γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是动物体中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，由谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）催化谷氨酸（glutamic acid，L-Glu）或其钠盐脱羧而成[1]，具有镇静安神、抗焦虑、调节血压、改善睡眠[2]、治疗糖尿病及改善肝、肾脏功能[3]等多种生理功效，是一种新型功能性因子，2009年我国卫生部批准其为新资源食品的生产原料之一[4]，并逐渐应用于食品、医药等行业。因此，GABA的合成引起了人们的关注和重视。目前，GABA的制备方法主要有化学合成法、植物富集法和微生物发酵法，其中通过化学合成法和植物富集法得到的GABA存在安全性差、产量低及获取难度大[5]等问题，相较而言，微生物发酵生产GABA具有条件温和、安全性高、污染小[6]等优点，成为主要的研究趋势。现有研究表明，大肠杆菌、曲霉菌、酵母菌和乳酸菌等微生物均具有产GABA能力，其中乳酸菌作为食品安全级（generally recognized as safe，GRAS）微生物[7]，其发酵GABA产量相较于其他菌种普遍较高；同时相比于霉菌、大肠杆菌等可能产生毒素的微生物来说，乳酸菌的食品安全性更高[8]，极具发展潜力。因此，利用乳酸菌发酵生产GABA已被公认为安全、绿色的方法。
目前研究显示，多数乳酸菌具有产GABA能力，如乳杆菌[9]、乳球菌[10]、链球菌[11]等，其中菌株多来源于酸奶等乳制品中，如高冬腊[12]从赛里木酸奶中获得5株产GABA的乳酸菌，隶属于粪肠球菌和徳氏乳杆菌保加利亚亚种；Ribeiro等[13]从奶酪中分离出8株GABA产量在300 mg/L以上的菌株，涉及OTakiensis乳杆菌属、副干酪乳杆菌属及植物乳杆菌属，而对于戊糖乳植杆菌属（Lactiplantibacillus pentosus，L.pentosus）产GABA的研究却鲜有报道。L.pentosus多来源于传统发酵食品中，较常用酸乳发酵剂如德式乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌等，其耐酸和耐胆盐能力更强，进入人体肠道后能够更好地发挥益生作用，将高产GABA的L.pentosus应用于功能性乳制品的开发，可进一步提高乳品的益生性。此外，在利用乳酸菌发酵代谢GABA的过程中，不同的培养基及培养条件会对菌株的GAD活性产生影响[14]，且产物对菌株代谢有负反馈抑制等，导致乳酸菌发酵GABA产量仍相对较低。因此，探索乳酸菌发酵GABA的最适条件成为提高GABA生产效率的关键。
本研究旨在对前期从传统酸乳中分离筛选获得的L.pentosus Z6-15试验菌株的产GABA能力进行研究，并通过单因素试验和响应面设计法对菌株的发酵培养条件进行优化，以提高其GABA产量，为后续将产GABA乳酸菌应用于工业化生产及功能性食品开发奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
L.pentosus Z6-15：新疆微生物资源保藏管理中心。
GABA 标准品（纯度≥99.9%）、L-谷氨酸钠（sodium hydrogen glutamate，L-MSG）、碳酸钠、硼酸、硼砂、苯酚、次氯酸钠（有效氯≥10.0%）、无水乙醇（均为分析纯）：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
乳酸细菌培养基（MRS）：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
超净工作台（SW-CJ-1F）：苏州安泰空气技术有限公司；生化培养箱（SPX-250BF）：上海福玛实验设备有限公司；立式冷藏柜（SC-316）：青岛海尔股份有限公司；自动高压灭菌锅（HVE-50）：日本HIRAYAMA公司；紫外分光光度计（UVZ2550）：日本岛津仪器公司；TS恒温振荡器（TS-2102C）：德国耶拿分析仪器股份公司；电热恒温水浴锅（DK-8D）：上海齐欣科学仪器有限公司；高速冷冻离心机（PLCD）：德国Sigma公司。
