我国大豆的年消费量已经连续四年超过1亿t，其中大豆的加工量约占消费总量的84%[1]。大豆胚芽是低温豆粕制取的副产物之一，占大豆总质量的2.0%～2.5%[2]。大豆胚芽中含有丰富的粗蛋白和粗脂肪，此外包含丰富的天然活性物质，如植物甾醇、大豆异黄酮、大豆磷脂、维生素E、角鲨烯等[3-4]。其中植物甾醇是一种天然存在于豆类、种子、谷物、坚果、水果中以环戊烷多氢菲为基本骨架的活性甾族类化合物[5-6]。研究发现植物甾醇能够在脂肪微团的运输和吸收过程中与胆固醇竞争，减少胆固醇的吸收，从而降低血液中总胆固醇和低密度脂蛋白浓度，有效预防心脑血管疾病[7-9]。
在食品工业中，植物甾醇多数通过脱臭馏出物皂化得到，主要以游离态形式存在，而游离态甾醇的溶解性较差，生物利用性较低[10-11]。因此，工业上常将游离甾醇与脂肪酸酯化，再以甾醇酯的形式加以利用。大豆胚芽中的植物甾醇资源含量丰富，前期研究发现大豆胚芽毛油中甾醇含量约为4%，其中，酯态甾醇约占80%，是一种极好的天然植物甾醇酯资源。然而，目前工业生产中大豆胚芽多作为加工副产物应用于饲料行业，对其活性组分的开发也主要集中于大豆胚芽中的异黄酮和皂甙等[12-14]，对大豆胚芽油脂及其丰富的植物甾醇（酯）资源并未充分开发利用，造成了资源的极大浪费。
相较于传统的皂化再酯化生产植物甾醇酯工艺，本研究直接从富含植物甾醇酯的大豆胚芽粗提物中分离纯化甾醇酯。采用柱层析的方法对大豆胚芽粗提物中的甾醇酯进行分离纯化，通过正交试验优化最佳工艺条件，并对大豆胚芽甾醇酯产品进行表征，为大豆胚芽的开发利用与植物甾醇酯的工业化生产提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 试验材料与设备
大豆胚芽（粗蛋白41.45%、粗脂肪10.46%、水分9.34%、粗纤维7.49%）：山东香驰豆业集团有限公司；正己烷、石油醚、吡啶、氢氧化钾、冰乙酸、无水乙醇（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；中性氧化铝（100目～200目、200目～300目）、硅胶粉（100目～200目、200目～300目）：青岛海洋化工有限公司；乙醚、丙酮、三氯甲烷（分析纯）：四川西陇科学有限公司；胆固醇硬脂酸酯标准品、胆甾烷醇标准品：美国Sigma公司；N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）：阿拉丁试剂有限公司。
2695高效液相色谱仪：美国Waters公司；7890气相色谱仪、7890A-5975C气质联用仪：安捷伦科技有限公司；370DTGS傅里叶红外光谱仪：美国PE公司；FW-100高速粉碎机：永康市红太阳机电有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 大豆胚芽粗提物的制备
将大豆胚芽放置于鼓风干燥箱中干燥（80℃，7 h），通过高速粉碎机将大豆胚芽粉碎至100目，过筛备用。称取一定质量的大豆胚芽粉末，分别用无水乙醚、无水乙醇、石油醚、丙酮、正己烷、氯仿对大豆胚芽粉末进行索氏抽提，温度设定为高于提取溶剂沸点15℃，抽提10 h，提取结束后旋转蒸发除去多余溶剂，将得到的大豆胚芽粗提物放置于70℃真空干燥箱中干燥至恒重。以大豆胚芽粗提物得率及甾醇酯含量为指标，选取最佳提取溶剂。大豆胚芽粗提物得率及甾醇酯含量按式（1）和（2）计算。
气相色谱条件：仪器AgilentGC7890；色谱柱DB-1ht（30m×320μm×0.25μm）；载气为氮气；流速 3.0mL/min；初始柱温100℃，50℃/min升至300℃保持5 min，20℃/min升至360℃保持15 min；进样口温度350℃；FID 检测器温度 350 ℃；分流比 20∶1；进样量 1 μL。
