天麻为兰科植物，天麻的干燥块茎又名赤箭、明天麻、定风草根等[1-3]，属于多年生寄生草本植物，主要分布在云南省[1-4]。天麻具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络的功效，常用于头痛、肢体麻木等症状的治疗[5]。现代众多药理实验及临床应用表明，天麻具有镇痛、镇静、抗惊厥的作用[5-8]，还能够改善记忆、延缓衰老、增强免疫力等[9-11]。
马克斯克鲁维酵母代谢底物十分广泛[12-13]，可代谢的底物包括葡萄糖、菊芋、糖蜜、乳清和木质纤维素等原料[12，14-16]。马克斯克鲁维酵母不仅具有生长迅速、耐热性高、底物谱广及能产多种酶等特点，而且具有较高的安全性[17-19]，2013年该酵母被中国国家卫生和计划生育委员会批准为新食品原料。由于马克斯克鲁维酵母在生长特性及某些营养特性方面与酿酒酵母类似[20-21]，并且在耐热性及底物范围等方面更具优势，其在食品工业领域具有广泛的应用前景[17]。
目前天麻的食用方式传统且单一，以中药炮制方式处理鲜天麻居多。天麻属于药食同源植物，经微生物发酵可得到含有丰富活性物质及功效酶的发酵产物[22-24]，微生物通过自身的新陈代谢，使原料中各成分之间发生多种复杂反应，在产生新的活性物质和功效酶的基础上还可以一定限度地保留原有营养物质[22，25-26]。本研究通过马克斯克鲁维酵母发酵鲜天麻，探索鲜天麻发酵的工艺条件，以期为天麻发酵液衍生产品的后续开发提供一定参考依据。
1 材料与方法
1.1 原料与菌种
乌天麻：产自云南省昭通市彝良县小草坝，在4℃条件下贮藏备用；马克斯克鲁维酵母（ATCC 36534）：北京百欧博伟生物技术有限公司。
1.2 化学试剂
乙醇（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；氯化钠、葡萄糖淀粉酶（酶活≥50 000 U/g）、普鲁兰酶（酶活≥100 000 U/g）、纤维素酶（酶活≥100 000 U/g）、葡萄糖（均为分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；麦芽汁液体培养基：环凯微生物科技有限公司。
1.3 仪器与设备
EU-K1-20TQ超纯水器：南京欧铠环境科技有限公司；DJM胶体磨：上海东华高压均质机厂；BSA124SCW电子天平：德国赛多利斯科学仪器有限公司；101HGZF电热恒温鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械有限公司；HH-8恒温水浴锅：国华电器有限公司；LRH-250F生化培养箱：上海恒科学仪器有限公司；FE20 pH计：梅特勒-托利多仪器上海有限公司。
1.4 试验方法
1.4.1 马克斯克鲁维酵母发酵天麻工艺流程
鲜天麻前处理→过胶体磨→酶解→调配→高温灭菌（85℃，15 min）→接种发酵→过滤→发酵液。
1.4.2 工艺操作要点
鲜天麻前处理：选取新鲜、饱满、无霉斑、未发芽的天麻，洗净表皮的泥土，晾干表面水分之后与蒸馏水以 1∶1（g/mL）料液比打浆 3 min。
过胶体磨：打浆后的天麻汁颗粒比较大，需要利用胶体磨进一步将大颗粒打磨细。将浆液过胶体磨3次，每次3 min。
酶解：基于天麻中淀粉含量较高，不利于微生物利用，因此选择通过葡萄糖淀粉酶、普鲁兰酶、纤维素酶组成的复合酶（酶活比1∶1∶1）酶解天麻汁，酶解时间为180 min[27]。
调配：为获得适合菌种发酵的pH值，采用碳酸氢钠将天麻匀浆pH值调配至适合马克斯克鲁维酵母生长的条件。
高温灭菌：将调配好的天麻匀浆置于85℃水浴条件下杀菌15 min，取出封口冷却至室温备用。
接种发酵：将低温保藏的菌种于室温融化，以1%接种量接种于麦芽汁液体培养基中活化增殖两代，在无菌条件下将菌种浓度调整至7.30 lg（CFU/mL），随后在无菌条件下，将固定浓度的马克斯克鲁维酵母种子液接种于灭菌完成并且冷却至室温的天麻匀浆液中，之后将其置于120 r/min、28℃的恒温摇床中摇瓶发酵。待发酵完成即得天麻发酵液[20]。
1.4.3 发酵工艺单因素试验
1.4.3.1 发酵时间的确定
固定初始pH值为6.0、装瓶量100 mL（250 mL）、菌液浓度7.30 lg（CFU/mL）、菌种添加量1%和发酵温度 28℃，于 120 r/min 的摇床中分别发酵 6、12、18、24、30、36、42 h，以马克斯克鲁维酵母的活菌数作为评价指标，选择适宜的发酵时间。
1.4.3.2 菌种添加量的确定
