骨粉是指动物去除肉、内脏或不宜食用的下脚料，经高温高压蒸煮、脱脂、冷冻、干燥、粉碎后得到的产品[1]。近年来，骨粉的研究愈加深入[2-3]，对骨头进行高程度加工利用，可制备骨粉、骨泥、骨蛋白、软骨素、骨油、骨碳等，不仅可作为食品营养强化剂，减少环境的污染，又可提高骨资源综合利用[4-7]。
鸽肉中营养成分较为丰富。随着鸽业产业的发展，市面上鸽肉产品逐渐增多，肉鸽的副产物鸽骨也随之增加。相关研究证明一般鸽骨约占活鸽体重的20%左右，含有大量的钙、磷和人体所必需的氨基酸等营养成分[8-10]，其中钙含量是磷含量的2倍，其含量比是人体吸收的最佳比例。近些年来，有关乳鸽的研究逐渐深入，相玉秀等[11]以乳鸽为原料，通过正交试验方法研究陈皮绿豆乳鸽汤制作方法；赵永敢等[12]通过高温高压抽提法研究鸽骨中营养物质；姚宏亮等[13]利用不同酶对乳鸽胸脯肉进行酶解，研究水解后鸽肉酶解液的体外抗氧化性。但关于鸽骨的加工利用文献较少，因此，本试验选取除头部、爪部外躯干部位鸽骨作为原料，利用超声波辅助溶剂法[14-15]，通过响应面试验法进行参数优化，制备得到无异味的脱脂鸽骨粉，对比鸽骨粉脱脂前后营养成分的变化，可以将其作为食品营养添加剂，增加鸽骨的利用价值。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
肉鸽：市售，品种为塔里木肉鸽，经水煮去肉选取去除头部、爪部、外躯干部位鸽骨，冷冻保存待用；石油醚、醋酸乙酯、异丙醇（均为分析纯）：天津市鑫铂特化工有限公司。
1.2 仪器与设备
KQ-250DE超声波清洗仪：昆山市超声仪器有限公司；2XZ-2真空冷冻干燥机：上海豫明仪器有限公司；FW-10高速粉碎机：北京市永光明医疗仪器有限公司；DHG-9123A鼓风干燥机：上海一恒科技有限公司；1100型高效液相色谱仪、5900型等离子发射光谱仪：常州市伟嘉仪器制造公司。
1.3 方法
1.3.1 鸽骨样品制备
样品制备工艺：乳鸽预处理→煮制→脱骨→超声波辅助溶剂脱脂→一次冷冻（-20℃、24 h）→二次冷冻（-40℃、4 h）→真空冷冻干燥→高速粉碎→成品→低温贮藏。
操作要点：将白条肉鸽置于高压锅中水煮后去肉脱骨，通过超声波法对鸽骨进行脱脂处理；将脱脂后的鸽骨置于鼓风干燥箱内通风干燥3 h；溶剂挥发后鸽骨置于-20℃下一次冷冻24 h，放入超低温冰箱二次冷冻4 h；真空冷冻去除水分并利用高速粉碎机粉碎鸽骨至140目无残留。
1.3.2 脱脂剂筛选试验
采用秦晓洁等[16]牦牛骨粉制备方法以及许晶冰等[17]脱脂兔骨粉制备方法进行鸽骨脱脂并稍作修改。结合超声波辅助溶剂脱脂法，对热水、醋酸乙酯、异丙醇、无水乙醇4种不同脱脂剂进行筛选。前期试验筛选出最佳脱脂溶剂参数为超声时间30 min、超声功率200 W、液料比为2 mL/g，对比4种不同溶剂对鸽骨脱脂率的影响，测定脱脂前后鸽骨中的脂肪含量，通过计算脱脂率确定最佳脱脂剂。脱脂率计算公式如下。
脱脂率/%=（Wa-Wb）/Wa×100
式中：Wa为脱脂前脂肪含量，%；Wb为脱脂后脂肪含量，%。
1.3.3 单因素试验设计
在超声温度35℃的条件下各因素参数固定为超声功率200 W、超声时间30 min、液料比3 mL/g。各个因素梯度设置为超声功率 150、175、200、225、250 W，超声时间 20、30、40、50、60 min，液料比 2、4、6、8、10 mL/g。以鸽骨脱脂率为评价指标，各因素试验重复3次，测定结果取平均值。
1.3.4 响应面试验设计
结合单因素试验结果，以超声时间（A）、超声功率（B）、液料比（C）作为自变量，脱脂率（Y1）作为响应值，试验设计见表1。
表1 响应面试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface methodology