1.3 发酵培养及产物测定
将MRS斜面保藏的乳酸菌Z6-15于MRS平板活化2代～3代后，取一环于MRS液体培养基中振荡培养24 h，按4%接种量复接于MRS液体培养基中，37℃、160 r/min振荡培养72 h后，取10 mL发酵液于10000r/min、4℃条件下离心10min，取上清液于4℃保藏，备用。
GABA的测定：通过Berthelot比色法，绘制GABA的标准曲线，具体参照梁慧[15]的方法。
菌体量的测定：采用分光光度计法。
葡萄糖的测定：采用硫酸-苯酚法[16]。
1.4 发酵条件优化
1.4.1 碳源的选择
以MRS为基础培养基，分别以蔗糖19 g/L、乳糖19 g/L、麦芽糖20 g/L、可溶性淀粉19 g/L、糊精18 g/L替代葡萄糖20 g/L作唯一碳源，其中添加量以含碳量一致为原则，并设置MRS培养基作对照，考察不同种类碳源对菌株Z6-15的菌体量和GABA产量的影响。
1.4.2 氮源的选择
以MRS为基础培养基，在最适碳源的条件下，有效含氮量按2 g/L进行换算，分别以酵母粉+蛋白胨（N1），酵母粉+氯化铵（N2），酵母粉+硫酸铵（N3），蛋白胨+氯化铵（N4），蛋白胨+硫酸铵（N5），酵母粉+蛋白胨+氯化铵（N6），酵母粉+蛋白胨+硫酸铵（N7），酵母粉+蛋白胨+氯化铵+硫酸铵（N8）这8种组合，按同比例配比作复合氮源，考察不同组合氮源对菌株Z6-15的菌体量和GABA产量的影响。
1.4.3 Plackett-Burman优化设计
在单因素试验的基础上，使用Design expert 8.0软件，对发酵培养基中的9种成分进行分析。试验以GABA产量为响应值，两水平分别取原水平的±25%，Plackett-Burman试验设计见表1。
表1 Plackett-Burman试验设计
Table 1 Plackett-Burman experimental design
注：—表示不设定数值。
因子水平F吐温-80/%J～K虚拟因素-1 15 7.5 7.5 4 3 0.05 5 3 150 —1 25 12.5 12.5 6 5 0.15 6 5 200 —A葡萄糖/（g/L）B蛋白胨/（g/L）C酵母粉/（g/L）D乙酸钠/（g/L）E LMSG/（g/L）G I初始pH值H接种量/%装添量/mL
1.4.4 响应面分析
基于Plackett-Burman试验结果，以GABA产量为响应值，对蛋白胨、L-MSG和初始pH值作三因素三水平的响应面试验。每组试验做3次平行，因素水平见表2。
表2 响应面试验因素水平
Table 2 Factors and levels of response surface methodology
水平 因素A蛋白胨/（g/L）B L-MSG/（g/L）C初始pH值-1 7.5 3.0 5.0 0 10 4.0 5.5 1 12.5 5.0 6.0
1.5 统计分析
试验数据采用Microsoft Excel 2010、Design Expert 8.0、Origin 8.0、SPSS 20.0等数据处理系统进行整理及统计分析。
2 结果与分析
2.1 GABA标准曲线
基于OD645nm绘制的GABA标准曲线见图1。
图1 GABA标准曲线
Fig.1 Standard curve of GABA
由图1可知，线性回归方程：y=1.737x+0.083，R2=0.999 3。由此可见，在0.1 g/L～0.5 g/L内，GABA的吸光值与其浓度具有良好的线性关系。在此条件下，取稀释适当倍数后的菌株发酵上清液0.8 mL，根据标准曲线测得菌株Z6-15的GABA产量为2.84 g/L。
2.2 发酵条件优化
2.2.1 碳源的选择
微生物利用碳源来为机体代谢活动提供能量，而不同微生物的最适碳源则有所不同。不同种类碳源对菌株Z6-15的菌体量及GABA产量的影响见图2。
图2 不同碳源对菌株Z6-15产GABA及菌体量的影响
