稻谷作为主要粮食作物，广泛种植于世界各地[1]。中国稻作历史悠久且产量逐年增加，为提高稻谷的食用品质，需要对其进行一系列加工处理从而保证大米产品质量，加工后的大米因失去谷壳保护，导致其所含营养物质（如蛋白质、脂类、碳水化合物等）外露，一旦温湿度适宜，会形成天然的微生物培养基，使得大米在储藏过程中极易出现质量安全问题，其中以霉菌侵染最为突出，尤其是在南方高温高湿区域[2-3]。广西地区作为我国传统的稻米生产及储备区，该区域气候具有终年高湿、冬季短、夏季长等特点，为霉菌的自然生长繁殖提供了适宜的条件。这不仅严重影响广大消费者的身体健康，同时也给国家粮食贮藏企业造成重大经济损失，甚至可能破坏国家粮食供给平衡[4]。因此，针对大米霉变问题尤其是大米早期霉变的预警研究很有必要。
微生物在生长繁殖代谢过程中产生的挥发性有机化合物（microbial volatile organic compounds，mVOCs）多数属于次级代谢产物，这些特征物质被认为能够表征其生理活动状态，因而在临床诊断和环境监测中被广泛应用，作为揭示微生物污染食品状况的新型有效手段。大米霉变过程中自身营养物质被消耗，霉菌通过生理代谢产生了真菌毒素、抗生素等次级代谢产物，同时伴随产生醇、醛、酮等复杂的挥发性气味物质，这使得通过气味物质变化快速判别大米是否霉变成为可能[5-6]。
当前，由霉变引起的大米品质劣变仍未得到有效控制。传统霉变的评判方法主要采用感官评定法（如视觉、嗅觉等）[7]，但该方法难以判断霉菌变化的具体情况，导致评判结果的准确性与重复性不佳。理化指标检测法主要依赖于测定微生物菌落数、霉菌毒素等指标，常采用色谱及其联用技术（如薄层色谱、高效液相色谱、液质联用等）进行检测，但该类方法需要进行样品前处理、操作步骤繁杂耗时，且分析人员需要具备相应的专业知识背景，难以满足实际应用检测大米霉变情况的需求。
目前，针对mVOCs的常用分析检测方法主要包括色谱法[8]、气质联用技术[9-10]、电子鼻技术[11]以及光谱技术等[12-14]，但是该类研究针对检测范围内的全部气味物质进行解析，仅仅适用于霉变后期样品的判别，且未能找出mVOCs表征霉变过程的标志性关键物质成分。此外，电子鼻技术中气体传感器的稳定性、准确性、抗干扰性等指标还有待进一步提高；气质联用法仍面临前述同样问题。因此，有必要开发一种能够快速、简便、准确判断大米霉变的新方法。
目前，气相-离子迁移谱（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS） 技术在 mVOCs研究领域已展现出相当大的潜力，尤其在食品产地鉴别[15-16]、欺诈识别[17-18]、新鲜度检测、品质评价与等级判别[19-20]等领域均有广泛的应用，而基于GC-IMS技术涉及微生物研究与食品霉变分析虽已有相关报道[21-22]，但在微生物霉变气味特征选取方法方面还有进一步开发。因此，本文以广西特色香米为研究对象，研究引起霉变微生物生理活动产生的mVOCs信息，旨在为GCIMS检测技术应用于大米早期霉变预警分析提供一种新思路，为大米及其相关食品、农产品的品质分析、贮藏保鲜等研究领域提供理论基础和科学思路。
1 材料与方法
1.1 材料处理
香米样品（31份）：市售，产自广西；马铃薯（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯 200 g（切片，沸水煮30 min，8 层纱布过滤），葡萄糖 20 g，琼脂 20 g，补水至体积1 L，121℃下灭菌20 min备用。基于前期已有研究[23]，从自然霉变大米中分离筛选出6种主要霉菌，分别为黑曲霉、微紫青霉、变换青霉、绳状青霉、黄曲霉、寄生曲霉（分别用字母A～F表示），分筛后的霉菌分别保存于PDA培养基斜面上，并于4℃条件下储藏备用。
1.2 仪器与设备
ZHJH-C1112C型超净工作台：上海智城分析仪器制造有限公司；E124S型电子分析天平：宁波莱福科技有限公司；ZXSD-R1430型生化培养箱：上海智城分析仪器制造有限公司；1H1-00053型FlavourSpec® GCIMS分析仪（配备CTC CombiPAL自动顶空进样器）：德国G.A.S公司。
1.3 方法
1.3.1 样品制备
培养基制备：将6种霉菌分别转移至PDA培养基表面，并将其放置恒温恒湿培养箱中进行活化，培养温度 28℃，相对湿度（relative humidity，RH）80%，培养时间8 d，待霉菌活化完成后备用。
样品制备：称取10 g香米于恒温恒湿培养箱中（35℃、90%RH）进行培养，每天观察香米感官表象变化，当香米表面失去光泽、变黄，出现“起眼”、“起筋”现象并伴有明显霉味时即停止培养，作为自然霉变香米备用。同时，以新鲜香米样品作为对照，按相同条件测定其自身风味成分，用以后期对照筛选霉变微生物的特征气味物质。
1.3.2 GC-IMS条件
待测样品制备完毕后，准确量取5g样品置于20mL顶空进样瓶中，进行进样检测，顶空GC-IMS具体检测条件见表1。