水平 因素A超声时间/minB超声功率/WC液料比/（mL/g）-1 30 200 7 0 40 225 8 1 50 250 9
1.3.5 指标测定
色泽：采用色差计法测定脱脂前后鸽骨粉的色泽[18]。
水分含量：参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》中直接干燥法[19]测定。
脂肪含量：参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》[20]中索氏提取法测定。
氨基酸：参照GB 5009.124—2016[21]《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》中方法测定脱脂前后鸽骨粉的氨基酸种类及含量。
Ca、P 含量：参照 GB 5009.92—2016《食品安全国家标准食品中钙的测定》中钙测定方法 [22]和GB 5009.87—2016《食品安全国家标准食品中磷的测定》中磷测定方法[23]测定脱脂前后鸽骨粉的钙、磷含量。
1.4 处理数据
采用SPSS和Graphpad方法进行数据分析与作图，结果用平均数±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 鸽骨脱脂溶剂的筛选
选取醋酸乙酯、无水乙醇、异丙醇、热水作为脱脂溶剂，筛选出脱脂效果最佳的脱脂剂。各脱脂剂的脱脂效果如图1所示。
图1 不同脱脂剂对鸽骨脱脂率的影响
Fig.1 Effect of defatting solvents on defatting rate of pigeon bone
小写字母不同表示具有显著性差异（P＜0.05）。
由图1可知，不同脱脂剂对鸽骨的脱脂效果有所差异，热水、醋酸乙酯、无水乙醇的脱脂率分别为14.5%、20.65%、17.5%，异丙醇的脱脂率高达72.9%，说明不同脱脂剂对鸽骨的脱脂效果差异显著（P＜0.05），异丙醇的脱脂率是醋酸乙酯组的3.0倍，这是由于异丙醇具有良好的溶解性、挥发性，且其沸点低、毒性小，是一种易于回收的溶剂。因此，最终选取最佳脱脂剂为异丙醇。
2.2 超声波处理条件对鸽骨脱脂率的影响
不同超声时间对鸽骨脱脂率的影响见图2。
图2 不同超声时间对鸽骨脱脂率的影响
Fig.2 Effect of ultrasonic time on defatting rate of pigeon bone
小写字母不同表示具有显著性差异（P＜0.05）。
由图2可知，鸽骨粉的脱脂率受超声时间的影响较为明显，随超声时间不断延长，脱脂率呈现先升高后降低的趋势，当超声时间为40 min时，脱脂率达到最大值，为72.84%。这可能是由于超声波产生的次级效应导致异丙醇发生乳化现象[24]，并随着超声时间增加而渗透于鸽骨内部，加速油脂的溶出，首先溶出的是鸽骨组织间细胞外的油脂，之后由于超声波空化作用，油脂细胞破损，在超声波辅助溶剂的作用下，组织细胞内的油脂向外部转移到脱脂溶剂中[25]。当超声时间增加到 50、60 min 时，脱脂率差异不显著（P＞0.05），脱脂效果变化缓慢，这一现象的产生可能是由于超声时间不断延长，超声波产生的超声效应由鸽骨表面至鸽骨内，随着脱脂溶剂不断深入组织内部，超声波效应与脱脂溶剂达到高度饱和，从而降低提取效率，继续延长超声时间鸽骨脱脂效果无明显变化。最终确定超声波处理时间为40 min进行后续试验。
不同超声功率对鸽骨脱脂率的影响见图3。
图3 不同超声功率对鸽骨脱脂率的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic power on defatting rate of pigeon bone
小写字母不同表示具有显著性差异（P＜0.05）。