Fig.2 Effects of different carbon on GABA production and biomass of strain Z6-15
不同小写字母表示具有显著性差异，P＜0.05。
由图2可知，6种碳源对菌株Z6-15的菌体量和GABA产量的影响存在明显的差异，其中葡萄糖作碳源时，菌株Z6-15的菌体量最高，且与其他碳源相比存在显著性差异；同时葡萄糖价格低廉、易获得，作为发酵原料可节约成本。因此，选择葡萄糖为发酵培养基的碳源。
2.2.2 氮源的选择
氮源在微生物代谢产物尤其是含氮代谢物的合成中起着至关重要的作用。微生物对不同氮源类型有不同的利用程度，对有机氮的利用程度远高于无机氮，且有机氮更利于代谢产物的形成。在以葡萄糖为最适碳源的基础上，考察不同组合的复合氮源对菌株Z6-15的菌体量及GABA产量的影响，结果见图3。
图3 不同组合氮源对菌株Z6-15产GABA及菌体量的影响
Fig.3 Effects of different combined nitrogen on GABA production and biomass of strain Z6-15
不同小写字母表示具有显著性差异，P＜0.05。
由图3可知，在以蛋白胨和酵母粉为组合氮源（N1）时，菌株Z6-15的菌体量和GABA产量最高，较其他组合具有显著性差异；而添加无机氮源则不利于菌体的生长和GABA的合成。这可能是由于有机氮源中的氮化物等物质有助于细胞的生长代谢，同时其富含的维生素可在一定程度上提高GAD活力。因此，选择酵母粉和蛋白胨为发酵培养基的组合氮源。
2.2.3 Plackett-Burman试验优化分析
选用N=12的试验设计方法，对菌株发酵过程中的11个因素（9个实际因素、2个虚拟因素）进行分析。试验以GABA产量（Y）为响应值，其设计及结果见表3，各因素效应见表4。
表3 Plackett-Burman试验设计与结果
Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiment
试验号ABCDEFGHIJKY/（g/L）1 1 1 -1 1 1 1 -1-1-1 1 -1 4.16 2 -1 1 1 -1 1 1 1 -1-1-1 1 3.99 3 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1-1 -1 3.89 4 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 3.93 5 -1-1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 3.87 6 -1-1-1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 3.94 7 1 -1-1-1 1 -1 1 1 -1 1 1 3.51 8 1 1 -1 -1-1 1 -1 1 1 -1 1 4.01 9 1 1 1 -1-1-1 1 -1 1 1 -1 4.10 10 -1 1 1 1 -1-1-1 1 -1 1 1 4.55 11 1 -1 1 1 1 -1-1-1 1 -1 1 3.97 12 -1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1 4.13
表4 因素效应
Table 4 Effects of factors
因素 影响水平 平方和 影响率/%A-0.13 0.05 7.70 B 0.24 0.17 26.68 C 0.12 0.04 6.25 D 0.14 0.06 9.29 E-0.20 0.12 18.91 F-0.05 8.43×10-3 1.32 G-0.2 0.15 22.94 H-0.09 0.03 3.98 I-0.07 0.01 2.26 J 0.03 3.40×10-3 0.53 K-0.01 8.67×10-3 0.14