表1 霉菌GC-IMS检测条件
Table 1 Detection parameters of moulds using GC-IMS
类别 条件 参数值顶空自动进样器 孵化温度 60℃孵化时间 10 min加热模式 振荡加热进样针温度 80℃进样体积 500 μL清洗时间 0.5 min气相色谱 柱温 40℃色谱柱 SE-30（30 m×0.20 mm，0.25 μm）载气 高纯氮气，纯度≥99.999%载气程序 初始流速为2mL/min，持续2 min后在8 min内线性增加至15 mL/min；接着10 min内增加至100 mL/min；最后10 min内增加至150 mL/min离子迁移谱 离子源 氚（6.5 keV）迁移管温度 45℃迁移气流速 150 mL/min迁移管长度 9.8 cm离子源模式 正离子模式扫描次数 32电场强度 400 V/cm
1.4 数据处理
使用 GC-IMS Library Search（Version 1.0.3）软件对图谱中特征峰对应的mVOCs物质进行定性分析；采用LAV（Version 2.0.1）软件进行二维数据可视化分析；采用MATLAB（Version R2009b）软件进行主成分分析（principal component analysis，PCA） 以及 k 近邻（k nearest neighbor，kNN）判别分析。
2 结果与分析
2.1 特征峰选取
图1为6种霉菌接种PDA培养基的GC-IMS二维图谱，图2为所有香米样品对应的GC-IMS图谱按像素点位置计算得到的标准差图谱，图3为依据香米样品标准差图谱筛选得到的19个特征峰位置信息。
图1 不同霉菌的GC-IMS图谱
Fig.1 GC-IMS map of different molds
A.黑曲霉；B.微紫青霉；C.变幻青霉；D.绳状青霉；E.黄曲霉；F.寄生曲霉。
图2 香米样品GC-IMS图谱标准差
Fig.2 Standard deviation of GC-IMS map of fragrant rice samples
图3 19个特征峰选取位置
Fig.3 19 Characteristic peak selection
由图1可知，不同霉菌有共同的mVOCs物质产生，见图1A中矩形标记区域；不同菌种产生的mVOCs图谱存在一定的差异，如变幻青霉图谱中矩阵标记区域（见图1C），该位置对应的气味物质成分在其他霉菌样品中未出现；以所有样本的GC-IMS二维图谱为对象，计算二维图谱每个像素点对应的标准差，以标准差值作为表征图谱中特征峰的有无或强度差异变化。由图2可知，标准差图谱中的特征区域即可作为二维图谱特征峰选择的依据[24]；结合视觉观察方法分析、筛选原始图谱中霉变微生物产生的差异性或共有性mVOCs物质。由图3可知，最终共筛选出19个特征峰区域用以表征霉变微生物的气味特征。
2.2 霉变mVOCs分析
使用GC-IMS Library Search软件对筛选出的特征峰进行mVOCs化合物信息检索，去除已筛选特征峰中部分单体与二聚体对应同一种化合物外，19个特征峰最终共识别出16种挥发性气味物质，其中1-辛烯-3-醇（标记编号 1、15）、正丁醇（标记编号 13、19）和 2-丁酮（标记编号17、18）3种物质均存在二聚体，其中前者编号为单体（Sp），后者为二聚体（Dp），具体识别出的mVOCs物质信息见表2。
表2 筛选出的特征峰对应的化合物信息
Table 2 Compound information corresponding to the selected characteristic features
类别 编号 化合物名称 保留时间/s漂移时间/ms 特征峰强度值/V A B C D E F醇类 1 1-辛烯-3-醇（Sp） 553.343 1.152 3 0.624 0.751 0.695 0.926 0.819 0.358 15 1-辛烯-3-醇（Dp） 555.846 1.595 2 0.043 0.076 0.355 0.182 0.104 0.019 2 正戊醇 250.764 1.253 7 0.088 0.129 0.118 0.182 0.08 0.067 4糠醇 398.078 1.366 0 0.074 0.094 0.071 0.061 0.061 0.061 9叶醇 318.672 1.213 0 0.024 0.148 0.343 0.016 0.014 0.011 10 丙醇 127.749 1.116 2 2.317 2.179 2.471 0.658 0.752 2.105 14 苯乙醇 826.566 1.498 6 0.060 0.044 0.049 0.043 0.043 0.062 17 正丁醇（Sp） 176.896 1.394 0 0.177 0.029 0.050 0.520 0.105 0.019 18 正丁醇（Dp） 180.800 1.184 5 0.211 