鱼露，又称鱼酱油、胰油，是一种传统的东方食品[1]，主要以海洋低值鱼类、淡水鱼虾或水产加工废弃物为原料，在高盐条件下经过一两年的发酵制成[2]，营养丰富、香气浓郁、味道鲜美，被世界各地消费者广泛接受。鱼露的生产主要分布在东南亚如越南、泰国，我国东部沿海地带，在欧洲和非洲地区也有分布[3-4]。进入二十世纪八十年代以来，鱼露产业发展迅速，目前国内产量每年约10万t以上[5]。鱼露生产过程中，不可避免的产生鱼头、鱼骨等大量发酵尾料，不加以利用会造成极大的资源浪费[6-7]，人口的增长，食物资源的短缺，也必然要求综合利用鱼体的价值[8-9]。鱼露发酵尾料中含有大量的蛋白质[10-11]，从鱼露发酵尾料中提取蛋白质、回收胶原蛋白，进行精加工，制备氨基酸强化剂、特殊风味的鱼味调味剂或开发具有生物活性的多肽，也是鱼露生产行业新的经济增长点[12]。蛋白质经酶水解后得到水解蛋白，该类蛋白质主要为低分子的多肽，含人体所需的必需氨基酸、牛磺酸、碘、硒以及B族维生素，水溶性好，营养丰富，具有增强免疫力和降低胆固醇等生理功效，极易被人体消化吸收[13-14]。蛋白酶的成本随着酶技术的发展也在不断降低，水解技术已经成为制备水解蛋白较为有效的方法[15]，陈紫红等[16]利用木瓜蛋白酶水解斑点叉尾鮰鱼下脚料制备多肽，通过条件优化得到水解液的水解度为38.89%，为斑点叉尾鮰鱼附加值产品的开发提供了新的思路。王可琦等[17]以鲽鱼加工过程中的下脚料为原料，通过中性蛋白酶和风味蛋白酶进行复配，在最优条件下水解度可达44.56%。水解技术的应用可大大增加鱼类资源的利用率，将该技术用于鱼露发酵尾料中，开发其中的蛋白资源可以有效提高鱼露发酵产品的附加值，目前鲜见该方面的报道。
本文以鱼露的发酵尾料为原料，利用蛋白酶对其进行水解，通过单因素轮换法和响应面分析法优化其蛋白水解工艺，并对其水解产物抗氧化性进行研究，为后续鱼露发酵尾料的综合利用提供相应的试验依据和理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
烘干后的鱼露发酵尾料：威海浦源食品有限公司。
中性蛋白酶（10万 U/g）、木瓜蛋白酶（10万 U/g）、碱性蛋白酶（20万 U/g）、风味蛋白酶（10万 U/g）：安琪酵母股份有限公司；硫酸、盐酸（分析纯）：烟台东明化工有限公司；甲醛（分析纯）：天津天力化学试剂有限公司；氢氧化钠、硼酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、石油醚（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；A004-96T羟基自由基清除能力测试试剂盒、96T氮自由基（DPPH）清除能力测试试剂盒：上海惠诚生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
KT8200凯氏定氮仪：福斯华（北京）科贸有限公司；pHS-3c型pH计、752型紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；DZKW-A水浴锅：上海树立仪器仪表有限公司；HFJ-10匀浆机：上海楚定分析仪器有限公司；LT53离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；JD200-3电子分析天平：沈阳龙腾电子有限公司；Y921型料理机：九阳股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 蛋白质含量测定
总蛋白质含量测定采用GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法。
1.3.2 氨基酸态氮含量测定
将原料置于匀浆机中，按照一定的料液比匀浆，调整体系pH值，水解、过滤、离心，之后去除上层油脂，得到清液，采用甲醛滴定法（GB 5009.235—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》）测定清液中氨基酸态氮含量。按以下公式计算氨基酸态氮含量。
式中：X1为样品中氨基酸态氮含量，g/100 g；V1为测定时加入甲醛后消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V2为空白加入甲醛后消耗的氢氧化钠的体积mL；c为氢氧化钠的浓度，mol/L；m 为样品的质量，g；V3为测定时上清液的用量，mL；V4为上清液的总体积，mL。
1.3.3 水解度的测定
水解度的计算参考宁诗文等[18]的方法。
1.3.4 单因素试验