由表 4可知，蛋白胨（B）、L-MSG（E）、初始 pH 值（G）对GABA产量的影响率分别为26.68%、18.91%、22.94%，其中蛋白胨对GABA产量的影响为正相关，即随着其含量的增加GABA产量也增加；L-MSG和初始pH值则为负相关；而虚拟因素影响不大，可信度高。因此，选择以上3个主要因素进行下一步试验。
2.2.4 响应面分析
依据Plackett-Burman试验结果，通过Box-Behnken试验设计对蛋白胨、L-MSG、初始pH值进行5个中心点（17个试验）的分析。试验以GABA产量为响应值，其设计与结果见表5，回归模型方差分析见表6。
表5 Box-Behnken试验设计与结果
Table 5 Design and resuls of Box-Behnken experiment
试验编号ABCGABA产量/（g/L）1 -1 -1 0 3.09 2 1 -1 0 3.65 3 -1 1 0 3.72 4 1 1 0 3.87 5 -1 0 -1 3.75 6 1 0 -1 3.81 7 -1 0 1 3.01 8 1 0 1 3.79 9 0 -1 -1 3.63 10 0 1 -1 3.85 11 0 -1 1 2.82 12 0 1 1 3.76 13 0 0 0 3.86 14 0 0 0 3.89 15 0 0 0 3.86 16 0 0 0 3.80 17 0 0 0 4.01
表6 回归模型方差分析
Table 6 Analysis of variance
注：** 表示影响极显著，P＜0.01；*表示影响显著，P＜0.05。
变异来源 平方和 自由度 均方和 F值 P值 显著性模型 1.83 9 0.30 34.97 ＜0.000 1 **A 0.30 1 0.30 51.66 0.000 2 **B 0.51 1 0.51 86.87 ＜0.000 1 **C 0.34 1 0.34 59.25 0.000 1 **AB 0.042 1 0.042 7.23 0.031 1 *AC 0.13 1 0.13 22.29 0.002 2 **BC 0.13 1 0.054 22.29 0.002 2 **A2 0.054 1 0.15 9.29 0.018 6 *B2 0.15 1 0.14 25.67 0.001 5 **C2 0.14 1 0.019 23.66 0.001 8 **残差 0.041 7 5.814×10-3失拟项 0.017 3 5.525×10-3 0.92 0.509 0 不显著误差 0.024 4 6.030×10-3总和 1.87 16
方差分析结果显示，影响GABA产量的因素顺序：L-MSG＞初始pH值＞蛋白胨。其中回归模型P＜0.000 1，呈极显著水平，决定系数R2=0.978 2；同时失拟项 P=0.509 0＞0.05，R2Adj=0.950 3，说明模型拟合度良好，能够反映响应值的变化，可以用于发酵工艺的分析预测。其二次回归方程：Y=3.88+0.19A+0.25B-0.21C-0.10AB+0.18AC+0.18BC-0.11A2-0.19B2-0.18C2。
2.2.5 响应面及等高线图解析
因素交互作用的响应面分析见图4。
图4 交互因素的响应面分析
Fig.4 Response surface analysis of interaction factors
由图4可知，在L-MSG为零水平时，最佳蛋白胨含量和初始pH值分别为11.5 g/L和5.49，此时两者对GABA产量的影响较为显著；在初始pH值和蛋白胨含量分别取零水平时，L-MSG对GABA产量的影响较大。在一定范围内，GABA产量与初始pH值成反比，这可能与GAD适宜酸性环境有关；同时从交互作用可以看出，在蛋白胨11.5 g/L、L-MSG 4.49 g/L、初始pH5.49条件下，GABA产量最高，为4.01 g/L。
2.2.6 模型验证试验
数据分析表明，菌株的最佳发酵工艺：蛋白胨11.54 g/L、L-MSG 4.49 g/L、初始 pH 值 5.49，此条件下生成GABA的理论预测最大值为4.01 g/L。基于实际情况，选择蛋白胨11.5 g/L、L-MSG 4.5 g/L、初始pH值5.5进行验证试验，3批发酵试验实测GABA产量分别为 3.99、3.92、3.96 g/L，平均产量 3.96 g/L，较预测值接近度达98.75%。
