青稞（Hordeum vulgare L.var.nudum Hook.f.）为禾木科大麦属植物，抗逆性强，适宜在寒冷的高海拔地区生长，在青藏高原上的种植历史已有3 500年[1]，是我国青海地区重要的粮食作物[2]。青稞中富含粗纤维、蛋白质、维生素等营养物质，且脂肪、总糖含量低，是适合糖尿病患者食用的主食之一[3]。除此之外，青稞中还含有大量黄酮、多酚、β-葡聚糖、γ-氨基丁酸等生物活性成分[4-5]，使其营养价值更加丰富，是功能食品开发的良好原料，在功能性食品领域具有广阔的应用前景。青稞中的β-葡聚糖含量远高于燕麦、小麦等其他谷物作物[5-6]，主要存在于籽粒胚乳细胞壁与糊粉层中，具有调节血脂、血糖、肠胃健康、提高免疫力、抗氧化应激损伤等功能[7-10]，目前已开发出不同形式的功能食品，如β-葡聚糖胶囊、粉剂以及咀嚼片等[11]。
β-葡聚糖主要提取方法有水提法[12]、碱提法[13]、亚临界萃取法[14]以及超声波辅助提取法[15]等，但这些方法耗时较长，且获得的β-葡聚糖纯度低，后续仍需纯化处理，导致提取β-葡聚糖的工序繁琐，生产成本较高[16-17]。微生物发酵法是近些年新兴的β-葡聚糖提取方法[18]，该法较传统水提等方法具有成本低、富集量高、发酵条件要求低的优点[19]。张玉良[20]运用黑曲霉菌株发酵富集燕麦麸中β-葡聚糖，结果显示纯度可达52.53%，且温度对其含量影响显著，而pH值对β-葡聚糖的含量影响不显著。刘新琦等[18]通过酵母菌发酵法提取的青稞β-葡聚糖得率为5.21%，比传统的水提法得率提高了60.80%。微生物生长过程中以还原糖、蛋白质等其他物质作为营养物进行生长，同时利用复杂的酶系统分解碳水化合物，而不消耗青稞中β-葡聚糖[21-22]，从而可以达到提高β-葡聚糖得率及去杂纯化的效果。此外部分微生物在生长过程中会产生一些含有β-葡聚糖的黏液[23]，所以利用发酵法提取青稞中的β-葡聚糖可以使植物以及微生物中的β-葡聚糖得到更好的应用。
目前，通过微生物富集β-葡聚糖的工艺多采用单一菌种发酵，复合菌种发酵法富集β-葡聚糖的研究较少。本试验以高活性干酵母、酿酒干酵母、葡萄酒酵母、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌6种菌种对青稞进行单菌发酵以及复合菌发酵，通过分析对比以及响应面试验筛选出最优复合发酵剂和最优发酵工艺，并对发酵富集得到的β-葡聚糖抗氧化活性进行了测定，以期为微生物发酵法富集β-葡聚糖、生产富含β-葡聚糖的青稞功能食品提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
带皮黑青稞：青海鑫宁生物科技有限公司；高活性干酵母、酿酒干酵母、葡萄酒酵母[属酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）类的不同类产品]：安琪酵母有限公司；植物乳杆菌LK-1（Lactiplantibacillus plantarum LK-1）：青海大学农牧学院微生物实验室保藏；嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）：郑州百益宝生物技术有限公司；β-葡聚糖标准品（纯度≥95%）：美国 Sigma公司；维生素 C（＞99.0%）：河北源创生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸） 二铵盐 [2，2’-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]（均为分析纯）：北京索莱宝生物科技有限公司；苯酚、无水乙醇、硼酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠、重蒸试剂、次氯酸钠、刚果红、二甲基亚砜、硫酸钾（均为分析纯）：上海长青化工有限公司。
1.2 仪器与设备
鼓风干燥箱（101-3AB）：上海川宏实验仪器有限公司；恒温水浴振荡器（SHA-B）；艾尔斯仪器制造有限公司；生化培养箱（SPX-250B-Z）：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；紫外可见分光光度计（UV-6600）：上海科那美科学仪器有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅（YM50）：上海沙鹰科学仪器有限公司；台式高速离心机（GL-168）：德国Eppendorf公司；超净工作台（ZHJH-C1112B）：上海智城分析仪器制造有限公司；多功能粉碎机（HY-400）：北京恒奥德仪器仪表有限公司。