选取中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶4种酶制剂，分别用缓冲溶液配制成相同浓度的酶溶液，对鱼露发酵尾料进行单酶水解反应，选取最佳酶制剂种类进行条件优化。
在最佳酶制剂的基础上采用单因素轮换法依次考察料液比 [1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14（g/mL）]、酶制剂用量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%）、水解时间（1、2、3、4、5、6、7、8 h）、pH 值（8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0）、水解温度（25、30、35、40、45、50、55℃）。水解结束后，8 000 r/min离心 10 min，去除上层油脂，测量清液的体积，并取适量测定氨基酸态氮含量及水解度。
1.3.5 响应面试验
根据单因素试验的取值范围和最优点，使用Design-expert 10.0软件进行响应面试验设计，以水解度（Y）为响应值，料液比（A）、酶制剂用量（B）、水解时间（C）为考察指标，采用三因素三水平响应面分析法对水解条件进行优化，试验因素与水平见表1。
表1 Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test design
水平 因素A料液比/（g/mL）B碱性蛋白酶用量/%C水解时间/h-1 1∶8 0.8 4 0 1∶10 1.0 5 1 1∶12 1.2 6
1.3.6 粗提物DPPH·和·OH清除能力的测定
水解液经过离心、真空浓缩、冷冻干燥处理，得到水解蛋白粗提物。将粗提取配制成不同浓度的溶液（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg/mL），参照 Jamdar等[19]和李敏等[20]的方法，按照DPPH·和·OH清除能力测试试剂盒的使用说明，采用分光光度法分别在517 nm和532 nm测定吸光度，按以下公式计算自由基清除率。
式中：A1为样品组加入粗提物溶液和DPPH溶液时的吸光度；A2为空白组加入粗提物溶液，不加入DPPH溶液时的吸光度；A3为对照组不加粗提物溶液，加入DPPH溶液时的吸光度。
式中：A为样品组加粗提物溶液测得的吸光度；A0为空白组用蒸馏水代替粗提物溶液测得的吸光度。
1.4 数据处理
使用Origin Pro2019软件进行数据处理和绘图，使用Design-Expert 10.0软件进行响应曲面分析。
2 结果与分析
2.1 鱼露发酵尾料中蛋白质含量分析
以干燥后的鱼露发酵尾料为原料，通过凯氏定氮法测定其蛋白质含量，结果表明，原料中蛋白质含量为（35.12±0.55）%。鱼类蛋白质中氨基酸的组成与人体组成类似，具有较高的生理价值[21]，利用蛋白酶对鱼露发酵尾料进行水解可以得到功能和品质相对较高的水解蛋白。
2.2 不同蛋白酶对鱼露发酵尾料水解效果的比较
以鱼露发酵尾料为底物，选取4种不同反应机理的蛋白酶进行水解，当蛋白酶与发酵尾料中的蛋白质作用时，因不同蛋白酶的作用条件不同，对蛋白质水解度的影响也会不同。根据不同蛋白酶推荐的最适条件，按照相同的加酶量，对发酵尾料进行水解，结果见图1。
图1 酶种类对鱼露发酵尾料水解度的影响
Fig.1 Effects of enzyme types on hydrolysis degree of fish sauce scraps
由图1可知，4种蛋白酶的对鱼露发酵尾料蛋白质水解度的影响依次为碱性蛋白酶＞风味蛋白酶＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶。碱性蛋白酶的作用效果最好，对发酵尾料的水解度最高，因此选用碱性蛋白酶进行后续试验。
2.3 碱性蛋白酶水解鱼露发酵尾料的单因素试验
2.3.1 料液比对水解度的影响
固定碱性蛋白酶的添加量为0.8%，水解温度为40℃，水解时间为3 h，水解体系pH9.0，探讨料液比对尾料中蛋白质水解度的影响，结果如图2所示。
图2 料液比对鱼露发酵尾料水解度的影响
Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on hydrolysis degree of fish sauce scraps
不同的料液比代表不同的底物浓度，由图2可知，随着溶剂用量的增加，底物浓度的减小，水解度呈先增加后减小的趋势，当料液比达到1∶10（g/mL）时，蛋白的水解度最高，为（25.80±0.55）%，之后水解度有下降趋势。蛋白酶的酶促反应存在着产物与底物的竞争性抑制，过高或过低的料液比，都会引起酶促反应的失衡，导致原料中蛋白水解度的降低[22]。