由图3可知，随超声功率不断增加，脱脂率先升高后降低。当超声功率为225 W时，脱脂率达到最大值，为67.91%，可能是由于超声波具有一定能量性和波动性，可以促进分子的扩散速率，同时超声波辅助脱脂溶剂可以加大鸽骨油脂溶出的速度。当超声功率为175、200 W时，脱脂率分别为35.81%、40.75%，差异不显著（P＞0.05），其原因可能是超声功率强度较弱，导致脱脂溶剂渗透到鸽骨组织内部速率缓慢，但当超声功率提高至250 W时脱脂率急剧下降，这与陈丽清等[26]研究结果相一致，可能存在过高的超声波次级效应使脱脂溶剂产生自由基，局部温度瞬时升高，导致鸽骨中油脂组织被破坏，脱脂速率急剧下降。最终试验结果表明，超声功率为225 W可达到较好的脱脂效果。
不同液料比对鸽骨脱脂率的影响见图4。
图4 不同液料比对鸽骨脱脂率的影响
Fig.4 Effect of liquid-to-solid ratio on defatting rate of pigeon bone
小写字母不同表示具有显著性差异（P＜0.05）。
由图4可知，在超声温度固定为35℃条件下，液料比的添加量与鸽骨脱脂率呈现正相关趋势，当液料比为10 mL/g时，脱脂率为72.84%，达到最大值，但当液料比为8 mL/g时，脱脂率为70.37%，两者相差为2.47%，差异不显著（P＞0.05）。其原因可能是对于一定质量的鸽骨，异丙醇的用量与溶剂中油脂浓度呈相反的作用，增加鸽骨与脱脂溶剂接触表面的浓度差，能够促使传质推动力的增加，当液料比增加到一定程度时，脱脂溶剂会不断渗透到鸽骨内部使得油脂浸出，最终达到一定饱和程度时，油脂溶出速率渐缓[27-30]。因此从经济与环保的角度考虑，最终选取液料比为8 mL/g。
2.3 响应面试验结果
2.3.1 回归模型建立与方差分析
脱脂鸽骨粉制备的响应面试验优化结果如表2所示。
表2 响应面试验结果
Table 2 Response surface methodology results
试验组号因素 脱脂率/%A超声时间/min B超声功率/W C液料比/（mL/g）1 50 200 8 56.35 2 50 250 8 58.5 3 40 250 7 57.86 4 30 225 9 59.26 5 40 250 9 58.9 6 40 200 9 56.79 7 50 225 7 61.73 8 40 225 8 69.67 9 40 225 8 70.62 10 30 250 8 57.78 11 30 225 7 54.32 12 40 200 7 55.8 13 40 225 8 66.91 14 40 225 8 70.37 15 50 225 9 59.26 16 40 225 8 69.38 17 30 200 8 51.85
对试验结果进行多元回归拟合，得到脱脂率对自变量的二次多元回归方程Y1=69.39+1.58A+1.53B+0.562 5C-0.9450AB-1.85AC+0.012 5BC-5.98A2-7.29B2-4.76C2。
根据以上回归方程进行方差分析，结果见表3。
表3 方差结果分析
Table 3 Analysis of variance results
注：**代表影响极显著（P＜0.01）；*代表影响显著（P＜0.05）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 581.47 9 64.61 40.25 ＜0.000 1 **A 19.94 1 19.94 12.42 0.009 7 **B 18.76 1 18.76 11.69 0.011 2 *C 2.53 1 2.53 1.58 0.249 5 AB 3.57 1 3.57 2.23 0.179 4 AC 13.73 1 13.73 8.55 0.022 2 *BC 0.000 6 1 0.000 6 0.000 4 0.984 8 A2 150.70 1 150.70 93.88 ＜0.000 1 **B2 223.61 1 223.61 139.30 ＜0.000 1 **C2 95.60 1 95.60 59.55 0.000 1 **残差 11.24 7 1.61失拟项 2.53 3 0.844 9 0.388 4 0.768 4纯误差 8.70 4 2.18总和 592.71 16
