人参，为五加科植物人参的干燥根，具有抗肿瘤[1]、降血糖[2]、提高免疫力[3]、抗炎[4]等多种活性，最具药理活性的成分是人参皂苷[5]，其中人参皂苷Rg3、Rb1、Rh2等具有抗肿瘤活性。黑参是人参的新炮制品，在传统方法中，黑参是通过九蒸九晒制成的。调查者明确指出，加工后的生晒参不仅色泽改变，而且有效成分及药理作用也发生了变化，主要是在制备过程中形成了稀有皂苷，因此黑参有更强的生物活性[6]。除此之外，黑参还有抗氧化[7]、调节心血管功能[8]等作用。因此黑参的发展潜力很大。
胃癌是世界第四大癌症。早期胃癌由于症状不明显而被患者忽视，所以绝大多数患者到胃癌中晚期才被确诊且五年生存率很低[9]。幽门螺杆菌感染、饮食、烟酒是胃癌发病的主导因素[10]。由于其他治疗方法对人体的副作用大，所以急需研究对人体伤害低、副作用小的抗癌天然药物。
细胞凋亡途径有两种：外源型和内源型途径。前者是通过线粒体膜电位的降低，Cyt-C释放到细胞质中，活化半胱氨酸蛋白酶Caspase-3，最终导致细胞凋亡[11]。后者是通过刺激关键跨膜死亡受体家族成员（如Fas蛋白），进一步激活起始蛋白Caspase-8和执行者蛋白Caspase-3，最终导致凋亡级联反应[12]。研究表明一些化疗药物可以同时引起细胞外源性和内源性凋亡[13]。Wu等[14]研究发现人参皂苷Rh4能调节Cdk4和Cyclin D1的表达，使SW480细胞停滞在G0/G1期，并通过改变Caspase-3，8，9的表达促进细胞的凋亡。另外，对大鼠的主要器官进行HE染色，结果显示，Rh4对大鼠的器官无明显损害。
人参皂苷具有多种生物活性，且稀有皂苷在自然界的含量很少，只能通过不同的制备方法或者转化方法获得，具有极高的利用价值。因此，本研究以生晒参为原料制备黑参，提取黑参皂苷，并进行纯化，研究其对MGC-803细胞凋亡的影响，旨在探究黑参皂苷的抗肿瘤作用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
生晒参：北京同仁堂国药有限公司，参龄5年，大小一致；MGC-803、HepG2、J82、SPC-A1 细胞：北京协和细胞库；DMEM培养基：美国英杰生命技术有限公司；凋亡试剂盒、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、异硫氰酸荧光黄（Annexin-V-FITC）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）、聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）、Tris-HCl缓冲盐溶液 （TBS）、吐温 20（Tween20）、ECL Plus发光剂：北京索莱宝生物科技有限公司；血清：上海李记生物科技有限公司；Bax、Cyt-C、Caspase-3、Caspase-9、BCl-2：武汉三鹰生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
液相色谱-质谱联用仪（LC-30-SCIEX5600+）：岛津（上海）实验器材有限公司；流式细胞仪（BD FACSCaliber）：美国 BD 公司；电泳仪（164-5050）：美国伯乐公司；酶标仪（Synergy HTX）：美国伯腾仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 黑参的制备
黑参制备工艺流程：生晒参→100℃蒸制5 h→100℃～102℃蒸制4 h→103℃～105℃蒸制4 h→106℃～108℃蒸 3 h→50℃取出→（50±2）℃干燥至水分含量＜12%。
1.3.2 黑参皂苷的提取及纯化
1.3.2.1 黑参皂苷的提取
采用乙醇超声辅助法提取黑参皂苷[15]，工艺流程：将黑参用粉碎机打成粉末，过80目筛，加入70%乙醇溶液，固液比 1∶40（g/mL），超声 80 min（功率 1 000 W）。离心留上清，旋转蒸发至无醇味后将溶液冻干即为黑参皂苷。