0.133 0.162 0.277 0.225 0.163醛类 5 正辛醛 591.790 1.406 3 0.021 0.212 0.229 0.097 0.136 0.051 6 苯甲醛 452.458 1.170 2 0.022 0.358 0.633 0.053 0.026 0.039酮类 13 2-丁酮（Sp） 151.806 1.060 5 0.268 0.289 0.349 0.502 0.129 0.286 16 2，3-丁二酮 146.367 1.191 5 0.213 0.281 0.234 0.278 0.317 0.307 19 2-丁酮（Dp） 149.934 1.240 0 0.091 0.078 0.013 0.276 0.028 0.071酯类 11 醋酸异丙酯 163.440 1.171 3 0.563 0.137 0.077 0.834 0.084 0.035 12 乙酸乙酯 158.234 1.094 4 0.210 0.027 0.028 0.072 0.100 0.041吡嗪类 7 2-甲基吡嗪 287.973 1.077 0 0.017 0.872 0.738 0.025 0.013 0.019 8 2，6-二甲基吡嗪 451.789 1.554 6 0.014 0.071 0.323 0.014 0.015 0.014酸类 3 正己酸 574.247 1.309 1 0.163 0.430 0.256 0.089 0.361 0.057
由表2可知，霉菌在生长代谢过程中主要产生醇类、酮类、醛类以及酯类等物质，其中6种霉菌产生的共有mVOCs物质有1-辛烯-3-醇、正戊醇、糠醇、苯乙醇、正丁醇、2，3-二丁酮、苯甲醛、2-甲基吡嗪以及叶醇，对应编号分别为 1、2、4、14、18、16、6、7、9；从特征离子峰响应信号数量级差异角度观察发现，苯甲醛、2-甲基吡嗪和叶醇3种物质为微紫青霉和变幻青霉所产生；2，6-二甲基吡嗪则是变幻青霉所特有的气味物质；结合mVOCs 2.0在线数据库对比分析可知[25]，1-辛烯-3-醇和苯乙醇与谱库检索结果一致，为6种霉菌产生的共有代谢产物，其均通过游离氨基酸代谢而形成；其他mVOCs物质与谱库检索结果有所差异，如3种曲霉通过游离氨基酸代谢等途径均可形成正戊醇、叶醇和丙醇等物质，但在黄曲霉样品中叶醇物质对应的特征离子峰强度值为0.014，小于3倍的仪器噪声值[26]，因此认定该物质并未被检测出，同时，部分物质成分虽被检测出，但未在mVOCs 2.0数据库检索到，这可能是由于数据库建设所用设备的检测限差异所导致。
2.3 判别分析
2.3.1 主成分判别分析
为验证提取香米霉变mVOCs特征变量的有效性，以正常香米样品与自然霉变样品为研究对象进行GC-IMS检测，并提取表2中筛选出的特征峰对应位置mVOCs的峰强度，并进行PCA分析，结果如图4所示。
图4 主成分得分图分析
Fig.4 Diagram of principal component score analysis
由图4可知，经过PCA处理后，PC1和PC2的贡献率分别为81.52%、11.75%，前2个主成分的累积贡献率为93.27%，表明转换后的数据能够表征原始数据的绝大部分信息[27]；正常香米和自然霉变香米样品在主成分得分图中可明显分为2个簇类，且其均有各自归属区域，这表明基于选取的特征变量区分霉变香米具有一定的可行性。
2.3.2 k近邻判别分析
进一步采用kNN算法对其进行判别分析，并采用五次五折交叉验证方法对判别模型的准确性进行评价，即将62个样本数据分为5个样本子集，每次取出其中1个子集作为验证集，其余4个子集作为训练集，以最终5个测试子集的平均识别率作为指标评判样本的识别率，结果如表3所示。
表3 kNN模型的五次五折交叉验证分类结果
Table 3 Classification results of a five-repeated 5-fold cross validation of the kNN model
交叉验证次数 验证集准确率/% 测试集准确率/%1 100.00 100.00 2 97.22 92.30 3 97.30 92.30 4 100.00 100.00 5 100.00 91.67平均值 98.90 95.25
由表3可知，kNN在霉变香米判别中表现出优秀的判别性能，五次五折交叉验证中测试集识别率均高于90%以上，测试集样品识别率平均值为95.25%，表明kNN判别模型的稳定性和适用性。
3 结论
本研究借助GC-IMS技术对导致广西香米霉变的主要霉菌的mVOCs成分进行了分析检测，通过数理统计结合视觉观察方法确定霉变香米微生物生理代谢过程中mVOCs的特征性成分，结合化学计量学方法实现了对正常大米和霉变大米的判别，并验证了判别模型的稳定性和适用性，证明了GC-IMS检测分析技术结合化学计量学方法在大米霉变监测中的可行性，后期可进一步结合其他分析方法研究香米霉变过程不同阶段的关键性mVOCs，为大米早期霉变预警提供具有可行性新方法。