由表3可知，脱脂率的回归模型F值为40.25，P＜0.000 1，极显著。失拟项P＞0.05，不显著。模型的决定系数（R2=0.981 0）与校正系数（RAdj2=0.956 7）有着高度拟合性，模型一次项A对脱脂率的影响极显著，二次项A2、B2、C2对脱脂率的影响均极显著。最终，由F值可知3个因素对脱脂鸽骨粉脱脂率的影响大小依次为A＞B＞C。
2.3.2 响应面与等高线分析
各因素之间的交互作用对脱脂率影响的响应面与等高线图见图5～图7。
图5 超声功率与超声时间交互作用的响应面与等高线分析
Fig.5 Response surface and contour analysis of the interaction between ultrasonic power and ultrasonic time
图6 液料比与超声时间交互作用的响应面与等高线分析
Fig.6 Response surface and contour analysis of the interaction between liquid-to-solid ratio and ultrasonic time
图7 液料比与超声功率交互作用的响应面与等高线分析
Fig.7 Response surface and contour analysis of the interaction between liquid-to-solid ratio and ultrasonic power
从图5～图7中可以看出，每个因素之间的显著性可以直观地表现在响应面图中。椭圆形等高线表示各因素之间存在显著交互作用，而圆形等高线表示相互作用不显著。从响应面图可以得出，超声时间、超声功率、液料比对鸽骨粉的脱脂率存在影响，影响大小为超声功率（A）＞超声时间（B）＞液料比（C），此结果与方差分析结果一致。
为判定响应面优化后得到的方程是否具有实践指导意义，需进行验证试验。利用Design-Expert软件预测得到最佳工艺参数：超声时间为41.19 min、超声功率为227.43 W、液料比为8.04 mL/g，在此条件下的脱脂率为69.59%。结合实际的试验，调整最佳参数为超声时间40 min、超声功率225 W、液料比8 mL/g。为了确定最终模型的可靠性，以调整最佳参数进行验证试验，脱脂率为70.63%，与预测值相差1.04%。因此通过响应面设计的脱脂鸽骨粉工艺参数准确可行，具有一定的实践指导意义。
2.4 脱脂前后鸽骨粉色泽及营养成分变化
脱脂前后鸽骨粉色泽及营养成分变化见表4。
表4 脱脂前后色泽及营养成分变化
Table 4 Changes in color and nutritional composition before and after defatting
注：同列小写字母不同表示具有显著性差异（P＜0.05）。
处理方式 色泽指标营养指标/%L*值 a*值 水分含量 脂肪含量 Ca含量 P含量脱脂前 59.18±0.18b 6.22±0.14a 3.06±0.08a 13.00±0.40a 13.36±0.06b 6.99±0.04b脱脂后 74.07±0.03a 3.65±0.15b 2.10±0.37b 2.87±0.78b 16.27±0.01a 8.47±0.01a b*值12.49±0.11a 11.82±0.26b