1.3.2.2 D101大孔吸附树脂纯化黑参皂苷
D101大孔树脂经预处理后使用。上样：称取黑参皂苷2 g，加一定的超纯水溶解后，用过滤器过滤去除杂质以防堵住树脂柱，然后以100 mL/h流速流穿树脂柱，多次反复上样，直至饱和吸附。洗脱：先用超纯水洗脱色素杂质，然后分别用200 mL 20%、40%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液依次冲洗吸附在树脂中的皂苷，收集至每个离心管里，旋转蒸发后冷冻干燥各组皂苷。
1.3.3 人参皂苷含量的测定
采用香草醛-硫酸比色法测定皂苷含量：准确称取一定量的人参皂苷Re标准品用甲醇溶液溶解，使浓度为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL。称取一定量的样品用甲醇溶解，使浓度为0.5 mg/mL。分别吸取标准品和样品0.5 mL加入对应试管，然后在试管中分别加入0.5 mL 8%的香草醛和5 mL 77%的硫酸，60℃下水浴20 min。同时设置空白组（蒸馏水代替样品）。酶标仪在540 nm处测得吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
1.3.4 液相色谱-质谱联用检测
1.3.4.1 液相色谱条件
色谱柱为 C18（150 mm×2.5 mm，5 μm），柱温为35℃，流速为0.3 mL/min，流动相比例见表1。
表1 流动相比例
Table 1 Mobile phases ratio
时间/min 流动相A（乙腈）/% 流动相B（水）/%0 5 95 2 5 95 4 20 80 12 15 85 14 46 54 26 100 0 28 100 0 29 5 95 30 5 95
1.3.4.2 质谱条件
采用电喷雾电离（electron spray ionization，ESI）负离子模式进行检测。ESI源条件：雾化气压（Gas 1）为50 psi（1 psi=6.895 kPa），辅助气压（Gas 2）为50 psi，气帘气（curtain gas，CUR）为 25 psi，离子源温度 450℃，离子源电压4400V，质谱扫描范围为100Da～1 200 Da，质量扫描范围为50Da～1000Da，质谱累计时间0.2 s，离子累计时间0.01 s，二级质谱采用信息依赖获取方式（information dependent acquisition，IDA）获得，并采用高分辨模式，去簇电压（declustering potential，DP）±60 V，激发碰撞电压（35±15）eV。
1.3.5 MTT法测细胞活性
将细胞置于10%胎牛血清的DMEM培养液中，37℃、5%CO2条件下标准培养。取细胞，接种于96孔板。用不同浓度（0～300 μg/mL）的皂苷培养液分别处理细胞 24、48、72 h，处理后分别加入 50 μL MTT 继续培养4 h，轻轻吸去上清150 μL，每孔再加入150 μL DMSO溶液，摇床振荡15 min，酶标仪490 nm处测得OD值。
1.3.6 Hoechst 33258染色检测黑参皂苷对MGC-803细胞的细胞核形态变化
将状态良好的细胞接种于6孔板，并用不同浓度（100、150、200 μg/mL）黑参皂苷和对照组（未加黑参皂苷）处理细胞24 h。将每孔漂浮细胞转移至对应离心管，其余贴壁细胞加入0.5 mL胰酶消化，等待细胞变圆后加1 mL培养液终止消化，移入对应的离心管，在1 200 r/min速度下离心5 min。细胞沉淀用Hoechst 33258染液重新悬浮，37℃，避光30 min，倒置荧光显微镜进行拍摄[16]。
1.3.7 Annexin V-FITC/PI双染测定黑参皂苷诱导MGC-803细胞凋亡