[1]ARIFF E E E,RAHIM H,HARUN R,et al.Fragrant rice overview:Benefits and implications of local production[J].Economic and Technology Management Review,2019,14:1-11.
[2] 陈传华,李虎,刘广林,等.广西香稻育种现状及发展策略[J].中国稻米,2017,23(6):117-120.CHEN Chuanhua,LI Hu,LIU Guanglin,et al.Breeding status and development strategy of fragrant rice in Guangxi Province[J].China Rice,2017,23(6):117-120.
[3] ZHANG J S,TONG T Y,POTCHO P M,et al.Harvest time effects on yield,quality and aroma of fragrant rice[J].Journal of Plant Growth Regulation,2021,40(5):2249-2257.
[4]
LIWI
SKA-BARTEL M,BURNS D T,ELLIOTT C,et al.Rice fraud a global problem:A review of analytical tools to detect species,country of origin and adulterations[J].Trends in Food Science&Technology,2021,116:36-46.
[5] KONG L L,LUO H W,MO Z W,et al.Grain yield,quality and 2-acetyl-1-pyrroline of fragrant rice in response to different planting seasons in South China[J].Phyton,2020,89(3):705-714.
[6] LUO H W,HE L X,DU B,et al.Biofortification with chelating selenium in fragrant rice:Effects on photosynthetic rates,aroma,grain quality and yield formation[J].Field Crops Research,2020,255:107909.
[7]AHMAD SHAKRI A N,KASIM K F,RUKUNUDIN I B.Chemical compositions and physical properties of selected Malaysian rice:A review[J].IOP Conference Series:Earth and Environmental Science,2021,765(1):012024.
[8]CHEAJESADAGUL P,ARNAUDGUILHEM C,SHIOWATANA J,et al.Discrimination of geographical origin of rice based on multielement fingerprinting by high resolution inductively coupled plasma mass spectrometry[J].Food Chemistry,2013,141(4):3504-3509.
[9] GANOPOULOS I,ARGIRIOU A,TSAFTARIS A.Adulterations in Basmati rice detected quantitatively by combined use of microsatellite and fragrance typing with High Resolution Melting(HRM)analysis[J].Food Chemistry,2011,129(2):652-659.
[10]PENG J F,YANG Y,ZHOU Y P,et al.Headspace solid-phase microextraction coupled to gas chromatography-mass spectrometry with selected ion monitoring for the determination of four food flavoring compounds and its application in identifying artificially scented rice[J].Food Chemistry,2020,313:126136.
