类菌孢素氨基酸（mycosporine-like amino acids，MAAs）是以氨基环己烯酮或氨基环己烯胺为其骨架的环状结构，通过不同种类的氨基酸缩合而成[1]。MAAs广泛存在于藻类、浮游植物及微生物中[2]，在310 nm～360 nm的紫外光区具有强的吸收特性[3-4]。研究表明，MAAs还具有抗氧化等多种生理活性[1，4-5]。
大型海藻是MAAs的理想来源之一，已引起研究者们的广泛关注[6-9]。研究表明，MAAs存在于所有大型红藻和大型褐藻中[10]。目前，大型海藻MAAs研究多集中在MAAs的分布[11-14]、活性[15-17]以及环境因子对其积累和诱导[4，9，13]等其它[4，11，18，19]方面。已有的 MAAs 提取和分离纯化研究主要集中在 Bangia atropurpurea[5]、Bostrychia scorpioides[7]、Nostoc flagelliforme[20]、海 萝（Gloiopeltis furcata）[21-22]、江 蓠（Gracilaria chilensis）[23]、坛紫菜（Porphyra haitanensis）[24]、紫菜（Porphyra sp.）[25]等大型红藻中，而国内外大型褐藻MAAs研究很少。本实验室前期研究指出，570多种含有MAAs的大型海藻中大型褐藻数量不超过50种[11]。目前，仅在Desmarestia menziesii[12]、Padina crassa[12]和其他大型褐藻[13]中发现了MAAs，很多大型褐藻MAAs并未被探明。此外，除了 shinorine、porphyra-334、palythine、palythinol、asterina-330和mycosporine-glycine等常见MAAs外，大型褐藻还含有很多未知MAAs[10-15]。因此，非常有必要对大型褐藻MAAs开展研究，以填补国内外相应领域的研究空白，并可能获得新的MAAs。
基于上述，选定羊栖菜（Hizikia fusifarme）、海带（Laminaria japonica）、马尾藻（Sargassum sp.）和裙带菜（Undaria pinnatifida）4种大型褐藻，通过单因素和正交试验，研究液料比、提取时间、次数和温度对MAAs得率的影响，获得4种大型褐藻MAAs适宜提取工艺。进一步，采用紫外波长扫描、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）和质谱（mass spectrum，MS）测定，并参照已有文献报道，鉴定它们中的 MAAs，即 palythine、palythenic acid、porphyra-334 和shinorine。其中，palythenic acid目前仅在大型红藻Solieria chordalis中发现[26]，该类菌胞素氨基酸单体化合物（mycosporine-like amino acid，MAA）在浮游植物和微藻中较为常见。目前，国内外尚未见马尾藻提取工艺和4种大型褐藻MAAs鉴定研究，本文为大型褐藻MAAs的研究提供了技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
羊栖菜、海带、马尾藻、裙带菜：江苏碧蓝海洋生物科技有限公司，经清洗、冷冻干燥、粉碎后，备用。
甲醇、甲酸（色谱纯）：北京迪科马科技有限公司；无水乙醇（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；硅胶板：青岛海洋化工厂分厂；碘化铋钾：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
Cubis II电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；DXF-4D摇摆式粉碎机：广州大祥电子机械设备有限公司；FL-12770风冷商用冷柜：博兴县爱德信商用厨具有限公司；BUCHIR R210旋转蒸发仪：瑞士BUCHIR公司；SHB-IIIA循环水式多用真空泵：临海市永昊真空设备有限公司；Millipore MIlli-Q超纯水系统：美国密理博公司；DKZ-2电热恒温振荡水槽：上海精宏实验设备有限公司；LGJ-10FD冷冻干燥机：北京松源华兴生物技术有限公司；T9CS双光束紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；1260高效液相色谱仪、Eclipse Plus C18色谱柱：美国安捷伦科技公司；HS-F1613台式超速冷冻离心机、TSQ Quantum Access型液质联用仪：赛默飞世尔科技公司。
1.3 方法
1.3.1 大型褐藻MAAs的提取