处理细胞及收集细胞步骤见1.3.6。向细胞沉淀加入缓冲液500 μL，Annexin V-FITC染色液和PI溶液各5 μL。混合避光15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。
1.3.8 黑参皂苷对胃癌MGC-803细胞线粒体膜电位的影响
处理细胞及收集细胞步骤见1.3.6。向细胞沉淀加入50 μL罗丹明123溶液，37℃30 min，生理盐水洗3次后流式细胞仪检测线粒体膜电位水平。
1.3.9 黑参皂苷对胃癌MGC-803细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的影响
处理细胞及收集细胞步骤见1.3.6。向细胞沉淀加入2 mL 2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯（2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）20 min。每隔 5 min混匀1次，使其混合更加充分。最后用生理盐水洗3次后流式细胞仪检测细胞的ROS水平。
1.3.10 Western Blot检测MGC-803细胞凋亡蛋白的表达
处理细胞及收集细胞步骤见1.3.6。收集细胞后加入细胞裂解液提取细胞蛋白，与上样缓冲液混合后煮沸5 min使其变性，然后存放于-80℃冰箱。用12%的分离胶分离蛋白后转印在PVDF膜上，并把膜放入含有5%封闭液的孵育盒中封闭2 h。然后分别加入一抗（Bax、Bcl-2、Cyt-C、Caspase-3、Caspase-9）4 ℃过夜，1×TBST（TBS+Tween20）冲洗 15 min，共两次。二抗孵育（稀释比例 1∶5 000）2 h，用 1×TBST 缓冲液洗涤膜3次，每次洗10 min，最后将膜置于ECL Plus发光剂中显影定影。拍照后分析计算相对灰度值。
1.4 数据分析
结果以平均值±标准差的形式表示，用GraphPad Prism进行显著性分析和误差分析，若p＜0.05则代表具有显著性，用Prism8.0.2作图。
2 结果与分析
2.1 黑参皂苷纯化前后的含量对比
人参皂苷Re标准曲线如图1所示。
图1 人参皂苷Re标准曲线
Fig.1 Standard curve of ginsenoside Re
由图1可知，纯化前的皂苷含量为52.43%，推测是由于用70%乙醇提取皂苷，使提取物中含有色素、少部分多糖、脂溶性杂质等成分，影响了黑参皂苷的纯度。为了提高皂苷的含量，在对比其他型号的树脂后，选用D101大孔树脂进行纯化，不同浓度乙醇洗脱液中皂苷含量见图2。
图2 各洗脱液黑参皂苷含量
Fig.2 Content of black ginseng saponins in each eluent
由图 2可知，20%、40%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇洗脱液中黑参皂苷含量分别为13.66%、20.1%、54.76%、74.56%、93.55%、39.87%和30.98%。开始洗脱时（乙醇浓度20%～60%），因色素、多糖等杂质的存在，皂苷含量较少；随着乙醇梯度洗脱（乙醇浓度70%～80%），杂质被洗脱，含量逐渐减少，皂苷含量随之升高；当乙醇浓度达到90%～100%时，树脂吸附的皂苷已洗脱完全，含量逐渐降低。最后将70%～80%这一阶段的洗脱液混合、旋蒸、冻干，并检测其皂苷含量为89.02%。相对于纯化前皂苷含量52.43%，纯化后的含量提升了36.59%。D101大孔树脂具有无毒无害、高解吸率、快速等特点，对提取和纯化黑参皂苷有良好的效果。
2.2 黑参和人参皂苷的化学成分
LC-MS能快速、精确地测定人参皂苷的主要成分。Sun等[17]检测黑参中19种人参皂苷，其中Rg6、Rk3、Rg3、Rg5等为稀有人参皂苷，有较强的抗癌活性。通过LC-MS分析并鉴定黑参和人参皂苷的化学成分，总离子流图如图3所示。
图3 黑参皂苷和人参皂苷总离子流图