1.2.3.1 吸附剂种类对大豆胚芽甾醇酯纯度和得率的影响
以正己烷∶乙醚∶乙酸=90∶10∶1（体积比）为洗脱剂比例，12∶1为层析柱高度与直径比（H/D），2.0 g为上样
1.2.2 大豆胚芽粗提物的理化性质分析
水分及挥发物含量参考GB 5009.236—2016《食品安全国家标准动植物油脂水分及挥发物的测定》测定；酸价参考GB 5009.229—2016《食品安全国家标准食品中酸价的测定》测定；过氧化值参考GB 5009.227—2016《食品安全国家标准食品中过氧化值的测定》测定；皂化值参考GB/T 5534—2008《动植物油脂皂化值的测定测定》；不皂化物含量参考GB/T 5535.2—2008《动植物油脂不皂化物测定第2部分：己烷提取法》测定；生育酚含量参考Huang等[15]的方法测定；总甾醇含量参考GB/T 25223—2010《动植物油脂甾醇组成和甾醇总量的测定气相色谱法》测定；游离甾醇含量参考李妲汨等[16]的方法测定。
1.2.3 柱层析纯化甾醇酯单因素试验
称取一定质量的大豆胚芽粗提物，并配制不同体积比的洗脱剂（正己烷∶乙醚∶乙酸）待用。称取适量的吸附剂于烧杯中，倒入适量的洗脱剂混匀并用漏斗注入层析柱中，使吸附剂沉降，用压力球加压至吸附剂压实。将称取的大豆胚芽粗提物均匀添加至制备好的层析柱中，洗脱至甾醇酯全部流出（用薄层色谱进行判断），收集甾醇酯组分旋转蒸发除去溶剂，在真空干燥箱中干燥至恒重后称重。以胆固醇硬脂酸酯为标准品，采用气相色谱测定其纯度并按式（3）计算得率。量，考察4种吸附剂对柱层析分离纯化甾醇酯的影响。
1.2.3.2 洗脱剂体积比对大豆胚芽甾醇酯纯度和得率的影响
在上样量2.0 g，填充剂200目～300目硅胶粉，H/D12∶1条件下，选取不同极性比例的洗脱剂分离纯化甾醇酯，考察5种洗脱剂体积比对甾醇酯纯度和得率的影响，洗脱剂极性大小见表1。
表1 不同体积比洗脱剂的总极性
Table 1 Total polarity of different eluent ratios
注：总极性计算公式为P=VAPA+VBPB+…（式中：P为洗脱剂总极性；VA为A组分体积分数；PA为A组分极性大小；VB为B组分体积分数；PB为B组分极性大小[23]）。
洗脱剂 体积比 总极性正己烷∶乙醚∶乙酸 95∶5∶1 0.264正己烷∶乙醚∶乙酸 90∶10∶1 0.406正己烷∶乙醚∶乙酸 85∶15∶1 0.548正己烷∶乙醚∶乙酸 80∶20∶1 0.690正己烷∶乙醚∶乙酸 75:25∶1 0.832
1.2.3.3 上样量对大豆胚芽甾醇酯纯度和得率的影响
以200目～300目硅胶粉为层析柱填充剂，正己烷∶乙醚∶乙酸=90∶10∶1（体积比）为洗脱剂比例，H/D12∶1，考察上样量（0.5、2、3、4、5 g）对柱层析纯化甾醇酯得率和纯度的影响。
1.2.3.4 填柱高度与直径比（H/D）对大豆胚芽甾醇酯纯度和得率的影响
以200目～300目硅胶粉为层析柱填充剂，正己烷∶乙醚∶乙酸=90∶10∶1（体积比）为洗脱剂比例，上样量 2.0 g，考察填柱高度与直径比 H/D（8∶1、10∶1、12∶1、14∶1、16∶1）对柱层析纯化甾醇酯得率与纯度的影响。
1.2.4 正交试验
依据单因素试验结果，以 H/D（A）、上样量（B）、洗脱剂比例（C）为变量，以大豆胚芽甾醇酯的得率及纯度为考察指标，通过正交试验优化出大豆胚芽甾醇酯最佳分离纯化工艺条件。正交试验因素水平见表2。
表2 L9（33）纯化工艺正交因素水平表
Table 2L9（33）orthogonal factors and levels for the purification process