2.3 发酵过程曲线
菌株Z6-15发酵GABA的过程曲线见图5。
图5 菌株Z6-15发酵GABA的过程曲线
Fig.5 Process curve of GABA fermentation by strain Z6-15
从菌株发酵GABA的过程曲线可知，0～4 h为菌株的生长延迟期，4 h～16 h为对数生长期，此后则为稳定期。同时，从菌体生长与产物形成的关系看，在菌体主要生长阶段（对数生长期），葡萄糖被大量消耗，菌体量迅速增加，但合成GABA较少；而当进入稳定期后，GABA大量生成。
3 讨论与结论
GABA作为一种天然的非蛋白质氨基酸，具有多种生理活性，目前通过微生物发酵就可方便地得到GABA。其中，乳酸菌因其良好的益生特性及食用安全性，是目前生产GABA的主要菌株。然而从自然界初筛获得的乳酸菌合成GABA的能力往往较低，约为0.3 g/L～2 g/L左右，因此优良菌株的筛选成为了开发GABA的重要任务。此外，利用乳酸菌发酵合成GABA，菌体的生长状况及其代谢产物的积累，均取决于发酵培养基的组成及发酵培养条件，合适的营养物质及浓度配比有利于菌体的生长代谢，因此有必要对菌株的发酵条件进行优化，从而提高其GABA产量。
本研究利用响应面试验设计对影响乳酸菌L.pentosus Z6-15产GABA的发酵条件进行筛选，最终得到蛋白胨、L-MSG、初始pH值3个影响较大的因素，这一结果与王冰聪[17]、司阔林等[18]的研究较为相近；同时响应面3D图及其等高线模型显示，初始pH值和L-MSG含量对GABA产量的影响呈现极显著作用。其中L-MSG作为菌株发酵产GABA的底物，提高其含量有助于GABA的生成，而过量的L-MSG又会使发酵过程中的pH值上升，导致GABA产量降低。相关研究表明，GAD的最适pH值为4.0～6.0，此范围有利于GABA的合成，同时又可抑制GABA的分解 [19]；而pH值的升高则会使L-Glu的脱羧作用减弱，导致GABA的分解加快。如李欢等[20]在研究植物乳杆菌14发酵GABA的条件过程中，发现pH值为6.0时，菌株的菌体量及GABA产量达到最高值，而随着pH值的升高，GABA产量逐渐降低；李理等[21]探索植物乳杆菌DNC75017产GABA的最适条件时，发现菌株在初始pH值为4.65时产GABA能力最强。因此，试验通过设定目标响应值，最终得到菌株发酵的最优参数：葡萄糖20 g/L、酵母粉 10 g/L、蛋白胨 11.5 g/L、L-MSG 4.5 g/L、K2HPO42 g/L、无水乙酸钠5 g/L、柠檬酸三铵2 g/L、MnSO40.05 g/L、MgSO40.2 g/L、吐温-80 0.1%、初始 pH值 5.5，接种量 4%、装添量 175 mL、37℃、160 r/min、发酵时间72 h。此条件下得到GABA产量为3.96 g/L，较优化前提高了39.63%，与预测值4.01 g/L的接近度为98.75%，拟合度较好。
乳酸菌在发酵过程中，菌体的生长和产物的生成并不一定是同步的[22]。菌株Z6-15发酵GABA的过程曲线表明，0～16 h为菌体主要生长阶段，此时葡萄糖被大量消耗，但合成GABA较少；而当菌株进入稳定期，即16 h以后，GABA开始大量合成，即菌体代谢生长和GABA生成存在一定的滞后性。这一结果与Yogeswara等[23]的研究相一致，而与曾林等[24]研究的植物乳杆菌BC114培养24 h后进入稳定期，GABA在发酵40 h后激增，在72 h达到最大值而有所不同，说明不同种类的菌种其生产周期和培养特性存在差异。
本研究的开展，为后续开发L.pentosus Z6-15的发酵乳制品，并将该菌株用于乳品工业中生产具有功能因子的乳酸菌饮品等提供一定的科学依据，同时也为研制和开发富含GABA的相关功能性食品奠定理论基础。
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