Fig.3 Total ion chromatogram of black ginseng saponins and ginsenosides
（a）中 1～14 分别为人参皂苷 Rg3、Rb3、RO、Rb1、F3、Rb2、Re、F1、Rh1、Rf、Rg2、Rh2、Rg5、Compound K（CK）；（b）中 1～5 分别为 RO、Re、Rb2、F1、Rf。
通过高分辨质谱保留时间和多级碎片离子的分析，初步推断出黑参皂苷中含有14种人参皂苷类成分，分别为 Rg3、Rb3、Ro、Rb1、F3、Rb2、Re、F1、Rh1、Rf、Rg2、Rh2、Rg5、CK，而人参皂苷中含有 5 种，分别为 RO、Re、Rb2、F1、Rf，具体质谱数据见表 2 和表 3。
表2 黑参皂苷质谱数据
Table 2 Mass spectrometry data of black ginseng saponins
序号 物质名称保留时间/min 分子式 分子量精确 峰面积 峰高 碎片离子1 Rg3 15.02 C42H72O13 829.49 724 957.00 322 208.37 621，459 2 Rb3 15.44 C53H90O221 077.58 3 001 469.62 1 626 861.44 459 3 RO 15.77 C48H76O19 955.49 2 847 757.75 1 584 625.81 945，783，621，459 4 Rb1 15.98 C54H92O231 107.60 45 203 543.24 2 030 318.75 945，783 5 F3 16.93 C41H70O13 769.47 2 749 647.07 941 076.12 637，475 6 Rb2 17.41 C53H90O221 123.59 2 865 996.43 1 697 723.00 945，783，915 7 Re 17.82 C48H82O18 991.55 48 872 911.62 2 187 715.06 783，637，475 8 F1 18.06 C36H62O9 683.43 57 898 802.50 2 910 590.69 475 9 Rh1 18.34 C36H62O9 683.44 3 933 499.00 203 262.45 475 10 Rf 19.63 C42H72O14 845.49 2 991 620.68 954 051.12 637，475 11 Rg2 19.81 C42H72O13 783.48 8 512 912.37 1 855 831.06 637，475 12 Rh2 20.22 C36H62O8 667.44 2 092 453.67 1 110 407.06 459 13 Rg5 20.77 C42H70O12 765.48 7 684 614.18 1 514 382.25 475 14 CK 25.57 C36H62O8 667.44 3 172 638.25 1 281 381.13 459
表3 人参皂苷质谱数据
Table 3 Mass spectrometry data of ginsenosides
序号 物质名称保留时间/min 分子式 分子量精确 峰面积 峰高 碎片离子1 RO 5.25 C48H76O19 955.49 80 273.83 7 936.37 945，783，621，459 2 Re 6.98 C48H82O18 991.55 337 916.74 35 623.37 783，637，475 3 Rb2 8.53 C53H90O221 123.59 129 837.84 15 294.74 945，783，915 4 F1 9.13 C36H62O9 683.43 983 745.59 90 848.67 475 5 Rf 10.58 C42H72O14 845.49 141 947.84 15 364.46 637，475