水平 因素A H/D B上样量/g C洗脱剂体积比1 8∶1 0.5 95∶5∶1 2 12∶1 2 90∶10∶1 3 16∶1 3 85∶15∶1
1.2.5 大豆胚芽甾醇酯产品的表征
1.2.5.1 甾醇酯纯化产品的高效液相色谱分析
将纯化后的大豆胚芽甾醇酯与胆固醇硬脂酸酯标准品溶于色谱纯正己烷，分别进行高效液相色谱分析，分析条件：硅胶色谱柱（5 μm×4.6 mm×250 mm）；进样量10 μL；柱温30℃；采用等度洗脱，流动相为正己烷-异丙醇（体积比=20∶1），流速 0.8mL/min；紫外检测波长210 nm。
1.2.5.2 甾醇酯纯化产品的红外光谱分析
将溴化钾压成薄片，放入傅里叶红外光谱仪扫描背景，再将待测样品置于溴化钾薄片上，使其均匀分布。分析条件为采样32次，扫描范围4 500 cm-1～400 cm-1。
1.2.5.3 大豆甾醇酯的甾醇组成及脂肪酸组成分析
将纯化后的甾醇酯产品用KOH-乙醇溶液于80℃皂化1.5 h，酸化后用正己烷萃取不皂化物，旋转蒸发除去溶剂并对其进行薄层色谱分离，分别得到甾醇酯上的甾醇及脂肪酸色谱带。
采用气质联用色谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）对甾醇酯上的甾醇组成进行分析，条件为色谱柱 HP-5（30 m×250 μm×0.25 μm）；进样口温度290℃；FID检测器温度360℃；分流比20∶1；载气为氮气，流速1.0 mL/min；进样量1 μL。离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电离电压70 eV；扫描范围33 m/z～650 m/z。采用气相色谱检测甾醇酯上的脂肪酸组成，条件：色谱柱 SGEBPX-70（30 m×250 μm×0.25μm）；进样口温度250℃；分流比20∶1；FID检测器温度250℃；氢气流量40 mL/min；空气流量400 mL/min；柱箱初始温度170℃，以2℃/min升至210℃，保持20 min；载气为氮气，流速 1.0 mL/min；进样量 1.0 μL。
2 结果与分析
2.1 大豆胚芽粗提取的制备
不同提取溶剂对大豆胚芽粗提物得率及甾醇酯含量的影响结果见图1。
图1 不同溶剂对大豆胚芽粗提物得率及甾醇酯含量的影响
Fig.1 Effect of different solvents on crude extract yield and sterol ester content
不同字母表示同一指标差异显著，P＜0.05。
由图1可见，石油醚为提取溶剂时，大豆胚芽粗提物中甾醇酯含量最高，达到（4.15±0.02）g/100 g，说明石油醚对甾醇酯的溶解性和选择性较好，其次为丙酮，甾醇酯含量为（3.92±0.37）g/100 g。除此之外，乙醇为提取溶剂时，大豆胚芽提取物得率最高，为（11.30±0.04）%，这可能因为大豆胚芽中醇溶性物质较多，如大豆异黄酮、低聚糖、醇溶蛋白等[17]，但乙醇极性较大，对甾醇酯溶解性较差，因此其中甾醇酯含量较低[（0.99±0.19）g/100g]；综合考虑溶剂的毒性、价格、沸点等因素[18]，本试验选择石油醚作为大豆胚芽粗提物的提取溶剂。
2.2 大豆胚芽粗提物的主要理化指标分析
大豆胚芽粗提物的主要理化指标结果见表3。
表3 大豆胚芽粗提物理化指标
Table 3 Physical and chemical indicators of soybean germ crude extract