称取大型褐藻干粉末10 g，加入250 mL浓度25%的甲醇水溶液，45℃振荡提取2 h，以8 000 r/min常温离心20 min。重新加入相同体积的25%甲醇溶液，按照上述条件重复浸提1次～2次。上清液合并、减压蒸发后（除去甲醇），加入4倍体积无水乙醇，放在-18℃冰箱中静置6 h。低温离心20 min或直接抽滤，上清液或滤液40℃下减压蒸发，浓缩液冷冻干燥，即得MAAs提取物。MAAs得率按以下公式进行计算。
式中：R为MAAs得率，%；m1为初始提取的MAAs质量，g；m2为大型褐藻干粉末质量，g。
根据文献报道的MAAs摩尔消光系数ε[2]及计算方法[5]，得到4种大型褐藻MAAs提取物中MAA含量的计算公式如下。
式中：X为MAA含量，mg；A为特征吸收波长下的吸光度；M 为分子质量（shinorine，332；palythine，244；porphyra-334，346；palythenic acid，328）；ε 为 MAAs摩尔消光系数 （shinorine，43 700；palythine，35 500；porphyra-334，42 300；palythenic acid，29 200）。
1.3.2 单因素试验
在提取过程中，根据表1设定的因素水平，依次分析液料比、提取时间、提取温度和提取次数对4种大型褐藻MAAs得率的影响，每个试验设定3个平行样。在考察提取温度单因素试验中，提取时间、提取次数和液料比设定为2 h、2次和20 mL/g；在考察液料比单因素试验中，提取温度、提取时间和提取次数设定为45℃、2h和2次；在考察提取时间单因素试验中，提取温度、提取次数和液料比设定为45℃、2次和20 mL/g；在考察提取次数单因素试验中，提取温度、提取时间和液料比设定为和液料比设定为45℃、2 h和20 mL/g。单因素试验因素与水平见表1。
表1 单因素试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of single factor tests
水平 因素提取温度/℃ 提取次数1 35 1液料比/（mL/g）提取时间/h 10 1 2 40 2 15 2 3 45 20 3 3 4 50 25 4 4 5 55 5 30 5
1.3.3 正交试验
根据单因素试验结果，采用L9（34）正交试验设计，以MAAs得率为指标，进一步分析提取温度（A）、液料比（B）和提取时间（C）3个因素对4种大型褐藻MAAs提取的影响（因素水平见表2），试验过程中不设定平行样。
表2 正交试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of orthogonal tests
水平 因素A提取温度/℃ B液料比（mL/g） C提取时间/h 1 35 20 1 2 40 25 2 3 45 30 3
1.3.4 MAAs检测
1.3.4.1 紫外波长扫描
称取大型褐藻MAAs提取物0.1 g溶解于1 mL水中，经0.45 μm水系滤膜过滤后，在紫外-可见分光光度计进行200 nm～400 nm波长扫描，确定MAAs提取物特征吸收峰。
1.3.4.2 硅胶薄层层次（silica gel thin layer chromatography，TLC）检测
称取大型褐藻MAAs提取物0.1 g，溶解于1 mL 25%甲醇溶液中（浓度均为0.1 g/mL），在硅胶G板上点样，以甲醇∶乙醇∶水（8∶10∶0.5，体积比）为展开剂。展开结束后，吹干G板，喷洒碘化铋钾溶液（7.3 g碘化铋钾，冰醋酸10 mL，蒸馏水60 mL）、静置，橙色或黄色斑点为MAAs阳性反应。
1.3.4.3 高效液相色谱法测定
检测器设置波长范围190 nm～400 nm，色谱柱选用 Agilent Eclipse Plus C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）。流动相:A为0.2%甲酸-水；B为乙腈，梯度设置如表3所示；流速1.0 mL/min、柱温25℃、波长330 nm、进样量 50 μL。
表3 流动相洗脱梯度
Table 3 Mobile phase elution gradient
时间/min 流动相A/% 流动相B/%0 95 5 5 95 5 15 30 70 15.1 95 5 22 95 5
1.3.4.4 质谱测定
喷雾气压310 kPa，氮气流速10.0 L/min，干燥温度350℃，破碎电压100 V，毛细管电压4 500 V，全扫描，参比离子质荷比：121.050 9，922.009 8，为参比离子对测定结果进行实时矫正，分辨率m/z在922.009 8处为11 300 全扫描，质荷比（m/z）为 120～100 0。
1.4 数据处理
利用SPSS 25分别对单因素和正交试验结果进行显著性和方差分析，采用Origin 2018绘图。
2 结果与分析
2.1 大型褐藻MAAs提取工艺
2.1.1 单因素试验结果
