝酸盐峰值提前，7 d内能使亚硝酸盐达到安全的水平，比GB 2762—2022《食品安全国家标准食品中污染物限量》中关于酱腌菜的规定（20 mg/kg）低[25]。
3 结论
本研究从传统自然发酵法制作的富源酸菜中分离纯化后获得4株乳酸菌；通过产酸、降解亚硝酸盐、耐盐、耐酸等发酵性能筛选，其中N1菌株性能最优。N1菌株经分子生物学16S rDNA鉴定为乳杆菌属（Lactobacillus），布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）。将优异菌株N1应用于富源酸菜进行纯种发酵，与自然发酵相比，感官评分更高、pH值更低、总酸含量更多、亚硝酸含量更少，并且亚硝酸峰值提前，说明筛选出的优异菌株N1能够有效缩短发酵周期，并且提高富源水酸菜的质量和安全性，发酵特性优质。本研究结果可为传统富源酸菜品质改良和优质菌种资源开发提供参考依据和技术支持。
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