酸价/（mg/g）过氧化值/（mmol/kg）不皂化物/%生育酚/%水分/%皂化值/（mg/g）总甾醇含量/（g/100 g）游离甾醇含量/（g/100 g）甾醇酯含量/（g/100 g）5.42±0.06 1.51±0.25 5.74±0.06 0.34±0.01 3.64±0.05 180.22±0.24 4.69±0.02 0.54±0.01 4.15±0.02
由表3可知，大豆胚芽粗提物中植物甾醇含量（4.69 g/100 g粗提物）高于小麦胚芽油（0.86 g/100 g油）、玉米胚芽油（1.10 g/100 g油）、米糠油（1.00 g/100 g油）[19-20]。
2.3 柱层析分离纯化大豆胚芽甾醇酯的单因素试验
2.3.1 吸附剂种类对大豆胚芽甾醇酯纯度和得率的影响
4种吸附剂对柱层析分离纯化甾醇酯的影响结果见图2。
图2 吸附剂种类对甾醇酯纯度和得率的影响
Fig.2 Effect of adsorbent type on the purity and yield of sterol esters
不同字母表示同一指标差异显著，P＜0.05。
由图2可知，随着2种吸附剂目数的增大，甾醇酯的得率及纯度均有所提高。这是由于200目～300目的吸附剂相较于100目～200目，颗粒较小，洗脱剂流经柱子时阻力较大，流速较慢，冲柱时间较长，更利于甾醇酯的吸附与解吸[21-22]，使得甾醇酯与其他极性相似组分分离（如甘三酯）。当吸附剂目数相同时，硅胶粉的得率及纯度均高于氧化铝。如吸附剂为100目～200目氧化铝时，甾醇酯纯度为（86.51±1.34）%，得率为（75.09±0.16）%，而吸附剂为相同目数的硅胶粉时，甾醇酯的纯度和得率分别为（90.73±0.46）%、（85.81±2.44）%。这是由于氧化铝极性大于硅胶粉，使得提取物中极性较小的组分被较快洗脱出来，但因洗脱时间较短，分离效果较差。因此选择200目～300目硅胶粉为柱层析的吸附剂。
2.3.2 洗脱剂体积比对大豆胚芽甾醇酯纯度和得率的影响
洗脱剂体积比对大豆胚芽甾醇酯纯度和得率的影响见图3。
图3 洗脱剂体积比对甾醇酯纯度和得率的影响
Fig.3 Effect of eluent ratio on the purity and yield of sterol esters
不同字母表示同一指标差异显著，P＜0.05。
由图3可见，甾醇酯得率随着总极性的增加先增大后减小，这可能由于洗脱剂总极性较小时，对甾醇酯洗脱能力较强，较易将其从层析柱中洗脱，当洗脱剂（正己烷∶乙醚∶乙酸）体积比为 90∶10∶1 时，甾醇酯的得率达到最高。随着洗脱剂总极性的增大，对甾醇酯的分离效果差，致使得率降低。当洗脱剂体积比在 95∶5∶1～85∶15∶1 时，甾醇酯纯度随洗脱剂总极性变化较小，无显著性差异，随着洗脱剂总极性增大，甾醇酯纯度明显降低。这可能由于甾醇酯与其他组分在不同极性的洗脱剂下分离效果不同。当洗脱剂（正己烷∶乙醚∶乙酸）体积比为90∶10∶1时，甾醇酯的得率[（94.36±1.77）%]及纯度[（96.80±0.16）%]均达到最高，因此，选择正己烷∶乙醚∶乙酸=90∶10∶1（体积比）为最佳洗脱剂比例。
2.3.3 上样量对大豆胚芽甾醇酯纯度和得率的影响
上样量对柱层析纯化甾醇酯得率和纯度的影响结果见图4。
图4 上样量对甾醇酯纯度和得率的影响
Fig.4 Effect of loading volume on the purity and yield of sterol esters
不同字母表示同一指标差异显著，P＜0.05。