固定初始pH值为6.0、装瓶量100 mL（250 mL）、菌液浓度 7.30 lg（CFU/mL），分别添加 0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%的马克斯克鲁维酵母，于28℃、120 r/min的摇床中发酵36 h，以活菌数作为评价指标，选择适宜的菌种添加量。
1.4.3.3 初始pH值的确定
固定菌液浓度7.30 lg（CFU/mL）、发酵温度28℃、发酵时间36 h、装瓶量100 mL（250 mL）和菌种添加量1.25%，改变初始 pH 值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5），以活菌数作为评价指标，选择适宜的初始pH值。
1.4.4 响应面试验设计
以单因素试验为基础，选取发酵时间、菌种添加量、初始pH值3个因素进行响应面试验，以活菌数为响应值，采取Design-Expert 8.0.6软件对二次多项式方程进行显著性分析，优化发酵工艺参数。Box-Behnken试验因素与水平见表1。
表1 Box-Behnken试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design
水平 因素A发酵时间/h B初始pH值 C菌种添加量/%-1 30 4.5 1.00 0 36 5.0 1.25 1 42 5.5 1.50
1.5 数据处理
在数据分析过程中，采用Excel 2010软件对试验数据进行整理，利用Design-Expert 8.0.6软件对响应面试验结果进行分析，并使用Origin 2019进行制图。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果与分析
2.1.1 发酵时间对活菌数的影响
发酵时间对活菌数的影响见图1。
图1 发酵时间对活菌数的影响
Fig.1 Effect of fermentation time on the viable count
由图1可知，随着发酵时间的延长，马克斯克鲁维酵母的活菌数在18 h前增长较快，在18 h～36 h内增长减缓，36 h以后活菌数趋于稳定。说明马克斯克鲁维酵母发酵天麻匀浆期间，18 h前该菌处于对数生长期，之后逐渐生长减缓，到36 h以后处于稳定期。对数期的菌种繁殖速率较快，有利于缩短发酵周期。稳定期菌种数量最高，有利于收获发酵产物[17，25]。因此，选择发酵时间为30、36、42 h进行后续试验。
2.1.2 菌种添加量对活菌数的影响
菌种添加量对活菌数的影响见图2
图2 菌种添加量对活菌数的影响
Fig.2 Effect of inoculum amount on the viable count
由图2可知，随着菌种添加量的增加，天麻发酵液中活菌数呈现先上升后下降的趋势，活菌数在马克斯克鲁维酵母的添加量为1.25%时达到最大值，之后随着菌种添加量的提高活菌数迅速下降。造成此现象的原因可能是发酵液中营养物质含量一定时，当菌种添加量较少时，可供菌种代谢的营养物质相对充裕，菌种大量繁殖，伴随着菌种添加量的增大，发酵液中可供菌种代谢的营养物质不再充足甚至不足以支撑菌种代谢完成时，菌种的生长可能受到影响[25]。因此，选择菌种添加量为1.00%、1.25%、1.50%进行后续试验。
2.1.3 初始pH值对活菌数的影响
初始pH值对活菌数的影响见图3。
图3 初始pH值对活菌数的影响
Fig.3 Effect of initial pH value on the viable count
由图3可知，活菌数在初始pH4.0～5.0之间随初始pH值增大处于增长状态，之后伴随初始pH值的提高，活菌数开始下降，活菌数在初始pH值为5.0时达到最大，造成此现象的原因可能是发酵基质的初始pH值影响马克斯克鲁维酵母的生长、代谢及产物合成。初始pH值过低不利于菌株的生长，当初始pH值过高时，菌株的生长也会受到影响从而生长变缓，导致活菌数变少，代谢能力减弱。当初始pH值为5.0时，天麻发酵液中的马克斯克鲁维酵母活菌数最高，因此，选择初始pH值为4.5、5.0、5.5进行后续试验。
2.2 响应面试验结果与分析
2.2.1 响应面设计方案与结果
响应面设计方案及结果见表2。
表2 响应面设计与结果
Table 2 Response surface design and results
序号A发酵时间 B初始pH值 C菌种添加量活菌数/[lg（CFU/mL）]1 -1 -1 0 8.13 2 0 -1 1 8.31 3 0 0 0 8.46 4 0 1 1 8.32 5 1 1 0 8.79 6 0 0 0 8.49 7 -1 0 1 7.81 8 0 1 -1 8.40 9 -1 0 -1 7.85 10 0 0 0 8.41 11 -1 1 0 7.90 12 1 0 -1 8.41 13 0 -1 -1 8.50 14 1 0 1 8.45 15 1 -1 0 8.53