1.3 方法
1.3.1 发酵法富集青稞中的β-葡聚糖
准确称取4.5 g青稞粉于150 mL锥形瓶中，加入54 mL蒸馏水，即料液比为1∶12（g/mL），高压蒸汽灭菌锅105℃灭菌20 min。取出冷却后，在超净工作台中加入青稞粉质量5%（质量分数）的菌粉，于恒温发酵箱中34℃发酵26 h。调发酵液pH值为6.0，按4 U/g加入耐高温α-淀粉酶，水浴温度90℃～95℃进行酶解去淀粉30min，碘液检测不含淀粉为止，冷却至室温。将除去淀粉的发酵液放入离心机，设置转速5 000 r/min离心15 min。收集上清液，加入3倍体积95%乙醇，醇沉3 h。收集沉淀真空冷冻干燥，得到青稞β-葡聚糖粗品。
1.3.2 热水浸提法提取青稞β-葡聚糖
参考李楠等[24]关于水提裸燕麦β-葡聚糖条件的优化方法并加以改进。具体工艺：准确称取4.5 g青稞粉于150 mL锥形瓶中，加入54 mL蒸馏水，即料液比为 1∶12（g/mL），在 52℃下提取 3 h。取出冷却后，调节发酵液pH值为6.0，按4 U/g加入耐高温α-淀粉酶，水浴温度90℃～95℃进行酶解去淀粉30 min，碘液检测不含淀粉为止，冷却至室温后，同1.3.1中的试验方法，得到青稞β-葡聚糖粗品。
1.3.3 青稞β-葡聚糖得率的测定
采用刚果红标准曲线法得到β-葡聚糖标准曲线方程：y=6.664x+0.022 2，R2=0.998 7。测定青稞提取物中β-葡聚糖含量，按下述公式计算青稞β-葡聚糖得率[25]。
式中：M1为提取的青稞β-葡聚糖质量，g；M为干燥的青稞原料质量，g。
1.3.4 青稞β-葡聚糖发酵富集的条件优化
1.3.4.1 菌种筛选及复配条件确定
固定基本条件为接种量5%（菌种/黑青稞粉，g/100 g），料液比 1∶12（g/mL），发酵时间 26 h，发酵温度34℃。研究不同菌种（高活性干酵母、酿酒干酵母、葡萄酒酵母、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌）、不同复配比（高活性干酵母∶酿酒干酵母∶嗜热链球菌）1∶1∶1、2∶1∶1、3∶1∶1（质量比）对青稞麸皮 β-葡聚糖得率的影响。
1.3.4.2 单因素试验
以黑青稞为发酵底物，固定料液比1∶12（g/mL）、接种量5%、发酵时间26 h，发酵温度34℃。分别考察接种量（3%、4%、5%、6%、7%）、发酵时间（22、24、26、28 h）和发酵温度（30、32、34、36℃）对发酵富集青稞 β-葡聚糖的影响，根据单因素试验结果和实际情况，选出对β-葡聚糖得率影响显著的因素进行响应面试验。
1.3.4.3 响应面优化试验
参考程洋洋等[25]的方法，根据单因素试验结果，对发酵影响较显著的3个因子发酵温度（A）、接种量（B）、发酵时间（C）设计三因素三水平的Box-Behnken中心复合试验，测定各组β-葡聚糖得率并作为响应值，共设计17组试验，试验设计因素水平及编码见表1。
表1 响应面试验因素及水平
Table 1 Factors and levels of response surface test
水平 因素A发酵温度/℃ B接种量/% C发酵时间/h-1 32 4 24 0 34 5 26 1 36 6 28
1.3.5 体外抗氧化活性的测定
1.3.5.1 DPPH自由基清除率的测定
参考DPPH自由基清除法[26-27]，用95%乙醇配制0.1 mmol/L DPPH溶液，取2 mL不同浓度待测样品加入2 mL DPPH溶液，混合均匀，避光反应30 min后5 000 r/min离心5 min，取上清液在517 nm处测定吸光值，以蒸馏水代替上述操作中的样品溶液为空白组调零。以VC做阳性对照，重复3次取平均值，并按下列公式计算DPPH自由基清除率。
DPPH 自由基清除率/%=[A0-（A1-A2）]/A0×100
式中：A0为空白组吸光值；A1为样品组吸光值；A2为无水乙醇代替DPPH反应液所得吸光值。
1.3.5.2 ABTS+自由基清除率的测定
参考ABTS+自由基清除法[27-28]，以蒸馏水为溶剂配制7 mmol/L ABTS溶液与2.5 mmol/L过硫酸钾溶液后分别定容至10 mL，在烧杯中混合，避光保存12 h后即为ABTS储备液，然后用无水乙醇将其稀释成734 nm下OD值为（0.70±0.02），即得ABTS工作液。将1 mL样品-无水乙醇稀释液与2 mL ABTS工作液在5 mL离心管中混匀，避光反应10 min，于734 nm处测定吸光值A1，无水乙醇代替样品测得吸光值A0，无水乙醇代替ABTS工作液测得吸光值A2，用无水乙醇调零，以VC为阳性对照，平行操作重复3次，ABTS+自由基清除率按下式计算。