由图4可见，甾醇酯得率及纯度随着上样量的增加逐渐下降，在上样量为2.0 g时，甾醇酯的纯度及得率达到最高，纯度和得率分别为（95.70±0.16）%与（94.30±1.45）%。继续加大上样量至3.0 g时，通过SPSS进行数据分析，发现与2.0 g相比，两者纯度无显著差异，（P＞0.05），但甾醇酯的得率显著下降。这是因为层析柱对样品的负载能力是一定的[17]，应在层析柱的负载范围内选择最大的上样量，因此柱层析最佳上样量选择2.0 g。
2.3.4 填柱高度与直径比（H/D）对大豆胚芽甾醇酯纯度和得率的影响
填柱高度与直径比（H/D）对柱层析纯化甾醇酯得率与纯度的影响结果见图5。
图5 填柱高度与直径比（H/D）对甾醇酯纯度和得率的影响
Fig.5 Effect of height to diameter ratio（H/D）of column on the purity and yield of sterol esters
不同字母表示同一指标差异显著，P＜0.05。
如图5所示，H/D对甾醇酯纯度影响较小，随着H/D的增加，甾醇酯纯度基本不变。而甾醇酯的得率随着H/D的升高先增大后基本保持不变，当柱层析H/D为12∶1时，甾醇酯的纯度及得率均较高，分别为（96.65±0.12）%、（94.56±1.01）%。继续增加 H/D 至 16∶1时，甾醇酯的得率达到最佳（94.76±0.04）%，这是由于填充剂的高度决定样品在层析柱中的迁移长度，迁移长度越长，越有利于甾醇酯的分离纯化。但通过SPSS分析发现，H/D 为 12∶1、14∶1、16∶1 时，甾醇酯的得率及纯度均无显著性差异，考虑到耗材节约，选择12∶1作为最佳H/D。
2.4 柱层析纯化甾醇酯的正交试验
正交试验设计及结果见表4，方差分析见表5，其中综合分数为0.5×纯度+0.5×得率。
表4 正交试验设计及结果
Table 4 Orthogonal experimental design and results
试验号 A B C 得率/% 纯度/% 综合分数1 1 1 1 73.38 92.07 82.72 2 1 2 3 91.21 82.13 86.67 3 1 3 2 87.15 90.79 88.97 4 2 1 3 88.43 87.87 88.15 5 2 2 2 95.72 96.45 96.09 6 2 3 1 68.76 90.48 79.62 7 3 1 2 90.34 92.37 91.35 8 3 2 1 68.23 93.97 81.10 9 3 3 3 82.47 80.11 81.29 K1 258.36 262.23 243.45 K2 263.86 263.86 276.41 K3 253.74 249.88 256.11 k1 86.12 87.41 81.15 k2 87.95 87.95 92.14 k3 84.58 83.29 85.37 R 1.83 4.66 6.77
表5 方差分析
Table 5 Analysis of variance
注：** 表示影响极显著，P＜0.01；* 表示影响显著，P＜0.05。
方差来源 离差平方和 自由度 均方 F 显著性A 17.112 2 8.556 15.521 B 38.934 2 19.467 35.315 *C 184.404 2 92.202 167.262 **
由表4可知，各因素对甾醇酯分离纯化效果的主次顺序为：C＞B＞A，最佳工艺组合为 A2B2C2，即填充柱高度与直径比 12∶1，上样量 2.0 g，洗脱剂（正己烷∶乙醚∶乙酸）体积比90∶10∶1，在最佳条件下进行验证试验，甾醇酯纯度为（96.11±0.41）%，得率为（94.99±0.19）%。
2.5 大豆胚芽甾醇酯的表征
2.5.1 甾醇酯纯化产品的高效液相色谱分析
以胆固醇硬脂酸酯为标准品，通过高效液相色谱对纯化产品进行定性分析，结果见图6。