2.2.2 建立回归模型和方差分析
采用响应面软件对表2进行统计分析后，得到活菌数的回归方程：Y=8.45+0.31A-0.00749B-0.034C+0.12AB+0.020AC+0.027BC-0.18A2+0.068B2-0.14C2，对活菌数的回归方程进行方差分析，结果见表3。
表3 回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression model
注：**表示影响极显著（P＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 1.060 0 9 0.120 0 38.900 0 0.000 4 **A 0.780 0 1 0.780 0 255.080 0＜0.000 1 **B 0.000 5 1 0.000 5 0.1500 0 0.716 2 C 0.009 1 1 0.009 1 3.000 0 0.143 9 AB 0.060 0 1 0.060 0 19.760 0 0.006 7 **AC 0.001 6 1 0.001 6 0.530 0 0.500 6 BC 0.003 0 1 0.003 0 1.000 0 0.364 2 A2 0.130 0 1 0.130 0 41.220 0 0.001 4 **B2 0.017 0 1 0.017 0 5.670 0 0.063 0 C2 0.072 0 1 0.072 0 23.540 0 0.004 7 **残差 0.015 0 5 0.003 0失拟项 0.012 0 3 0.004 0 2.430 0 0.304 5纯误差 0.003 3 2 0.001 6总和 1.080 0 14
表3表明，活菌数的回归模型显著性结果显示P＜0.01，为极显著，表示拟合获得的模型方程极显著，说明试验方法可靠，可用该模型对结果进行分析预测。失拟项P=0.304 5＞0.05，不显著，模型校正系数R2=0.985 9，R2Adj=0.960 6，说明模型回归拟合度和可信度均较好，试验误差小。活菌数的回归模型中一次项A，交互项AB及二次项A2、C2对活菌数的影响极显著（P＜0.01），其余项不显著（P＞0.05）。此外，通过 F 值大小可以得到各因素对活菌数的影响顺序为发酵时间（A）＞菌种添加量（C）＞初始pH 值（B）。
2.2.3 响应面因素交互分析
根据Design-Expert 8.0.6统计分析软件获得响应值的3D曲面图，分析各交互作用对天麻发酵液中活菌数的影响，结果见图4。
图4 各因素交互作用对天麻发酵活菌数影响的响应面图
Fig.4 Response surface diagram of the interactions of factors on the viable count in Gastrodia fermentation broth
由图4可知，在探究发酵时间与初始pH值的交互作用时，当发酵时间一定时，发酵液中的活菌数伴随着初始pH值的增大呈现先增加后减少的趋势，响应面坡面变化陡峭，当初始pH值固定时，活菌数伴随发酵时间的延长呈现先增加后减少的趋势，坡面变化陡峭，且等高线呈椭圆形，表明发酵时间与初始pH值的交互作用显著；发酵时间与菌种添加量的交互作用，以及初始pH值与菌种添加量的交互作用的曲面图则较为平缓。上述结果与方差分析结果一致。
2.2.4 验证试验
通过回归模型对马克斯克鲁维酵母发酵天麻的发酵工艺进行优化，得到最适发酵工艺为发酵时间42 h、菌种添加量1.26%、初始pH5.5，此条件下，天麻发酵液中活菌数预测值为8.764 lg（CFU/mL）。按照上述条件进行3次平行验证试验，得到发酵液中活菌数为8.7 lg（CFU/mL），实际值与预测值结果基本一致，说明该模型基本复合预测实际情况的要求。
3 结论
通过单因素和响应面法对马克斯克鲁维酵母发酵天麻的发酵工艺进行优化，得到优化后的发酵工艺为发酵时间42 h、菌种添加量1.26%、初始pH值为5.5，在此优化条件下，天麻发酵液中的活菌数为8.7 lg（CFU/mL），与预测值结果基本一致，实测结果与回归模型的相对误差为0.73%，表明响应面模型具备一定的可靠性，该模型可为天麻发酵工艺及其衍生产品的开发提供参考依据。
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