2.1.1.1 液料比对4种大型褐藻MAAs得率的影响
液料比对4种大型褐藻MAAs得率的影响见图1。
图1 液料比对4种大型褐藻MAAs得率的影响
Fig.1 Effects of solid-liquid ratio on the yields of MAAs from 4 brown macroalga
相同样品不同液料比字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
由图1可知，随液料比增加，整体上4种大型褐藻MAAs得率增大。在液料比为20mL/g或25mL/g时达到最大值，此时得率显著（P＜0.05）高于液料比为10 mL/g时所制备MAAs的得率，这表明，较大的液料比有利于大型褐藻MAAs的提取。当液料比继续增加时，4种大型褐藻MAAs得率并未发生明显变化。
2.1.1.2 提取时间对4种大型褐藻MAAs得率的影响
提取时间对4种大型褐藻MAAs得率的影响见图2。
图2 提取时间对4种大型褐藻MAAs得率的影响
Fig.2 Effects of extraction time on the yields of MAAs from 4 brown macroalga
相同样品不同提取时间字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
由图2可知，4种大型褐藻MAAs得率随提取时间的延长呈现先明显增加后略微下降的趋势。在提取时间为3 h时，马尾藻MAAs得率最大；其它3种大型褐藻MAAs得率在提取时间为2 h时达到最大。
2.1.1.3 提取次数对4种大型褐藻MAAs得率的影响
提取次数对4种大型褐藻MAAs得率的影响见图3。
图3 提取次数对4种大型褐藻MAAs得率的影响
Fig.3 Effects of extraction times on the yields of MAAs from 4 brown macroalga
相同样品不同提取次数字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
由图3可知，整体来看，随提取次数的增加，4种大型褐藻MAAs得率增加，在提取次数为2次时所得到的MAAs得率较大，表明较多的提取次数，利于4种大型褐藻MAAs的提取。当提取次数继续增加时，4种大型褐藻MAAs得率并未出现明显增加。
2.1.1.4 提取温度对4种大型褐藻MAAs得率的影响
提取温度对4种大型褐藻MAAs得率的影响见图4。
图4 提取温度对4种大型褐藻MAAs得率的影响
Fig.4 Effects of extraction temperature on the yields of MAAs from 4 brown macroalga
相同样品不同提取温度字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
从图4可知，4种大型褐藻MAAs得率随提取温度的升高先增大后略微降低，分别在45℃（海带和裙带菜）或40℃（羊栖菜和马尾藻）时，得率达到最大，这表明适当地升高温度有利于MAAs迅速溶出。
2.1.2 正交试验结果
表4为正交试验结果直观分析，表5为正交试验结果方差分析。
表4 正交试验结果
Table 4 Results of orthogonal tests
试验号 因素 MAAs得率/%A B 羊栖菜 海带 马尾藻 裙带菜1 1 1 27.97 44.69 8.24 18.08 2 1 2 30.61 43.58 6.99 20.77 3 1 3 28.62 43.01 7.33 17.64 4 2 1 29.76 46.67 8.11 19.45 5 2 2 31.38 44.65 7.78 20.94 6 2 3 28.71 43.03 7.46 18.89 7 3 1 28.06 46.69 8.25 18.97 8 3 2 31.23 44.51 7.23 21.86 9 3 3 28.62 44.94 6.72 20.21 29.27 28.60 43.76 46.02 44.08 29.95 31.07 44.78 44.25 45.06 29.10 28.65 45.38 43.66 44.78 R 0.85 2.48 R 1.62 2.36 0.99适宜组合 A2B2C2 适宜组合 A3B1C2 7.52 8.20 18.83 18.83 19.61 7.76 7.33 19.76 21.19 20.14 7.35 7.10 20.35 18.91 19.18 R 0.41 1.10 R 1.52 2.36 0.96适宜组合 A2B1C3 适宜组合 A3B2C2 C 1 2 3 2 3 1 3 1 2羊k1栖k2菜k3 29.10 29.87 29.35 0.77海k1带k2 k3马k1尾k2藻k3 7.58 7.32 7.74 0.42裙k1带k2菜k3