ABTS+自由基清除率/%=[A0-（A1-A2）]/A0×100
1.4 数据处理与分析
所有试验均重复3次，采用Origin 8作图，单因素试验均采用SPSS Statistics 23进行数据分析，采用One-Way ANOVA进行单因素方差分析，采用Duncans'法进行多重比较检验，采用Design-Expert 13软件进行响应面试验设计及数据处理与分析。
2 结果与讨论
2.1 富集菌种及复配条件对青稞β-葡聚糖得率的影响
2.1.1 富集菌种对青稞β-葡聚糖得率的影响
选择6种常用的菌种作为富集β-葡聚糖的菌种，分别为高活性干酵母、酿酒干酵母、葡萄酒酵母、植物乳杆菌LK-1、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，添加量均为青稞粉质量的5%，不同菌种对β-葡聚糖得率的影响如图1所示。
图1 不同菌种对青稞β-葡聚糖得率的影响
Fig.1 Yield of β-glucan from highland barley fermented with different strains
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图1可知，微生物发酵法提取青稞中β-葡聚糖效果均显著高于热水浸提法。这可能是因为发酵过程中，微生物丰富的酶系统使青稞中的大分子物质被更好的利用分解，从而溶解出较多的β-葡聚糖，提高β-葡聚糖的提取效率。其中，高活性干酵母发酵提取的β-葡聚糖得率最高，这可能是因为糊化后的青稞发酵液中充足的碳源使酵母菌的活性较高，从而解离出较多的β-葡聚糖。酿酒干酵母与嗜热链球菌发酵富集的β-葡聚糖得率较热水浸提法分别提高了55%和56%，差异显著（P＜0.05）。因此，根据发酵液中β-葡聚糖得率筛选出高活性干酵母、酿酒干酵母、嗜热链球菌进行下一步试验。
2.1.2 复配条件对青稞β-葡聚糖得率的影响
不同复配比对青稞β-葡聚糖得率的影响结果见图2。
图2 复配比对青稞β-葡聚糖得率的影响
Fig.2 Yield of β-glucan from highland barley fermented with the mixture of strains at different ratios
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图2可知，随着高活性干酵母∶酿酒干酵母∶嗜热链球菌复配比的增大，发酵液中的β-葡聚糖得率呈先增加后减少的趋势。当高活性干酵母酿酒干酵母、嗜热链球菌复配比为2∶1∶1时β-葡聚糖得率最高为（31.14±0.07）%，与其他提取条件相比差异显著（P＜0.05），说明在此复配比下的青稞发酵液中微生物的比例较为平衡，彼此之间不存在相互竞争，但随着复配比的增加，发酵液中微生物的数量过多，而发酵液已经不能够为微生物提供充足的营养成分，彼此之间出现了相互竞争，所以导致β-葡聚糖得率减少。因此选择2∶1∶1为最佳复配比富集β-葡聚糖。
2.2 单因素试验结果
2.2.1 接种量对青稞β-葡聚糖得率的影响
不同接种量对青稞β-葡聚糖得率的影响结果见图3。
图3 接种量对青稞β-葡聚糖得率的影响
Fig.3 Effect of inoculum on yield of β-glucan from highland barley
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图3可知，随着接种量的增加，β-葡聚糖的得率先增加后趋于稳定，接种量太少时β-葡聚糖无法充分释放，接种量增大后得率也随着增大；当接种量为5%时，β-葡聚糖得率为25.64%，与接种量为6%、7%结果无显著性差异（P＞0.05），但显著高于接种量3%、4%（P＜0.05），说明过大的接种量增加了酿酒干酵母、嗜热链球菌、高活性干酵母菌的消耗，对富集β-葡聚糖无效果，因此选取接种量5%。
2.2.2 发酵时间对青稞β-葡聚糖得率的影响
不同发酵时间对青稞β-葡聚糖得率的影响结果见图4。
图4 发酵时间对青稞β-葡聚糖得率的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on yield of β-glucan from highland barley
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图4可知，随着发酵时间的延长，β-葡聚糖得率逐渐增加，在26 h时达到最高值，之后逐渐下降。发酵26 h与发酵22 h时的β-葡聚糖得率相比，提高了26.19%，差异显著（P＜0.05），可能是因为前 24 h菌种开始利用自身的酶系统发酵分解纤维素，到26 h时反应完全，因此最佳发酵时间为26 h。