由表2和表3可知，二者的不同之处在于黑参皂苷比人参皂苷多 9 种皂苷，如：Rg3、Rh1、Rh2、Rg5、CK等，其中Rg3和Rg5是稀有皂苷。推测是由于高温条件下制备黑参时，可能发生了以下反应。
1）C-20位糖苷键发生水解反应
含糖基较多的原生皂苷变为次生皂苷，优先脱去原人参二醇或原三醇型皂苷C-20位的糖基，如：蒸制干燥过程中人参皂苷Re在C-20位脱去一分子葡萄糖，转化为Rg2。人参皂苷Re在C-6位末端脱去一分子鼠李糖，转化为Rg1，Rg1在C-20位脱去一分子葡萄糖化为Rh1。二醇组皂苷C-20位上的糖链全部脱掉，C-3位糖链末端被水解，一部分生成Rg3，Rg3进一步发生水解反应生成Rh2[18]。人参皂苷Rb1在C-20位末端脱去一分子葡萄糖，转化为人参皂苷Rd，人参皂苷Rd在C-20位末端脱去一分子葡萄糖，转化为Rg3[19]。
2）羟基脱水反应
苷元的C-12和C-20位羟基脱水生成双键结构[20]。如：Rg3在C-20位羟基脱水缩合形成双键生成Rg5。
3）丙二酸单酰基脱去反应
人参皂苷在高温条件下会水解脱去丙二酸。生晒参中的丙二酸单酰基人参皂苷受热发生水解反应，生成了相应的人参皂苷 Rc、Rd、Rb1、Rb2。
这些反应使得原级皂苷转化为稀有皂苷。稀有皂苷在自然界中含量较少，具有独特的使用价值，稀有皂苷可能使黑参有更强的生物活性。
2.3 黑参皂苷对细胞增殖的抑制情况
采用MTT法对黑参皂苷进行体外抗肿瘤活性实验，测定其对 MGC-803、HepG2、J82、SPC-A1 细胞 24 h的抑制率，比较黑参皂苷对4种癌细胞的活性。结果如表4所示。
表4 黑参皂苷对4种癌细胞的IC50值
Table 4 IC50 of black ginseng saponins against four kinds of cancer cells μg/mL
MGC-803 HepG2 J82 SPC-A1 141.25±0.05 168.45±0.08 154.89±0.05 198.35±0.08
由表4可知，黑参皂苷对4种癌细胞的IC50值不同，其中，对胃癌MGC-803细胞的IC50最小，说明对此细胞的抑制作用最明显。所以决定使用胃癌MGC-803细胞进行后续试验，研究凋亡机制。人参皂苷（a）与黑参皂苷（b）对MGC-803细胞活性的影响见图4。
图4 人参皂苷与黑参皂苷对MGC-803细胞活性的影响
Fig.4 Effect of ginsenosides and black ginseng saponins on viability of MGC-803 cells
由图4可知，人参皂苷和黑参皂苷对MGC-803细胞均有抑制作用，细胞存活率随剂量的提升呈下降趋势，且各个浓度在给药24、48、72 h后的细胞存活率均随时间延长而逐渐下降。人参皂苷24 h的IC50为 296.64 μg/mL，48 h 的 IC50为 266.46 μg/mL，72 h的IC50为188.40 μg/mL；而黑参皂苷 24 h的IC50为141.25 μg/mL，48 h 的 IC50为 120.23 μg/mL，72 h 的 IC50为95.50 μg/mL。以上结果表明黑参皂苷对MGC-803细胞具有更强的抑制作用。抑制率均具有时间-剂量依赖性，并呈现出时间-剂量关系。
2.4 Hoechst 33258染色观察黑参皂苷对MGC-803细胞核变化情况
Hoechst 33258是一种蓝色荧光染液，它能穿过细胞膜，在凋亡细胞的细胞核呈致密浓染[21]。
由图5可知，对照组细胞呈现淡蓝色荧光，染色质在核仁内分布均匀。当用黑参皂苷处理胃癌MGC-803细胞时，由于染色质聚集和细胞核固缩，分裂成很多的核碎片，所以细胞发出亮蓝色荧光[22]。并且随着黑参皂苷浓度的增加，亮蓝色荧光也随之增强。经150 μg/mL和200 μg/mL黑参皂苷处理的细胞亮蓝色荧光强度高于其余处理组。Hoechst 33258染色结果代表着黑参皂苷诱导胃癌MGC-803细胞核发生改变，呈现典型的细胞凋亡现象。
图5 Hoechst 33258染色荧光显微镜拍照（400倍）