2.3.2 酶用量对水解度的影响
在最佳料液比的基础上，按照水解时间3 h、水解温度40℃，水解体系pH9.0，探讨不同加酶量对鱼露发酵尾料中蛋白质水解度的影响，结果如图3所示。
图3 酶用量对鱼露发酵尾料水解度的影响
Fig.3 Effect of enzyme dosage on hydrolysis degree of fish sauce scraps
由图3可知，在加酶量低于1.0%时，随着加酶量的增加，反应底物在酶的作用下快速降解，水解度增加较快。在加酶量高于1.0%时，水解度稍有降低，此时酶的浓度过高，酶分子之间的竞争性抑制导致水解度的下降[15]。综合考虑蛋白酶的成本等因素，选择加酶量为1.0%。
2.3.3 水解时间对水解度的影响
在料液比1∶10（g/mL），加酶量为1.0%的基础上，设置水解温度为40℃，水解体系pH9.0，研究不同水解时间对尾料中蛋白质水解度的影响，结果如图4所示。
图4 水解时间对鱼露发酵尾料水解度的影响
Fig.4 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree of fish sauce scraps
从图4可以看出，水解前期（1 h～5 h）鱼露发酵尾料中蛋白质的水解度随着水解时间的延长快速增加，当水解时间大于5 h时，水解度趋于平缓。原因在于随着时间的延长，鱼露发酵尾料中的蛋白逐渐较少，多肽被水解成氨基酸，体系中游离的氨基酸抑制了碱性蛋白酶的水解作用[23]，综合考虑最适水解时间为5 h，此时蛋白质的水解度为（36.59±0.53）%。
2.3.4 水解体系pH值对水解度的影响
在料液比1∶10（g/mL），加酶量为1.0%的基础上，设置水解温度为40℃，水解时间为5 h，研究不同水解体系pH值对尾料中蛋白水解度的影响，结果如图5所示。
图5 pH值对鱼露发酵尾料水解度的影响
Fig.5 Effect of pH value on hydrolysis degree of fish sauce scraps
水解体系的pH值能够pH能够影响底物及酶的解离状态、空间结构，从而影响酶与底物的结合以及酶的活性[24]。由图5可知，随着体系pH值的增加，发酵尾料中蛋白的水解度呈先增加后减少趋势，在pH10.0左右水解度最大，为（37.89±0.61）%，水解效果最好，因此选择水解体系的最佳pH值为10.0。
2.3.5 水解温度对水解度的影响
在最佳料液比、加酶量、水解时间、水解体系pH值的基础上，考察不同的水解温度对鱼露发酵尾料中蛋白质水解度的影响，结果如图6所示。
图6 水解温度对鱼露发酵尾料水解度的影响
Fig.6 Effect of temperature on hydrolysis degree of fish sauce scraps
由图6可知，随着反应体系温度的增加，鱼露发酵尾料中蛋白质水解度呈先增加后降低的趋势，温度在45℃～55℃，体系的水解度相对较高，此时反应体系的分子运动加速，酶活性增加[6]。随着温度的上升，碱性蛋白酶的空间结构遭到破坏，变性失活，导致蛋白酶水解度降低，因此选择50℃作为后续试验的水解温度。
2.4 鱼露发酵尾料中蛋白质水解工艺优化响应面试验
根据单因素试验结果和Box-Behnken试验设计原理，优化鱼露发酵尾料中水解蛋白的提取工艺，试验设计与方差分析见表2、表3。
表2 Box-Behnken试验设计及结果
Table 2 Design and results of Box-Behnken tests
试验序号 A料液比 B酶用量 C水解时间 Y水解度/%1 1-1 0 30.15±0.58 2 1 0 1 37.61±0.46 3 0 30.38±0.38 4 0 0 0 41.52±0.41 0 0 5-1 32.18±0.51 6 0-1 1 30.65±0.69 1 0 7-1 -1 0 24.93±0.59 8 0 1 1 41.15±0.47 0 42.18±0.36 10 0 0 0 40.15±0.71 11 0 -1 -1 20.14±0.65 12 -1 1 0 35.67±0.63 13 0 1 -1 29.16±0.51 14 0 0 0 39.99±0.34 15 -1 0 -1 22.41±0.58 16 1 1 0 39.01±0.62 17 -1 0 1 37.24±0.39 9 0 0
表3 响应面试验结果方差分析
Table 3 Analysis of variance of response surface test results