[11]TIMSORN K,LORJAROENPHON Y,WONGCHOOSUK C.Identification of adulteration in uncooked Jasmine rice by a portable lowcost artificial olfactory system[J].Measurement,2017,108:67-76.
[12]SUN C M,LIU T,JI C X,et al.Evaluation and analysis the chalkiness of connected rice kernels based on image processing technology and support vector machine[J].Journal of Cereal Science,2014,60(2):426-432.
[13]TIAN F M,TAN F,ZHU P P.Multi-classification identification of PLS in rice spectra with different pre-treatments and K/S optimisation[J].Vibrational Spectroscopy,2020,109:103069.
[14]WU H Y,WEI Y,YANG R J,et al.Analysis of chalk in rice by twodimensional correlation spectroscopy[J].Journal of Molecular Structure,2020,1218:128471.
[15]LI W Q,CHEN Y P,BLANK I,et al.GC×GC-ToF-MS and GCIMS based volatile profile characterization of the Chinese dry-cured hams from different regions[J].Food Research International,2021,142:110222.
[16]LIU D Y,BAI L,FENG X,et al.Characterization of Jinhua ham aroma profiles in specific to aging time by gas chromatography-ion mobility spectrometry(GC-IMS)[J].Meat Science,2020,168:108178.
[17]ARROYO-MANZANARES N,GARCÍA-NICOLÁS M,CASTELL A,et al.Untargeted headspace gas chromatography-ion mobility spectrometry analysis for detection of adulterated honey[J].Talanta,2019,205:120123.
[18]CHEN T,QI X P,LU D L,et al.Gas chromatography-ion mobility spectrometric classification of vegetable oils based on digital image processing[J].Journal of Food Measurement and Characterization,2019,13(3):1973-1979.
[19]DEL MAR CONTRERAS M,APARICIO L,ARCE L.Usefulness of GC-IMS for rapid quantitative analysis without sample treatment:Focus on ethanol,one of the potential classification markers of olive oils[J].LWT-Food Science and Technology,2020,120:108897.
[20]DEL MAR CONTRERAS M,ARROYO-MANZANARES N,ARCE C,et al.HS-GC-IMS and chemometric data treatment for food authenticity assessment:Olive oil mapping and classification through two different devices as an example[J].Food Control,2019,98:82-93.
[21]GU S,CHEN W,WANG Z H,et al.Rapid detection of Aspergillus spp.infection levels on milled rice by headspace-gas chromatography ion-mobility spectrometry(HS-GC-IMS)and E-nose[J].LWTFood Science and Technology,2020,132:109758.
[22]谷航,陈通,陈明杰,等.气相-离子迁移谱联用技术评定大米霉变程度的应用研究[J].中国粮油学报,2019,34(9):118-124.GU Hang,CHEN Tong,CHEN Mingjie,et al.Application of gas chromatography-ion migration spectrometry(GC-IMS)to evaluate the degree of mildew in rice[J].Journal of the Chinese Cereals and Oils Association,2019,34(9):118-124.
[23]CHEN T,LIU C Y,MENG L L,et al.Early warning of rice mildew based on gas chromatography-ion mobility spectrometry technology and chemometrics[J].Journal of Food Measurement and Characterization,2021,15(2):1939-1948.
[24]HOLLINGSWORTH B V,REICHENBACH S E,TAO Q P,et al.Comparative visualization for comprehensive two-dimensional gas chromatography[J].Journal of Chromatography A,2006,1105(1-2):51-58.
[25]LEMFACK M C,GOHLKE B O,TOGUEM S M T,et al.mVOC 2.0:A database of microbial volatiles[J].Nucleic Acids Research,2018,46(D1):D1261-D1265.
[26]ALIREZA GHORASHI S,ALINOORI A H,HAJIALIGOL S.Signal-to-noise enhancement in TSSI-GC-IMS:Development of two dimensional sensor for detection of chemicals[J].Microelectronics Journal,2014,45(12):1634-1640.
[27]GRANATO D,SANTOS J S,ESCHER G B,et al.Use of principal component analysis(PCA)and hierarchical cluster analysis(HCA)for multivariate association between bioactive compounds and functional properties in foods:A critical perspective[J].Trends in Food Science&Technology,2018,72:83-90.