2.2.3 发酵温度对青稞β-葡聚糖得率的影响
不同发酵温度对青稞β-葡聚糖得率的影响结果见图5。
图5 发酵温度对青稞β-葡聚糖得率的影响
Fig.5 Effect of fermentation temperature on yield of β-glucan from highland barley
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图5可知，随着发酵温度升高，青稞β-葡聚糖的得率逐渐增加，在34℃达到峰值之后下降，与30℃条件下的β-葡聚糖得率相比较，34℃时提高70.20%，差异显著（P＜0.05）。这可能是由于温度升高，分子热运动加快，导致单位时间内β-葡聚糖的溶出率升高。因此确定最佳发酵温度为34℃。
2.3 响应面试验结果
2.3.1 回归模型的建立及显著性分析
从上述单因素试验结果可知，发酵温度（A）、接种量（B）、发酵时间（C）对富集β-葡聚糖效果显著，以接种量5%、发酵温度34℃、发酵时间26 h为中心点，β-葡聚糖得率为响应值进行响应面优化，响应面试验结果见表2。
表2 响应面试验结果
Table 2 Results of response surface test
试验组 A发酵温度 B接种量 C发酵时间 Y β-葡聚糖得率/%1 0 1 1 25.21 2 -1 0 1 25.10 3 -1 1 0 24.83 4 0 -1 1 19.40 5 1 0 -1 20.10 6 0 0 0 43.01 7 1 1 0 24.82 8 1 0 1 29.21 9 0 1 -1 23.21 10 -1 -1 0 21.02 11 1 -1 0 19.60 12 0 -1 -1 18.10 13 0 0 0 42.60 14 0 0 0 40.73 15 0 0 0 42.80 16 0 0 0 43.02 17 -1 0 -1 23.30
使用软件JMP11对试验数据进行多元回归分析，得到二次多项响应面回归模型：Y=42.42-0.0625A+2.49B+1.78C+0.35AB+1.83AC+0.1750BC-8.46A2-11.41B2-9.53C2。
对响应面试验得到的结果进行方差分析和显著性检验，结果见表3。
表3 方差分析及显著性检验
Table 3 ANOVA and significance test
注：** 表示影响极显著，P＜0.01；* 表示影响显著，P＜0.05。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 1 462.82 9 162.54 93.72 ＜0.000 1 **A 0.03 1 0.03 0.02 0.89 B 49.50 1 49.50 28.54 0.001 1 **C 25.20 1 25.20 14.53 0.006 6 **AB 0.49 1 0.49 0.28 0.61 AC 13.32 1 13.32 7.68 0.03 *BC 0.12 1 0.12 0.07 0.798 1 A2 301.35 1 301.35 173.76 ＜0.000 1 **B2 548.16 1 548.16 316.06 ＜0.000 1 **C2 382.81 1 382.81 220.72 ＜0.000 1 **残差 12.14 7 1.73失拟项 8.33 3 2.78 2.92 0.163 9纯误差 3.81 4 0.95总误差 1 474.96 16
分析表3可知，响应面回归模型的F值为93.72，达到极显著水平（P＜0.000 1），表明该模型显著；由F值大小得知，各因素对β-葡聚糖得率的影响大小顺序为接种量（B）＞发酵时间（C）＞发酵温度（A），其中接种量（B）和发酵时间（C）为极显著因素；交互项中AC为显著因素（P＜0.05），二次项中 A2、B2、C2为极显著因素（P＜0.01），说明以上显著因素和极显著因素与β-葡聚糖得率之间存在明显的数学关系；失拟项不显著（P=0.163 9＞0.05），相关系数R2=0.991 8，校正系数R2adj=0.981 2，表明该模型拟合效果良好，98.12%的β-葡聚糖得率变化值可通过该模型解释，能较好地反映试验中3个影响因素与响应值的变化情况；变异系数为4.61%＜15.00%，信噪比为24.78%＞4%，表明该模型试验误差小、可靠性高。
2.3.2 响应面交互作用分析
为探究双因素交互作用对β-葡聚糖得率的影响，利用Design-Expert 13软件对试验数据进行交互作用分析。先固定3个因素中的1个因素在零水平，再分析另外两个因素的交互作用，若响应曲面坡度越陡峭，说明因素影响越大，反之影响越小。