由表4可知，脱脂后的L*值增加，a*值和b*值降低。脱脂后鸽骨粉颜色由棕褐色变为灰白色，颜色变浅，说明脱脂处理对骨粉色泽影响较大。鸽骨粉脱脂前脂肪含量高达13%，脱脂后骨粉脂肪含量显著降低，未脱脂的骨粉不仅不利于鸽骨的粉碎，而且还会导致产品极易氧化酸败[31]，严重影响鸽骨粉品质，所以脱脂处理是研制骨粉的关键步骤之一。骨粉中钙、磷含量较为丰富，脱脂前后钙含量是磷含量的近2倍，是人体吸收钙、磷的最佳比例，可以作为食品营养强化剂添加。脱脂前后的骨粉均采用真空冷冻干燥除去水分，但最终水分含量存在一定变化，这可能是由于未脱脂的骨粉存在较多的油脂，油脂会包裹在鸽骨表面，影响水分的蒸发[32]。相反，脱脂后的骨粉，由于脂肪含量较低，通过真空冷冻干燥可以有效降低其内部水分。
脱脂前后鸽骨粉氨基酸种类及含量见表5。
表5 脱脂前后鸽骨粉氨基酸种类及含量
Table 5 Amino acid types and content of pigeon bone meal before and after defatting %
注：同行小写字母不同表示具有显著性差异（P＜0.05）。
中文名称 英文缩写 脱脂前鸽骨粉 脱脂后鸽骨粉天冬氨酸 Asp 1.72±0.02a 0.48±0.01b谷氨酸 Glu 6.90±0.06a 2.13±0.03b丝氨酸 Ser 6.90±0.06a 3.69±0.04b甘氨酸 Gly 36.28±0.4a 22.38±0.13b组氨酸 His 4.04±0.05a 2.14±0.02b精氨酸 Arg 16.47±0.15a 9.26±0.11b苏氨酸 Thr 5.81±0.05a 3.35±0.03b丙氨酸 Ala 12.48±0.11a 5.74±0.06b脯氨酸 Pro 26.67±0.32b 28.67±0.30a酪氨酸 Tyr 5.02±0.03a 3.73±0.03b缬氨酸 Val 6.47±0.01a 2.90±0.02b蛋氨酸 Met 2.74±0.02a 1.75±0.02b异亮氨酸 Ile 5.00±0.04a 2.27±0.01b亮氨酸 Leu 10.51±0.09a 5.44±0.06b苯丙氨酸 Phe 8.44±0.07a 7.34±0.08b赖氨酸 Lys 6.29±0.04a 1.21±0.02b
由表5可知，脱脂前后鸽骨粉的氨基酸含量发生了变化，但种类不变。通过显著性分析得出，脱脂处理对氨基酸的含量均存在显著性影响，脯氨酸在脱脂后呈现增加的趋势，这可能是由于骨粉中的脂质被大部分脱除，脯氨酸含量增加，这也进一步提高了鸽骨粉的蛋白质品质[33]。脱脂前后鸽骨粉氨基酸共有16种，其中人体必需氨基酸有9种，分别是Lys、His、Phe、Met、Thr、Ile、Leu、Val、Arg；非必需氨基酸有 7 种，分别是 Glu、Ala、Gly、Asp、Pro、Ser和 Tyr。鸽骨粉脱脂前后必需氨基酸中苯丙氨酸含量最高，苯丙氨酸可以添加到焙烤食品中，有增强苯丙氨酸营养价值的作用，并且可以与糖类发生氨基-羧化反应，具有提高风味的作用。非必需氨基酸中甘氨酸和脯氨酸含量较高，在很多动物性食品中，甘氨酸作为添加剂、防腐剂使用[34-35]，脯氨酸具有分解蛋白质的重要作用，可帮助人体形成新的细胞，并且脯氨酸和赖氨酸都是生产羟脯氨酸和羟赖氨酸所需要的，可构建胶原蛋白。
3 结论
本试验利用超声波辅助溶剂法对鸽骨进行脱脂处理，选取最佳脱脂溶剂后分别研究超声时间、超声功率、液料比对鸽骨脱脂率的影响，以单因素试验结果为基础，进行响应面试验设计。结果表明：最优脱脂剂为异丙醇，在单因素试验基础上，通过响应面试验优化得最佳条件为超声时间40 min，超声功率225 W，液料比为8 mL/g，此时，脱脂率为69.39%，脱脂后的营养成分发生变化，色泽发生明显改善，钙、磷含量有所增加，氨基酸含量降低但种类不变。
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