注：*表示对结果影响显著（P＜0.05）；**表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 794.78 9 794.78 133.42 ＜0.000 1 **A 43.71 1 43.71 66.40 ＜0.000 1 **B 191.30 1 191.30 290.59 ＜0.000 1 **C 228.55 1 228.55 347.18 ＜0.000 1 **AB 0.88 1 0.88 1.34 0.284 6 AC 22.09 1 22.09 33.56 0.000 7 *BC 0.55 1 0.55 0.83 0.392 1 A2 42.03 1 42.03 63.85 ＜0.000 1 **B2 115.81 1 115.81 175.92 ＜0.000 1 **C2 119.37 1 119.37 181.33 ＜0.000 1 **残差 4.61 7 0.66失拟项 0.94 3 0.31 0.34 0.797 9纯误差 3.67 4 0.92总离差 799.39 16
采用Design-Expert 10.0软件对表2的结果进行回归性分析，以水解度（Y）为因变量，料液比（A）、碱性蛋白酶用量（B）、水解时间（C）为自变量，建立回归方程：Y=40.84+2.34A+4.89B+5.35C-0.47AB-2.35AC+0.37BC-3.16A2+5.24B2-5.338C2。
由表3可知，模型的P＜0.05，影响显著，失拟值P＞0.05，影响不显著，说明该模型较为适合，试验点均可用模型描述。此外，相关系数R2为0.986 8，表明该模型有较好的可信度，即该模型能够很好地解释料液比、碱性蛋白酶用量、水解时间对鱼露发酵尾料中蛋白质水解度的影响。一次项A、B、C，二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01），交互项AC对结果影响显著（P＜0.05），AB、BC 对结果影响不显著（P＞0.05）。根据试验结果建立响应面分析图，结果见图7。
图7 各因素交互作用对鱼露发酵尾料水解度的影响
Fig.7 Response surface plots of effect of interaction between each factor on hydrolysis degree of fish sauce scraps
响应面图和等高线图能够直观地反映不同因素之间的交互作用及其对响应值（Y）的影响，由图7可知，料液比（A）与水解时间（C）之间的交互作用对水解度（Y）的影响最大，其次是料液比（A）与碱性蛋白酶用量（B）的交互作用，碱性蛋白酶用量（B）与水解时间（C）的交互作用最小，与方差分析结果一致。
由模型预测的最优条件为料液比1∶10（g/mL）、酶用量1.1%、水解时间5.4 h，在此优化条件下水解度理论值为43.48%。为了验证模型的有效性，在上述水解条件下进行验证试验，得到鱼露发酵尾料中蛋白质的水解度在（43.78±0.57）%，与理论值接近，说明方程与真实试验情况拟合度较好，响应面分析法得到的最佳工艺合理。
2.5 水解蛋白粗提物DPPH·和·OH清除能力试验
水解蛋白粗提物的抗氧化活性与浓度的关系如图8所示。
图8 粗提物浓度对DPPH·和·OH清除能力的影响
Fig.8 Effect of crude extract concentration on scavenging abilities of DPPH·and·OH
由图8可知，粗提物浓度为1 mg/mL～10 mg/mL时，DPPH·和·OH清除率与粗提物的浓度均呈正相关，当浓度为10 mg/mL时，DPPH·清除率达到63.01%，·OH清除率为41.11%。随着粗提物浓度的增加，暴露出的还原性基团的数量也在增加，其溶液的抗氧化活性也随之增强。
3 结论
以鱼露发酵尾料为研究对象，探讨了不同蛋白酶对原料中蛋白质水解度的影响。在单因素试验的基础上采用响应面分析法优化了鱼露发酵尾料蛋白质的制备工艺，得出最佳水解条件：料液比 1∶10（g/mL）、碱性蛋白酶用量1.1%、水解时间5.4 h、水解温度50℃、pH10.0，在此工艺条件下，鱼露发酵尾料中蛋白水解度为（43.78±0.57）%。同时DPPH·和·OH清除试验分析发现，该水解蛋白粗提物具有较好的抗氧化活性。此研究可为鱼露发酵尾料中水解蛋白的提取及应用提供理论依据和参考，有利于鱼类的高值化利用及高附加值产品的开发。
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