图6 胆固醇硬脂酸酯与大豆胚芽甾醇酯的高效液相色谱图
Fig.6 High-performance liquid chromatograms of cholesteryl stearate and soybean germ sterol esters
由图6可知，大豆胚芽甾醇酯的出峰时间为4 min左右，与胆固醇硬脂酸酯标准品出峰时间相近，说明纯化产物为甾醇酯。
2.5.2 甾醇酯纯化产品的红外光谱分析
采用红外光谱对纯化后的大豆胚芽甾醇酯进行表征，结果如图7所示。
图7 大豆胚芽甾醇酯的红外光谱
Fig.7 Infrared spectrum of soybean germ sterol esters
由图7可知，大豆胚芽甾醇酯在1 744.20 cm-1处有明显的吸收峰，是典型的C 
O红外吸收峰；在1 173.10 cm-1有吸收峰，为酯键O—C—O吸收峰。说明分离纯化出的产物为甾醇酯。
2.5.3 甾醇酯纯化产品的气质联用色谱分析
对纯化产品上的甾醇及脂肪酸进行分析，结果见图8、表6和表7。
图8 纯化产品的甾醇及脂肪酸气相色谱图
Fig.8 Gas chromatograms of sterol composition and fatty acids of purified product
a.甾醇；b.脂肪酸。
表6 气相质谱分析甾醇的特征离子碎片
Table 6 Characteristic ion fragments of sterols analyzed byGC-MS
名称 主要离子碎片（m/z）菜油甾醇 73、129、343、382、472豆甾醇 83、255、309、355、394 β-谷甾醇 43、213、357、396、486羊毛甾醇 69、173、393、483
表7 甾醇酯上甾醇及脂肪酸组成
Table 7 Sterol and fatty acid compositions in sterol esters
组成甾醇种类脂肪酸组成菜油甾醇豆甾醇β-谷甾醇羊毛甾醇棕榈酸硬脂酸油酸亚油酸亚麻酸花生酸山嵛酸相对含量/%9.12±0.05 3.33±0.02 75.17±0.14 12.37±0.11 7.31±0.74 1.48±0.17 4.98±0.08 69.34±0.08 15.72±0.15 0.69±0.02 0.48±0.10
通过图8、表6和表7可见，大豆胚芽甾醇酯中甾醇主要组成为菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、羊毛甾醇等，相对含量分别为（9.12±0.05）%、（3.33±0.02）%、（75.17±0.14）%、（12.37±0.11）%；其脂肪酸组成主要为棕榈酸、亚油酸、亚麻酸等，相对含量分别为（7.31±0.74）%、（69.34±0.08）%、（15.72±0.15）%。
3 结论
通过石油醚提取粗提物中甾醇酯含量最高[（4.15±0.02）g/100 g粗提物]，得率为（10.48±0.10）%。柱层析分离纯化大豆胚芽甾醇酯的最佳工艺条件为吸附剂200目～300目硅胶粉、洗脱剂（正己烷∶乙醚∶乙酸）体积比90:10∶1、上样量2.0 g、层析柱高度与直径比（H/D）12∶1。在最佳分离纯化条件下，大豆胚芽甾醇酯的纯度为（96.11±0.41）%，得率为（94.99±0.19）%（以大豆胚芽粗提物计）。通过液相色谱及红外光谱表征证明产物为甾醇酯，使用气相质谱及气相色谱分析出大豆胚芽甾醇酯的主要甾醇组成为β-谷甾醇、羊毛甾醇、菜油甾醇、豆甾醇等；甾醇酯的主要脂肪酸组成为亚油酸、亚麻酸、棕榈酸等。
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