当发酵时间固定时，发酵温度和接种量相互作用见图6。
图6 发酵温度与接种量的交互作用
Fig.6 Interaction between fermentation temperature and inoculum
由图6可知，发酵时间固定时，发酵温度和接种量相互作用获得的响应面图较为平缓，说明发酵温度与接种量间的相互作用变化对β-葡聚糖得率的影响不显著，并且该结果与方差分析结果一致。
当接种量固定时，发酵时间和发酵温度相互作用见图7。
图7 发酵温度与发酵时间的交互作用
Fig.7 Interaction between fermentation temperature and fermentation time
由图7可知，在接种量一定时，发酵时间和发酵温度相互作用获得的响应面图较为陡峭，说明发酵时间与发酵温度的相互作用变化对β-葡聚糖得率的影响显著，并且该结果与方差分析结果一致。
当发酵温度固定时，发酵时间和接种量相互作用见图8。
图8 接种量与发酵时间的交互作用
Fig.8 Interaction between inoculum and fermentation time
由图8可知，在发酵温度一定时，发酵时间与接种量之间的相互作用获得的响应面图较为平缓，说明发酵时间与接种量间的相互作用变化对β-葡聚糖得率的影响不显著，并且该结果与方差分析结果一致。
2.4 验证试验
将4.5 g的青稞按照料液比1∶12（g/mL）制成青稞液，采用复配比为高活性干酵母∶酿酒干酵母∶嗜热链球菌 2∶1∶1（质量比）的复合菌种为发酵剂，以青稞 β-葡聚糖得率为指标，经过Design-Expert 13软件优化处理后，得到最佳发酵工艺：接种量5%、发酵温度34℃，发酵时间26 h，在此条件下β-葡聚糖得率为（42.80±0.17）%，试验值与预测值（42.43%）相近，说明建立的模型可靠。
2.5 青稞β-葡聚糖体外抗氧化活性分析
2.5.1 青稞β-葡聚糖对DPPH自由基的清除作用
DPPH自由基是以氮原子为中心的自由基，能在短时间内测定物质的抗氧化能力[29]。以VC为对照，不同浓度青稞β-葡聚糖和VC的DPPH自由基清除率如图9所示。
图9 青稞β-葡聚糖对DPPH自由基的清除能力
Fig.9 DPPH-scavenging ability of β-glucan from highland barley
由图9可知，青稞β-葡聚糖和VC对DPPH自由基的清除率随着浓度的增大而增大，且VC的清除作用大于β-葡聚糖的清除作用，当浓度达到1.0 mg/mL时，VC和青稞β-葡聚糖对DPPH自由基的清除率分别为（93.79±0.12）%、（58.62±0.10）%，VC的 DPPH 自由基清除率是青稞β-葡聚糖的1.6倍。由此说明，经发酵富集的青稞β-葡聚糖具有一定的DPPH自由基清除能力。
2.5.2 青稞β-葡聚糖对ABTS＋自由基的清除作用
不同浓度青稞β-葡聚糖和VC的ABTS＋自由基清除率如图10所示。
图10 青稞β-葡聚糖对ABTS＋自由基的清除能力
Fig.10 ABTS+-scavenging ability of β-glucan from highland barley
由图10可知，青稞β-葡聚糖和VC对ABTS＋自由基的清除率随着浓度的增大而增大，且VC的清除作用一直大于青稞β-葡聚糖的清除作用，当浓度达到1.0mg/mL，VC和青稞β-葡聚糖对ABTS＋自由基的清除率分别（96.59±0.11）%、（68.06±0.07）%。即 VC的 ABTS＋自由基清除率是青稞β-葡聚糖ABTS＋自由基清除率的1.42倍。
3 结论
采用不同微生物发酵富集青稞β-葡聚糖，对其最佳富集工艺进行研究，以VC为对照，研究青稞β-葡聚糖的抗氧化能力。结果表明，在料液比为1∶12（g/mL）的青稞发酵液中按照复配质量比为2∶1∶1（高活性干酵母∶酿酒干酵母∶嗜热链球菌）接种青稞质量分数5%的菌种，于34℃发酵26h；在此条件下富集的β-葡聚糖得率可达到42.80%，与富集前相比提高了63.01%，差异显著（P＜0.05）。同时相较于单一发酵剂，复合发酵剂在适宜的发酵时间、发酵温度、接种量、复配比下更能富集β-葡聚糖，提高β-葡聚糖得率。当浓度达到1.0 mg/mL时，青稞β-葡聚糖的DPPH自由基、ABTS＋自由基清除率分别为（58.62±0.10）%和（68.06±0.07）%。综上表明，可以通过发酵法富集青稞中的β-葡聚糖，使青稞β-葡聚糖具备良好的抗氧化能力，有较好的应用前景。
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