表5 正交试验结果方差分析
Table 5 Analysis of variance of orthogonal tests results
注：** 表示影响显著，P＜0.01；* 表示影响显著，P＜0.05。
指标 方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值羊 修正模型 14.157 6 2.360 21.011 0.046*栖 截距 7 800.422 1 7800.422 69460.573 0.000**菜 A提取温度 1.217 2 0.609 5.42 0.156 B液料比 12.009 2 6.005 53.47 0.018*C提取时间 0.931 2 0.465 4.145 0.194误差 0.225 2 0.112总计 7 814.804 9修正后总计 14.382 8海 修正模型 14.610 6 2.435 24.895 0.039*带 截距 17 935.459 1 17 935.459 183 368.321 0.000**A提取温度 4.028 2 2.014 20.589 0.046*B液料比 9.031 2 4.515 46.165 0.021*C提取时间 1.551 2 0.776 7.93 0.112误差 0.196 2 0.098总计 17 950.265 9修正后总计 14.805 8马 修正模型 2.480 6 0.413 74.551 0.013*尾 截距 515.441 1 515.441 92 965.373 0.000**藻 A提取温度 0.351 2 0.176 31.661 0.031*B液料比 1.839 2 0.919 165.814 0.006**C提取时间 0.29 2 0.145 26.178 0.037*误差 0.011 2 0.006总计 517.933 9修正后总计 2.491 8裙 修正模型 15.641 6 2.607 86.766 0.011*带 截距 3 473.531 1 3 473.531 115 613.077 0.000**菜 A提取温度 3.509 2 1.755 58.403 0.017*B液料比 10.743 2 5.372 178.793 0.006**C提取时间 1.388 2 0.694 23.101 0.041*误差 0.060 2 0.03总计 3 489.232 9修正后总计 15.701 8
由表5可知，4种大型褐藻MAAs提取过程中，除羊栖菜的因素A不显著外，其余3种大型褐藻的因素A和B均是影响显著的（P＜0.05）因素，因此，提取温度和液料比均维持直观分析结果，不可统一；在裙带菜和马尾藻MAAs提取过程中，因素C是显著（P＜0.05）因素，同样地，也应该维持直观分析结果，不能取相同水平。故此，4种大型褐藻MAAs提取的适宜条件各不相同。对4种大型褐藻MAAs的最佳提取工艺进行验证试验，结果见表6。
表6 4种大型褐藻MAAs的最佳提取工艺
Table 6 Optimum extraction process of MAAs from 4 brown macroalga
褐藻 因素 得率/%温度/℃液料比/（mL/g）时间/h羊栖菜 40 25 2 31.40海带 45 20 2 46.71马尾藻 40 20 3 8.29裙带菜 45 25 2 21.92
采用适宜提取工艺（表6），制备到羊栖菜、海带、马尾藻和裙带菜MAAs提取物，它们的MAAs得率依次为31.40%、46.71%、8.29%和21.92%。验证试验得到的得率均高于表4中所有组合的得率。
2.2 MAAs提取物定性检测和鉴定
图5为4种大型褐藻MAAs提取物200nm～400nm波长紫外光谱扫描图。
图5 4种大型褐藻提取物的紫外波长扫描图
Fig.5 Ultraviolet wavelength scanning of MAAs extracts from 4 brown macroalga
从图5可以看出，在310 nm～360 nm，马尾藻MAAs提取物有明显吸收峰；其余3种大型褐藻在260 nm～280 nm有吸收峰。研究表明，某些MAAs特征吸收峰为260 nm～280 nm[17]。进一步，采用硅胶薄层层析，对这些MAAs提取物进行定性检测，结果见图6。
图6 4种大型褐藻MAAs提取物的硅胶薄层层析检测
Fig.6 Silica gel TLC detection of MAAs extracts from 4 brown macroalga
由图6发现，4种大型褐藻MAAs提取物均在硅胶G板上呈现了黄色斑点。将紫外扫描和薄层层析检测结合，可以对待测样品中的MAAs进行快速筛选。同时，硅胶G板上斑点面积的大小，也能直观反映样品中MAAs含量的高低。
4种大型褐藻MAAs提取物的高效液相色谱图见图7。