Fig.5 Nuclei of MGC-803 under fluorescence microscope（400 ×）（Hoechst 33258 staining）
2.5 Annexin V/PI双染检测细胞凋亡情况
黑参皂苷对胃癌MGC-803细胞凋亡的影响见图6。
图6 黑参皂苷对胃癌MGC-803细胞凋亡的影响
Fig.6 Effect of black ginseng saponins on apoptosis of gastric cancer MGC-803 cells
a.对照；b.100 μg/mL；c.150 μg/mL；d.200 μg/mL；e.细胞凋亡统计。***表示差异高度显著，p＜0.001。
如图6所示，随着黑参皂苷浓度的增加，早期、晚期凋亡的细胞明显增多，说明黑参皂苷对MGC-803细胞有凋亡影响。早期凋亡由0.02%增长到12.7%，晚期凋亡由0.21%增长到54.26%，总凋亡率由0.23%增长到66.96%（p＜0.001）。这一结果与唐立等[23]研究人参皂苷对SNU-1细胞有凋亡作用的结论一致。证明了在黑参皂苷作用下，MGC-803细胞发生凋亡的事实。
2.6 黑参皂苷通过降低线粒体膜电位促使细胞凋亡
线粒体膜电位的变化反映了线粒体的功能，与细胞凋亡有重要联系，是细胞凋亡过程中最早的一种不可逆的变化，发生比DNA断裂更早。这种改变可以导致细胞膜的渗透，并导致Cyt-C的释放[24]。罗丹明123（rhodamine 123，Rh123）的荧光强度代表着线粒体膜电位的改变，并与染色的荧光强度呈正相关[25]。黑参皂苷对胃癌MGC-803细胞线粒体膜电位的影响见图7。
图7 黑参皂苷对胃癌MGC-803细胞线粒体膜电位的影响
Fig.7 Effect of black ginseng saponins on mitochondrial membrane potential of gastric cancer MGC-803 cells
M1代表没有荧光强度的细胞；M2代表具有荧光强度的细胞。a.对照；b.100 μg/mL；c.150 μg/mL；d.200 μg/mL；e.线粒体膜电位水平比率统计。**表示差异极显著p＜0.01；***表示差异高度显著，p＜0.001。
Rh123的变化代表细胞凋亡的程度。赵嘉琪等[25]研究表明，人参皂苷CK能使肝癌细胞的线粒体膜电位降低。由图7可知，与对照组相比，Rh123的强荧光细胞比例从97.04%下降到23.45%（p＜0.001），随黑参皂苷剂量的增大而降低。说明细胞与Rh123的结合能力降低，即线粒体膜电位下降，是一种不可逆的变化，这表明细胞已经发生凋亡，细胞凋亡的比例也随黑参皂苷浓度升高，进一步证实了黑参皂苷对胃癌MGC-803细胞的影响是通过线粒体途径促使细胞凋亡。
2.7 黑参皂苷通过ROS途径诱导MGC-803细胞凋亡
ROS在肿瘤发展中具有重要的调节作用，ROS能增加线粒体膜的通透性使其氧化损伤，导致细胞凋亡[26]。因此，活性氧水平在细胞凋亡过程中也起着重要作用。
李曼玲等[27]研究表明，人参皂苷Rg3能通过ROS途径诱导细胞凋亡。为了研究MGC-803细胞凋亡是否和ROS有关，进行了ROS实验。活性氧荧光探针（DCFHDA）可被标记在细胞内，随着浓度升高，凋亡细胞增加。黑参皂苷对胃癌MGC-803细胞ROS水平的影响见图8。
图8 黑参皂苷对胃癌MGC-803细胞ROS水平的影响
Fig.8 Effect of black ginseng saponins on ROS level in gastric cancer MGC-803 cells
M1为没有荧光强度的细胞；M2为具有荧光强度的细胞。a.对照；b.100 μg/mL；c.150 μg/mL；d.200 μg/mL；e.ROS 水平比率统计。*** 表示差异高度显著，p＜0.001。