图7 4种大型褐藻MAAs提取物的高效液相色谱图
Fig.7 HPLC of MAAs extracts from 4 brown macroalga
在图7中，能够清晰地看出4种大型褐藻MAAs提取物在不同停留时间出现吸收峰，表明它们中存在多种MAAs，然而无法确定具体MAAs种类。进一步综合分析质谱和高效液相色谱结果，并参照已有报道[17-18]，鉴定了4种大型褐藻MAAs提取物中MAAs组成，结果见表7。
表7 4种大型褐藻MAAs提取物相对峰面积、最大吸收波长、质谱相应信息和MAAs种类
Table 7 Relative peak area，maximum absorption wavelength，corresponding information on mass spectrum，and MAAs species of MAAs from 4 brown macroalga
注：/表示未检测出。
大型褐藻峰面积/% 吸收波长/nm[M+H]+离子质量 MAAs种类羊栖菜21.2260～280205204 gadusol（maas前体）260～280 222.7 226 未知78.8 319 245.1 244 palythine 334 333.1 332 shinorine 334 347.0 346 porphyra-334 337 329.0 328 palythenic acid海带 35.40 260～280 205 204 gadusol 260～280 222.7 226 未知64.60 319 245.1 244 palythine 334 333.1 332 shinorine 334 347.0 346 porphyra-334 337 329.0 328 palythenic acid 370 / / 未知马尾藻 22.43 260～280 205 204 gadusol 260～280 222.7 226 未知77.57 319 245.1 244 palythine 334 333.1 332 shinorine 334 347.0 346 porphyra-334 337 329.0 328 palythenic acid 360 / / 未知裙带菜 41.26 260～280 205 204 gadusol 260～280 222.7 226 未知58.74 319 245.1 244 palythine 334 333.1 332 shinorine 334 347.0 346 porphyra-334 337 329.0 328 palythenic acid 330 / / 未知
从表7可以看出，4种大型褐藻MAAs提取物都含 有 shinorine、palythine、porphyra-334 和 palythenic acid 4种MAA，此外，海带和裙带菜中还有未知MAA。
在上述试验基础上，根据MAAs摩尔消光系数，计算得到它们在相应大型褐藻MAAs提取物中的含量，结果见表8。
表8 4种大型褐藻MAAs提取物中MAA含量
Table 8 Content of MAA in the MAAs from 4 brown macroalga μg/g
大型褐藻 palythenic acid palythine羊栖菜 5.71 4.2 porphyra-334 4.11 shinorine 3.68海带 1.02 0.76 0.93 0.64马尾藻 6.44 4.08 4.73 4.26裙带菜 3.67 2.522.252.38
表8结果表明，马尾藻和羊栖菜MAAs提取物中palythenic acid、porphyra-334和shinorine含量明显高于其它3种大型褐藻；羊栖菜MAAs提取物中，palythine含量最高。同时，还发现在同一种大型褐藻中，palythenic acid含量明显高于其它3种MAA含量。在后续研究中，可以对马尾藻和羊栖菜MAAs提取物中的palythenic acid进行纯化制备。
3 结论
本文建立了羊栖菜、海带、马尾藻和裙带菜等4种大型褐藻MAAs提取工艺，优化发现当提取温度、时间和液料比依次为 40、45、45℃和 40℃；2、2、2 h和 3 h；25、20、25 mL/g和 20 mL/g时，MAAs提取物得率最大。经紫外光谱、薄层层析、高效液相色谱和质谱分析，鉴定了4种大型褐藻MAAs提取物的MAAs组成。但尚未建立4种大型褐藻MAAs提取物的分离纯化工艺，后续工作中还需展开MAAs纯化制备研究。MAAs作为一种多功能活性化合物，在食品、医药和化妆品领域展现出巨大的发展前景。本文为大型褐藻MAAs研究提供了良好的技术支撑，并为其它大型海藻MAAs的筛选和鉴定提供了必要的理论参考。
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