由图8可知，随着黑参皂苷剂量的增加，峰明显向右平移，表明荧光探针的荧光强度逐步升高，黑参皂苷浓度为200 μg/mL时，ROS水平为74.65%，与对照组相比呈明显上升趋势（p＜0.001）。说明当细胞不能有效地除去产生的ROS，就会导致细胞膜脂质过氧化。细胞膜被破坏，线粒体膜通透性增加，导致了线粒体功能受损，从而引起凋亡。这与李曼玲等[27]研究结果一致，DCFH-DA染色实验再次证明了黑参皂苷可以诱导胃癌MGC-803细胞中生成大量ROS并在细胞内累积，导致细胞损伤从而诱导细胞凋亡。
2.8 黑参皂苷通过改变相关凋亡蛋白表达促使MGC-803细胞凋亡
细胞凋亡是由多种蛋白紧密调控的。Bcl-2是一种可以调节细胞凋亡和保持线粒体膜完整的抗凋亡基因，可防止细胞凋亡[28-29]，Bax则可促进细胞凋亡[30]。因此，当细胞开始凋亡时，不同的细胞凋亡蛋白可以转移到线粒体中，造成细胞膜通透性的下降。线粒体膜对H+的渗透作用增强，使线粒体膜电位下降[30]。进而使Cyt-C释放，引发Caspase家族级联反应，最终凋亡。Caspase家族分为3类：凋亡起始、凋亡效应[31]和炎症Caspase[32]，其中凋亡起始和效应是通过起始Caspase激活下游效应Caspase引发凋亡。Caspase-3是凋亡执行中最关键的一环，其主要依靠Cyt-C的释放。实验测定了 Bcl-2、Bax、Cyt-C、Caspase-3、Caspase-9 蛋白的表达，结果见图9。
图9 黑参皂苷对MGC-803细胞相关凋亡蛋白表达的影响
Fig.9 Effect of black ginseng saponins on the expression of apoptosis-related proteins in MGC-803 cells
* 代表差异显著，p＜0.05；*** 代表差异高度显著，p＜0.001。
如图9所示，经Image J软件分析得知：与β-actin相比，Bax、Cyt-C、Caspase-3、Caspase-9 表达量增加，Bcl-2的表达量减少。说明在一定浓度下，黑参皂苷能显著提高Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3和Bax蛋白的表达量，并降低Bcl-2的表达量。
已有文献证明人参皂苷可通过线粒体途径使癌细胞发生凋亡，如熊明华[33]证实了人参皂苷Rg3能降低Bcl-2的表达量，促进Bax的表达，从而诱导Hela细胞发生凋亡。Wang等[34]结果表明：人参皂苷CK对膀胱肿瘤T24细胞有显著的抑制作用，经CK处理后的细胞Bcl-2表达量降低，而Bax、Procaspase-3和Procaspase-9表达量提高。Gu等[35]研究发现人参皂苷Rd能促进人胶质瘤U251细胞凋亡，其机制是通过下调Bcl-2的表达量以及上调Caspase-3的表达量使细胞凋亡。
因此推断黑参皂苷作用于胃癌MGC-803细胞时，Bax转移至线粒体中，造成线粒体膜的通透性下降，从而使H+的渗透作用增强，线粒体膜电位下降、Cyt-C释放，进而引发Caspase-3和Caspase-9级联反应，通过内源性细胞凋亡途径诱导胃癌MGC-803发生凋亡。
3 结论
将生晒参在高温高湿条件下制成黑参，采用乙醇超声辅助法提取、D101大孔树脂纯化皂苷，利用LCMS对人参和黑参中的皂苷类成分进行了比较，发现黑参中含有14种单体皂苷，而人参中含有5种。人参不含 Rg3、Rh1、Rh2、Rg5、CK 等单体皂苷。可能是由于在制备黑参的过程中普通皂苷在高温高湿的条件下发生糖苷键水解、羟基脱水等反应转化为稀有皂苷。黑参皂苷对胃癌MGC-803细胞的抑制作用比人参皂苷更强，其凋亡机制是通过Bax、Bcl-2蛋白表达的改变进而导致线粒体膜电位变低，释放Cyt-C，活化半胱氨酸蛋白酶家族成员细胞Caspase-9及凋亡执行蛋白酶Caspase-3，从而诱导细胞凋亡。有助于黑参的进一步开发与利用，为人参产业发展作出贡献。
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